王郡瑤

中國(guó)食品藥品檢定研究院

程顯隆

中國(guó)食品藥品檢定研究院

李婷

中國(guó)食品藥品檢定研究院

李明華

中國(guó)食品藥品檢定研究院

魏鋒＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院

馬雙成＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院

中藥發(fā)酵屬于炮制方法的一種，是指取待炮制品加規(guī)定的輔料拌勻后，制成一定形狀，置適宜的濕度和溫度下，使微生物生長(zhǎng)至其中酶含量達(dá)到規(guī)定程度，曬干或低溫干燥[1]。中藥的發(fā)酵炮制方法始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》。

發(fā)酵類中藥既可以直接作為飲片用于臨床，也可以作為眾多中成藥的原料或處方組成，其真?zhèn)蝺?yōu)劣直接影響臨床效果。發(fā)酵類中藥應(yīng)用廣泛，種類繁多，但由于各地處方及發(fā)酵工藝不統(tǒng)一、缺少發(fā)酵類中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法，導(dǎo)致發(fā)酵類中藥產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。本文對(duì)發(fā)酵類中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究、分類、質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，闡述發(fā)酵類中藥現(xiàn)存問(wèn)題，以期為該類產(chǎn)品質(zhì)量控制研究提供參考。

1 物質(zhì)基礎(chǔ)研究

發(fā)酵類中藥可能是通過(guò)轉(zhuǎn)化的化學(xué)成份、菌種代謝產(chǎn)物等發(fā)揮作用，針對(duì)這些物質(zhì)基礎(chǔ)已有許多相關(guān)報(bào)道。

1.1 消化酶

發(fā)酵時(shí)空氣中的水分子是微生物生長(zhǎng)的溫床，在其發(fā)揮催化作用的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的消化酶。消化酶種類繁多，有纖維素酶系、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等。目前在發(fā)酵類中藥研究中，對(duì)消化酶的研究較多。整理常見發(fā)酵類中藥產(chǎn)生酶的種類，如表1所示。

表1 發(fā)酵類中藥產(chǎn)生酶的種類

1.2 化學(xué)成份轉(zhuǎn)化降解

1.2.1 低聚糖

發(fā)酵類中藥的低聚糖來(lái)源有2條途徑。途徑1：對(duì)于米面為基質(zhì)的曲類，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶等消化酶，酶作用于底物產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖。途徑2：在發(fā)酵過(guò)程中，原藥材中某些糖苷類成份被降解，失去糖配基。張超[12]采用苯酚-硫銨法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的半夏曲中總多糖含量，結(jié)果顯示，含量先增加后減少，原因是發(fā)酵初期大分子物質(zhì)被產(chǎn)生的酶逐步酶解成低聚糖，后期微生物消耗產(chǎn)生的糖。劉洋等[13]、Magrini等[14]采用復(fù)合益生菌分別對(duì)王不留行、益母草、黃芪進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定多糖含量，結(jié)果顯示，多糖含量均增加。

1.2.2 脂肪酸

當(dāng)發(fā)酵類中藥的原藥材含有較多的油脂及不溶性酯類時(shí)，產(chǎn)物會(huì)包含長(zhǎng)鏈脂肪酸及小分子酸性物質(zhì)，如六神曲發(fā)酵后酸度增加[15]、半夏曲中甘草次酸含量會(huì)隨發(fā)酵而升高[16]等。但對(duì)于酸類物質(zhì)的具體來(lái)源及機(jī)制暫無(wú)明確的研究闡述，僅有結(jié)論，后續(xù)可作為研究方向。

1.2.3 活性成份轉(zhuǎn)化

林王敏等[17]、王麗芳等[18]、杜晨暉等[19]分別對(duì)淡豆豉、六神曲、酸棗仁發(fā)酵前后成份轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，均存在黃酮苷類物質(zhì)脫糖基轉(zhuǎn)化為苷元的現(xiàn)象，發(fā)酵后苷元含量上升，為發(fā)酵類中藥成份尋找質(zhì)量控制指標(biāo)提供了參考思路。另外，可以利用微生物將苷轉(zhuǎn)化為苷元這一作用，人工制備不易得到的苷元，如王永宏[20]通過(guò)微生物發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)了梔子中有效成份梔子苷元京尼平的制備。

除苷向苷元轉(zhuǎn)化外，還可利用發(fā)酵提高其他種類有效成份的轉(zhuǎn)化。如甘草發(fā)酵后甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸[21]、黃芪經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵后總黃酮和總皂苷含量增加[22]、將人參中含量較高的人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為生物活性更高的稀有人參皂苷C-K[23]等。因此，發(fā)酵可作為輔助中藥提取、提高中藥有效成份利用率的有效方法。

1.2.4 有毒物質(zhì)降解

發(fā)酵作為炮制技術(shù)的一種，具有增效減毒的作用。發(fā)酵類中藥化風(fēng)丹中生物堿類成份既是指標(biāo)成份也是毒性成份。馬奮剛等[24]測(cè)定發(fā)酵前后化風(fēng)丹中次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿3種雙酯型生物堿及苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3種單酯型生物堿的含量，結(jié)果表明，發(fā)酵后毒性較大的雙酯型生物堿含量下降，而單酯型生物堿含量上升，提示可能存在2種生物堿間的轉(zhuǎn)化。朱舟等[25]利用天南星與白僵菌雙向發(fā)酵得到抗驚厥藥效不變、半數(shù)致死量（LD50）增大2倍、毒性較小的產(chǎn)物，達(dá)到減毒的目的。

1.3 菌種變化

微生物是發(fā)酵炮制的核心，發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類、數(shù)量、優(yōu)勢(shì)菌種等均處在動(dòng)態(tài)變化中，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中菌種變化的監(jiān)測(cè)有利于篩選優(yōu)勢(shì)菌并進(jìn)行分離鑒定，為后期實(shí)現(xiàn)純種菌發(fā)酵及質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。朱海針等[26]、龍凱等[27]、陳彥琳等[28]分別采用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)淡豆豉、半夏曲、六神曲中微生物種類的變化，總結(jié)菌種變化的規(guī)律并確定優(yōu)勢(shì)菌種，為后續(xù)該類中藥實(shí)現(xiàn)純種菌發(fā)酵提供參考。

上述對(duì)于微生物的鑒定均采用傳統(tǒng)分離和高通量測(cè)序技術(shù)，該方法前期處理耗時(shí)較長(zhǎng)且鑒定結(jié)果需人工整理，無(wú)法直觀給出。目前，隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)以其靈敏度、準(zhǔn)確度高且能進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用日益廣泛，在微生物鑒定領(lǐng)域，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）、敞 開式離子化質(zhì)譜（AI-MS）技術(shù)以其分析時(shí)間短、檢測(cè)成本低、信息直觀、易于操作等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為微生物檢測(cè)的重要方式[29-32]。但目前未見該技術(shù)應(yīng)用于發(fā)酵類中藥的微生物群落鑒定，可作為日后研究的方向。

1.4 真菌毒素

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括霉菌毒素和蕈菌毒素，易產(chǎn)生致癌、致突變作用。為避免真菌毒素對(duì)用藥安全的影響，應(yīng)嚴(yán)格檢測(cè)和控制真菌毒素的含量，發(fā)酵類中藥更應(yīng)注重該安全性指標(biāo)的控制。李汶等[33]、張雪輝等[34]分別采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、高效液相色譜法與熒光光度法檢測(cè)常見中藥淡豆豉、生建曲、六神曲及含有六神曲的中成藥保和片、含有淡豆豉的中成藥銀翹解毒片中黃曲霉毒素含量，結(jié)果顯示，藥材中黃曲霉毒素B1含量差距較大，提示發(fā)酵類中藥有可能被黃曲霉毒素污染，應(yīng)加強(qiáng)檢測(cè)。另外，發(fā)酵類產(chǎn)品不應(yīng)只關(guān)注黃曲霉毒素，如赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、肉毒毒素等作為常見的真菌毒素，在發(fā)酵類中藥中卻鮮有報(bào)道[35-37]。

2 發(fā)酵類中藥的分類

2.1 按發(fā)酵方式分類

按發(fā)酵方式分為傳統(tǒng)自然發(fā)酵和現(xiàn)代純種菌發(fā)酵。傳統(tǒng)自然發(fā)酵是指在適宜溫濕度條件下，借助空氣中存在的菌種發(fā)泡或產(chǎn)生霉衣。目前，對(duì)傳統(tǒng)自然發(fā)酵中“適宜”二字的定義并不具體，但發(fā)酵順利與否受溫濕度條件影響較大。同時(shí)，傳統(tǒng)自然發(fā)酵終點(diǎn)的辨別仍需人工經(jīng)驗(yàn)輔助，摻雜了主觀臆斷的可能。另外，參與傳統(tǒng)自然發(fā)酵的微生物種類和數(shù)量存在較大的不確定性。以上因素均不利于統(tǒng)一的質(zhì)量控制。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，微生物的分離鑒定越來(lái)越普遍，這使優(yōu)勢(shì)菌種的選擇和純種菌發(fā)酵成為可能。現(xiàn)代純種菌發(fā)酵嚴(yán)格控制發(fā)酵溫濕度、參與催化分解作用的微生物種類和數(shù)量等，從發(fā)酵原藥材的挑選、菌種的選擇、發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化等方面保證發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)控制[38]。與傳統(tǒng)自然發(fā)酵相比，現(xiàn)代純種菌發(fā)酵能夠更好地進(jìn)行質(zhì)量控制，但目前市場(chǎng)上大多數(shù)發(fā)酵類中藥仍采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式。

2.2 按發(fā)酵技術(shù)手段分類

2.2.1 固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵是指在固態(tài)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行微生物發(fā)酵的過(guò)程，基質(zhì)中幾乎無(wú)自由流動(dòng)的水，起源于古代炮制技術(shù)中的制曲工藝，包括藥材預(yù)處理、微生物選擇、發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化等步驟[39]。該發(fā)酵技術(shù)操作簡(jiǎn)便、設(shè)備和場(chǎng)地要求較低，但發(fā)酵環(huán)境處于開放狀態(tài)、發(fā)酵終點(diǎn)的確定依賴經(jīng)驗(yàn)、參與發(fā)酵的菌種不固定且未對(duì)基質(zhì)進(jìn)行滅菌[40]，導(dǎo)致成品存在批間差異，市場(chǎng)上流通的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。六神曲、建曲、半夏曲、淡豆豉、百藥煎等均屬于固體發(fā)酵。

2.2.2 液體發(fā)酵

液體發(fā)酵是在融合了抗生素制備工藝的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，將優(yōu)勢(shì)菌種的菌絲接種在培養(yǎng)基上，發(fā)酵產(chǎn)物為菌絲體和次級(jí)代謝產(chǎn)物。該發(fā)酵技術(shù)解決了固體發(fā)酵中混合菌株開放式發(fā)酵的問(wèn)題，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，成為發(fā)酵類中藥大生產(chǎn)的主要方式。如利用真菌糙皮側(cè)耳制備的黨參發(fā)酵液鎮(zhèn)痛效果顯著提高[41]、積雪草經(jīng)黑曲霉JH-2菌株液體發(fā)酵后積雪草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高3倍[42]等。

2.2.3 雙向發(fā)酵

雙向發(fā)酵技術(shù)起源于固態(tài)發(fā)酵，區(qū)別在于將固態(tài)發(fā)酵中農(nóng)副產(chǎn)品等營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)以具有一定活性成份的藥材或藥渣替代，并接種優(yōu)選菌種進(jìn)行發(fā)酵的制備手段[43]。如利用毛霉、曲霉、青霉等微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷、葛根素、黃芩苷等[44]。雙向發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)了中藥的二次利用，增加了中藥有效成份的利用率，提高藥效，目前研究廣泛[45-46]，常見的紅曲為該類發(fā)酵技術(shù)所得。

2.3 按發(fā)酵基質(zhì)分類

2.3.1 米面曲類

米面曲類中藥是以米面等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)物。作為發(fā)酵類中藥中最為常見的曲類，最早的記載可追溯到商周時(shí)期的《禮記》。以曲類形式入藥，最早見于東漢張仲景所撰《金匱要略》中的 “薯蕷丸”[47]。

目前，常見的米面曲類有六神曲、建曲、半夏曲、紅曲、沉香曲、采云曲等。其中，臨床需求量排名前三的分別為紅曲、建曲和六神曲[48]。米面曲類處方差異較大，有幾味藥材組成的如六神曲，也有幾十味藥材組成的如漳州神曲。由于米面曲類處方組成各地差異較大、生產(chǎn)工藝處于半工業(yè)化階段等原因，質(zhì)量控制仍處于起步階段，市場(chǎng)上以次充好的質(zhì)量問(wèn)題大肆泛濫，長(zhǎng)此以往，臨床需求萎縮、曲類中藥發(fā)展受阻等問(wèn)題將不斷呈現(xiàn)。因此，統(tǒng)一米面曲類中藥的處方配比、規(guī)范生產(chǎn)工藝、制定質(zhì)量控制方法、形成完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。

2.3.2 膽汁發(fā)酵類

膽汁發(fā)酵類中藥是以來(lái)源于豬、牛、羊、雞等的膽汁為基質(zhì)、具有藥效的中藥為底物進(jìn)行雙向發(fā)酵的產(chǎn)物，常見的有膽南星、體外培育牛黃、化風(fēng)丹、膽黃連等[49-50]。其中，膽南星已作為發(fā)酵加工品收錄于《中國(guó)藥典》2020年版一部。目前，膽汁發(fā)酵類中藥的發(fā)展受制于膽汁來(lái)源不同，發(fā)酵工藝各異，發(fā)酵時(shí)間少則幾天多達(dá)數(shù)月，性狀的描述多為氣微腥味苦，受人為經(jīng)驗(yàn)影響等因素。未來(lái)需繼續(xù)發(fā)掘適用于膽汁發(fā)酵的藥材、對(duì)膽汁來(lái)源進(jìn)行說(shuō)明、規(guī)范發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。

2.3.3 其他類

除以米面等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或膽汁作為發(fā)酵基質(zhì)外，還有直接使用藥材不外加基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵的中藥，如淡豆豉、百藥煎、青黛、冬蟲夏草菌粉等。其中，淡豆豉已作為發(fā)酵加工品收錄于《中國(guó)藥典》2020年版一部，質(zhì)量控制方法較為成熟。

3 質(zhì)量控制現(xiàn)狀

查閱《中國(guó)藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、各省中藥飲片炮制規(guī)范中發(fā)酵類中藥的收錄情況可以發(fā)現(xiàn)，目前該類中藥仍多以性狀鑒別為主，大部分無(wú)統(tǒng)一的處方及工藝規(guī)范，缺乏量化的、體現(xiàn)藥效的、具有發(fā)酵類中藥特色的質(zhì)控指標(biāo)，質(zhì)量控制技術(shù)手段和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)處于不成熟階段。本文將從以下2個(gè)方面對(duì)發(fā)酵類中藥的質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

3.1 處方及工藝

處方比例和發(fā)酵工藝的不同，將會(huì)影響發(fā)酵類中藥的臨床療效。整理不同標(biāo)準(zhǔn)中常見發(fā)酵類中藥的處方及工藝，如表2所示。

表2 常見發(fā)酵類中藥處方及工藝

續(xù)表

續(xù)表

3.2 質(zhì)量控制方法

對(duì)于發(fā)酵類中藥，目前的質(zhì)量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查等，如表3所示。

表3 常見發(fā)酵類中藥質(zhì)量控制方法匯總

續(xù)表

除《中國(guó)藥典》、部頒標(biāo)準(zhǔn)、各省中藥飲片炮制規(guī)范中有對(duì)發(fā)酵類中藥具體成份進(jìn)行含量測(cè)定外，現(xiàn)代研究認(rèn)為，消化酶是能反映發(fā)酵類中藥質(zhì)量的指標(biāo)[51-53]。目前，針對(duì)發(fā)酵類中藥酶活力測(cè)定方法按照原理主要分為2類：測(cè)定底物的消耗量和測(cè)定酶解產(chǎn)物的量。常用的方法有碘淀粉比色法、3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法、福林酚法、對(duì)-硝基苯磷酸鹽（pNPP）法、對(duì)-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法、纖維蛋白平板法等?，F(xiàn)將有關(guān)報(bào)道匯總?cè)绫?所示。

表4 發(fā)酵類中藥酶活力測(cè)定方法匯總

4 總結(jié)

4.1 統(tǒng)一處方組成，優(yōu)化規(guī)范生產(chǎn)工藝

目前，發(fā)酵類中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后，地方標(biāo)準(zhǔn)較多，且各地標(biāo)準(zhǔn)處方組成或配比不同、發(fā)酵方式及工藝參數(shù)不統(tǒng)一、質(zhì)量控制技術(shù)和方法落后，直接影響了產(chǎn)品的質(zhì)量和安全控制。其中，處方組成項(xiàng)中涉及的發(fā)酵用輔料尚無(wú)統(tǒng)一的來(lái)源及規(guī)格規(guī)定，如膽汁、黃酒、面粉等，應(yīng)予以明確并制定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

另外，發(fā)酵類中藥在大生產(chǎn)中仍多采用固體發(fā)酵及傳統(tǒng)自然發(fā)酵的方式，而涉及優(yōu)勢(shì)菌種、提高有效成份轉(zhuǎn)化、提高生產(chǎn)效率的液體發(fā)酵和雙向發(fā)酵技術(shù)僅停留在實(shí)驗(yàn)室成果階段，并未規(guī)?；D(zhuǎn)化應(yīng)用。因此，后續(xù)應(yīng)關(guān)注優(yōu)勢(shì)菌種的篩選及高效發(fā)酵技術(shù)手段和生產(chǎn)工藝的開發(fā)應(yīng)用。

4.2 開展發(fā)酵過(guò)程及物質(zhì)基礎(chǔ)研究

除了配方本身的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)酵類中藥由于微生物的參與，會(huì)具有產(chǎn)生消化酶及次生代謝產(chǎn)物、原成份發(fā)生轉(zhuǎn)化降解、優(yōu)勢(shì)菌種逐漸顯現(xiàn)并且引入真菌毒素對(duì)用藥安全性產(chǎn)生威脅等特點(diǎn)。目前對(duì)發(fā)酵類中藥消化酶的研究較多，但對(duì)于微生物次生代謝產(chǎn)物及化學(xué)成份轉(zhuǎn)化的研究不夠深入，應(yīng)加強(qiáng)發(fā)酵機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的深入研究。

4.3 開展功效機(jī)制及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究

發(fā)酵類中藥雖然臨床使用非常廣泛，但因物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究不夠深入，質(zhì)量控制指標(biāo)有待進(jìn)一步明確，質(zhì)量控制技術(shù)和方法有待進(jìn)一步提高和完善。建議加強(qiáng)潛在質(zhì)量控制指標(biāo)的研究，從消化酶和化學(xué)成份兩方面入手，在作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，尋找具有發(fā)酵類中藥特色且真正能反映質(zhì)量的控制指標(biāo)。同時(shí)應(yīng)關(guān)注安全性控制指標(biāo)，特別對(duì)因生產(chǎn)過(guò)程控制不規(guī)范導(dǎo)致菌種變化及有毒代謝產(chǎn)物如真菌毒素等的控制。

總之，發(fā)酵類中藥的研究、生產(chǎn)、使用和質(zhì)量管控仍處于較為初級(jí)的階段，因其歷史悠久，臨床價(jià)值高，發(fā)展前景必然廣闊，值得進(jìn)一步在做好傳承的基礎(chǔ)上，做好創(chuàng)新發(fā)展和利用。

請(qǐng)掃描二維碼