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        QuEChERS-SPE-UPLCMS/MS法快速測定水產(chǎn)品中氯霉素

        2022-03-29 06:10:26許曉輝
        中國食品藥品監(jiān)管 2022年2期
        關(guān)鍵詞:檢測

        許曉輝

        蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

        吳興強

        中國檢驗檢疫科學(xué)研究院

        張虹艷

        蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

        李晨曦

        蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

        潘秀麗

        蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

        王小喬*

        蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院

        氯霉素對多種病原菌有較強的抑制作用,可用于動物各類傳染性疾病的治療,曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用,但同時也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用,能抑制人體骨髓造血功能,引起人類的再生障礙性貧血,白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏,新生兒、早產(chǎn)兒灰嬰綜合征等,低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性,因此水產(chǎn)品中殘留的氯霉素對人類健康構(gòu)成了巨大威脅[1-3]。我國禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用氯霉素,2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單,規(guī)定在食品動物中不得檢出氯霉素[4]。目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20756-2006)和《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》(GB/T 22338-2008)是水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測的主要標(biāo)準(zhǔn)[5-6],然而,上述標(biāo)準(zhǔn)前處理方法繁瑣,費時費力,難以適應(yīng)水產(chǎn)品中氯霉素高通量快速篩查。因此,本研究將操作步驟進(jìn)行優(yōu)化,采取QuEChERS-固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中的氯霉素,該法可提高分析效率,并且能夠達(dá)到規(guī)定的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀6460:配有電噴霧離子源及MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國安捷倫公司);分析天平:感量0.1 mg和0.01 g(瑞士梅特勒-托利多公司);超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司);容量瓶(天津市天玻玻璃儀器有限公司);真空泵(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司);渦旋混合器(美國Scientific公司);離心機(德國Eppendorf公司);移液器:20 μl、100 μl、1 ml(德國Eppendorf公司);甲酸、乙酸銨(色譜純,東京化成工業(yè)株式會社);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);超純水(美國Millipore公司);丙酮(分析純,白銀良友化學(xué)試劑有限公司);正己烷(色譜純,德國Merck公司);LC-Si小柱(500 mg/3 ml,美國Supelco公司); NaCl(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司); Na2SO4(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

        對照品氯霉素(批號:G129945,純度:99.2%)、氯霉素-D5(批號:H409107AL,純 度:100.0%)購 自Dr.Ehrenstorfer GmbH,樣品為市場購買的魚肉及購買于中國檢驗檢疫科學(xué)研究院的氯霉素魚肉質(zhì)控樣品。

        1.2 色譜條件

        色譜柱:Agilent Poroshell 120EC-C18柱(2.7μm,3.0×100 mm);柱溫:35℃,進(jìn)樣量:2μl,流速:0.4 ml/min。流動相A為含5 mmol/L乙酸銨的水溶液,流動相B為乙腈,流動相的比例為體積百分比,梯度洗脫程序如表1所示。

        表1 梯度洗脫程序

        1.3 質(zhì)譜條件

        離子源:負(fù)離子電噴霧電離模式;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM);噴霧電壓:500 V;霧化氣:N2;氣流溫度:325 ℃;干燥氣流速:8 L/min;鞘氣流速:12 L/min;鞘氣溫度:350 ℃;毛細(xì)管電壓:3500 V;MRM模式定性定量分析氯霉素的離子對、碎裂電壓、碰撞能量等見表2。

        1.4 溶液的制備

        1.4.1 對照品溶液制備

        氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:精密稱取氯霉素對照品11.66 mg,置于10 ml棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為 1.157 mg/ml的儲備液,置 4 ℃冷藏備用。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 ml至100 ml棕色容量瓶中,用乙腈稀釋定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為 11.57 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,置 4 ℃冷藏備用。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.25 ml置于50 ml棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為 57.85 ng/ml的使用溶液,置 4 ℃冷藏備用。

        氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)儲備溶液:準(zhǔn)確移取濃度為100μg/ml氯霉素-D5對照品1 ml,置于10 ml棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度均為10μg/ml的儲備液,置 4 ℃冷藏備用。氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用溶液:準(zhǔn)確吸取上述內(nèi)標(biāo)儲備溶液0.5 ml置于10 ml棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為 500 ng/ml的使用溶液,置 4 ℃冷藏備用。

        1.4.2 供試品溶液制備

        提取:準(zhǔn)確稱取樣品5 g于50 ml離心管中,加入氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用溶液50 μl,再加入3 ml EDTA緩沖液和陶瓷均質(zhì)子,渦旋1 min,準(zhǔn)確加入10 ml乙腈,渦旋1 min,超聲提取5 min,加入1 g NaCl和4g Na2SO4,充分渦旋2 min,5000 r/min離心10 min,取上清液待凈化。

        凈化:用5 ml丙酮-正己烷(1+9,體積比)淋洗LC-Si小柱,棄去淋洗液,精密移取1.00 ml上述上清液到LC-Si小柱,棄去流出液,用5 ml丙酮-正己烷(6+4,體積比)洗脫,收集洗脫液于平行蒸發(fā)儀試管中,40 ℃蒸發(fā)至干,用1 ml乙腈-水(2+8,體積比)定容,定溶液過0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶中,上液質(zhì)聯(lián)用儀測定。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

        魚肉樣品中蛋白質(zhì)和脂類含量高,是提取凈化過程中的主要干擾組分,因此必須采取適宜的提取凈化方法去除干擾組分,而氯霉素易溶于甲醇、乙腈、丙酮。因此,本研究采用QuEChERS鹽包法提取被測化合物,樣品中加3 ml EDTA緩沖液進(jìn)行活化,選擇乙腈作為提取溶劑,NaCl和Na2SO4作為鹽析劑與脫水劑,一方面促進(jìn)鹽析,另一方面促使水相和有機相分層。經(jīng)過以上步驟粗去除蛋白質(zhì)、脂溶性成份及其他成份,然后以正相萃取柱LC-Si小柱凈化粗提取溶液,被分析物氯霉素不被吸附先流出,要除雜的雜質(zhì)則被吸附在硅膠上,此提取凈化過程簡單、便捷。

        2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

        色譜條件的選擇與優(yōu)化:氯霉素為極性化合物,液相色譜檢測極性化合物時,分離常用的色譜柱有C18,本研究采用適合極性化合物分離的Poroshell 120 EC-C18色譜柱,選擇流速為0.4 ml/min,使柱壓達(dá)到適宜的數(shù)值,有利于提升化合物的分離和改善峰型。流動相的選擇與優(yōu)化:本研究采用負(fù)離子掃描模式,故在水相中加適量的乙酸銨以提高離子化效率,采用含5 mmol/L乙酸銨的水溶液和乙腈為流動相。

        質(zhì)譜條件的優(yōu)化:不接色譜柱,用二通閥代替色譜柱,將氯霉素與氯霉素-D5儲備液稀釋至適宜濃度,分別上機進(jìn)樣分析。在負(fù)離子檢測模式下進(jìn)行全掃描,得到分析離子質(zhì)量數(shù),其次對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行選擇離子掃描,優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓,得到最佳碎裂電壓,接著使用優(yōu)化好的碎裂電壓對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描,得到碎片離子信息,根據(jù)得到碎片離子的豐度選擇被測化合物的定性和定量離子對,最后進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測掃描,使用優(yōu)化好的碎裂電壓及確定的定性定量離子對,優(yōu)化定性定量離子對的最佳碰撞能量。然后,把質(zhì)譜與液相色譜連接,確定氯霉素出峰位置后進(jìn)行電噴霧電壓、離子源溫度、輔助氣流速、霧化氣等優(yōu)化,使氯霉素分子離子與碎片離子的離子強度達(dá)到最佳,最終確定為本研究的質(zhì)譜條件。

        2.3 方法學(xué)考察

        取空白樣品魚肉按照“1.4.2”方法制成空白樣品基質(zhì)溶液,用上述空白樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線點,在最佳色譜-質(zhì)譜條件下測定,以氯霉素的定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線點溶液為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明,氯霉素在0.2893 ~11.57 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99詳見表3。

        表3 氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

        取陰性魚肉樣品,標(biāo)準(zhǔn)使用溶液通過最小添加量,按照“1.4.2”方法同法處理后上機進(jìn)樣,以3 倍信噪比計算氯霉素的檢測限(limit of detection,LOD)。向陰性樣品中添加低、中、高三個水平的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,每個添加水平平行制備3份樣品,按照“1.4.2”進(jìn)行前處理,上機測試,每份樣品重復(fù)測定3次,做加標(biāo)回收實驗。取同一質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,測定氯霉素峰響應(yīng)值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD )(%),計 算精密度。結(jié)果顯示,檢測限為0.1μg/kg,3個添加水平的平均回收率在100.7%~114.5%之間,精密度為1.65%,詳見表4。

        表4 氯霉素的檢測限、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

        2.4 實際樣品測定

        將氯霉素魚肉質(zhì)控樣按“1.4.2”方法前處理后,上機測試,內(nèi)標(biāo)法定量,測得濃度與標(biāo)示濃度值一致,得到MRM離子流圖如圖1所示。

        圖1 氯霉素魚肉質(zhì)控樣MRM離子流圖

        3 結(jié)論

        水產(chǎn)品中氯霉素的檢測,蛋白質(zhì)及脂肪的去除是整個分析過程中的關(guān)鍵點。本研究建立了QuEChERS-SPE-UPLCMS/MS測定水產(chǎn)品中氯霉素的分析方法,并將該方法應(yīng)用于實際樣品的檢測。通過對水產(chǎn)品樣品鹽包粗去除蛋白及脂肪等雜質(zhì),再經(jīng)LC-Si小柱細(xì)凈化去除提取液中殘存的雜質(zhì),凈化后的樣品溶液在0℃靜置,均無脂類析出,保持澄清透明,且回收率高。說明本法操作簡便、凈化效果好,能夠有效消除樣品中基質(zhì)影響,極大提高檢測的準(zhǔn)確度、靈敏度、重現(xiàn)性,并可有效降低假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)概率,可為市場監(jiān)管部門快速高效篩查水產(chǎn)品中氯霉素提供技術(shù)支撐。

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