許曉輝

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

吳興強

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院

張虹艷

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

李晨曦

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

潘秀麗

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

王小喬＊

蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

氯霉素對多種病原菌有較強的抑制作用，可用于動物各類傳染性疾病的治療，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，但同時也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血，白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏，新生兒、早產(chǎn)兒灰嬰綜合征等，低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性，因此水產(chǎn)品中殘留的氯霉素對人類健康構(gòu)成了巨大威脅[1-3]。我國禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用氯霉素，2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單，規(guī)定在食品動物中不得檢出氯霉素[4]。目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 20756-2006）和《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》（GB/T 22338-2008）是水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測的主要標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，然而，上述標(biāo)準(zhǔn)前處理方法繁瑣，費時費力，難以適應(yīng)水產(chǎn)品中氯霉素高通量快速篩查。因此，本研究將操作步驟進(jìn)行優(yōu)化，采取QuEChERS-固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中的氯霉素，該法可提高分析效率，并且能夠達(dá)到規(guī)定的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀6460：配有電噴霧離子源及MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；分析天平：感量0.1 mg和0.01 g（瑞士梅特勒-托利多公司）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；容量瓶（天津市天玻玻璃儀器有限公司）；真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；渦旋混合器（美國Scientific公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；移液器：20 μl、100 μl、1 ml（德國Eppendorf公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，東京化成工業(yè)株式會社）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；超純水（美國Millipore公司）；丙酮（分析純，白銀良友化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（色譜純，德國Merck公司）；LC-Si小柱（500 mg/3 ml，美國Supelco公司）； NaCl（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）; Na2SO4（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

對照品氯霉素（批號：G129945，純度：99.2%）、氯霉素-D5（批號：H409107AL，純 度：100.0%）購 自Dr.Ehrenstorfer GmbH，樣品為市場購買的魚肉及購買于中國檢驗檢疫科學(xué)研究院的氯霉素魚肉質(zhì)控樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120EC-C18柱（2.7μm，3.0×100 mm）；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：2μl，流速：0.4 ml/min。流動相A為含5 mmol/L乙酸銨的水溶液，流動相B為乙腈，流動相的比例為體積百分比，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：負(fù)離子電噴霧電離模式；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；噴霧電壓：500 V；霧化氣：N2；氣流溫度：325 ℃；干燥氣流速：8 L/min；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3500 V；MRM模式定性定量分析氯霉素的離子對、碎裂電壓、碰撞能量等見表2。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液制備

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取氯霉素對照品11.66 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 1.157 mg/ml的儲備液，置 4 ℃冷藏備用。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 ml至100 ml棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 11.57 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，置 4 ℃冷藏備用。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.25 ml置于50 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 57.85 ng/ml的使用溶液，置 4 ℃冷藏備用。

氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)儲備溶液：準(zhǔn)確移取濃度為100μg/ml氯霉素-D5對照品1 ml，置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為10μg/ml的儲備液，置 4 ℃冷藏備用。氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用溶液：準(zhǔn)確吸取上述內(nèi)標(biāo)儲備溶液0.5 ml置于10 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為 500 ng/ml的使用溶液，置 4 ℃冷藏備用。

1.4.2 供試品溶液制備

提取：準(zhǔn)確稱取樣品5 g于50 ml離心管中，加入氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用溶液50 μl，再加入3 ml EDTA緩沖液和陶瓷均質(zhì)子，渦旋1 min，準(zhǔn)確加入10 ml乙腈，渦旋1 min，超聲提取5 min，加入1 g NaCl和4g Na2SO4，充分渦旋2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液待凈化。

凈化：用5 ml丙酮-正己烷（1+9，體積比）淋洗LC-Si小柱，棄去淋洗液，精密移取1.00 ml上述上清液到LC-Si小柱，棄去流出液，用5 ml丙酮-正己烷（6+4，體積比）洗脫，收集洗脫液于平行蒸發(fā)儀試管中，40 ℃蒸發(fā)至干，用1 ml乙腈-水（2+8，體積比）定容，定溶液過0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，上液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

魚肉樣品中蛋白質(zhì)和脂類含量高，是提取凈化過程中的主要干擾組分，因此必須采取適宜的提取凈化方法去除干擾組分，而氯霉素易溶于甲醇、乙腈、丙酮。因此，本研究采用QuEChERS鹽包法提取被測化合物，樣品中加3 ml EDTA緩沖液進(jìn)行活化，選擇乙腈作為提取溶劑，NaCl和Na2SO4作為鹽析劑與脫水劑，一方面促進(jìn)鹽析，另一方面促使水相和有機相分層。經(jīng)過以上步驟粗去除蛋白質(zhì)、脂溶性成份及其他成份，然后以正相萃取柱LC-Si小柱凈化粗提取溶液，被分析物氯霉素不被吸附先流出，要除雜的雜質(zhì)則被吸附在硅膠上，此提取凈化過程簡單、便捷。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

色譜條件的選擇與優(yōu)化：氯霉素為極性化合物，液相色譜檢測極性化合物時，分離常用的色譜柱有C18，本研究采用適合極性化合物分離的Poroshell 120 EC-C18色譜柱，選擇流速為0.4 ml/min，使柱壓達(dá)到適宜的數(shù)值，有利于提升化合物的分離和改善峰型。流動相的選擇與優(yōu)化：本研究采用負(fù)離子掃描模式，故在水相中加適量的乙酸銨以提高離子化效率，采用含5 mmol/L乙酸銨的水溶液和乙腈為流動相。

質(zhì)譜條件的優(yōu)化：不接色譜柱，用二通閥代替色譜柱，將氯霉素與氯霉素-D5儲備液稀釋至適宜濃度，分別上機進(jìn)樣分析。在負(fù)離子檢測模式下進(jìn)行全掃描，得到分析離子質(zhì)量數(shù)，其次對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行選擇離子掃描，優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓，得到最佳碎裂電壓，接著使用優(yōu)化好的碎裂電壓對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描，得到碎片離子信息，根據(jù)得到碎片離子的豐度選擇被測化合物的定性和定量離子對，最后進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測掃描，使用優(yōu)化好的碎裂電壓及確定的定性定量離子對，優(yōu)化定性定量離子對的最佳碰撞能量。然后，把質(zhì)譜與液相色譜連接，確定氯霉素出峰位置后進(jìn)行電噴霧電壓、離子源溫度、輔助氣流速、霧化氣等優(yōu)化，使氯霉素分子離子與碎片離子的離子強度達(dá)到最佳，最終確定為本研究的質(zhì)譜條件。

2.3 方法學(xué)考察

取空白樣品魚肉按照“1.4.2”方法制成空白樣品基質(zhì)溶液，用上述空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線點，在最佳色譜-質(zhì)譜條件下測定，以氯霉素的定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線點溶液為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，氯霉素在0.2893 ～11.57 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.99詳見表3。

表3 氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

取陰性魚肉樣品，標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過最小添加量，按照“1.4.2”方法同法處理后上機進(jìn)樣，以3 倍信噪比計算氯霉素的檢測限（limit of detection,LOD）。向陰性樣品中添加低、中、高三個水平的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每個添加水平平行制備3份樣品，按照“1.4.2”進(jìn)行前處理，上機測試，每份樣品重復(fù)測定3次，做加標(biāo)回收實驗。取同一質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定氯霉素峰響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD )（%），計 算精密度。結(jié)果顯示，檢測限為0.1μg/kg，3個添加水平的平均回收率在100.7%～114.5%之間，精密度為1.65%，詳見表4。

表4 氯霉素的檢測限、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

2.4 實際樣品測定

將氯霉素魚肉質(zhì)控樣按“1.4.2”方法前處理后，上機測試，內(nèi)標(biāo)法定量，測得濃度與標(biāo)示濃度值一致，得到MRM離子流圖如圖1所示。

圖1 氯霉素魚肉質(zhì)控樣MRM離子流圖

3 結(jié)論

水產(chǎn)品中氯霉素的檢測，蛋白質(zhì)及脂肪的去除是整個分析過程中的關(guān)鍵點。本研究建立了QuEChERS-SPE-UPLCMS/MS測定水產(chǎn)品中氯霉素的分析方法，并將該方法應(yīng)用于實際樣品的檢測。通過對水產(chǎn)品樣品鹽包粗去除蛋白及脂肪等雜質(zhì)，再經(jīng)LC-Si小柱細(xì)凈化去除提取液中殘存的雜質(zhì)，凈化后的樣品溶液在0℃靜置，均無脂類析出，保持澄清透明，且回收率高。說明本法操作簡便、凈化效果好，能夠有效消除樣品中基質(zhì)影響，極大提高檢測的準(zhǔn)確度、靈敏度、重現(xiàn)性，并可有效降低假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)概率，可為市場監(jiān)管部門快速高效篩查水產(chǎn)品中氯霉素提供技術(shù)支撐。

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