吳 哲，陸冬筱 ，李金華

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 物理學(xué)院 吉林 長(zhǎng)春 130022；2.納米光子學(xué)與生物光子學(xué)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022）

1 引 言

在過去的幾十年間，人們對(duì)于癌癥的研究方式有了巨大的轉(zhuǎn)變。治療和診斷相結(jié)合的診療一體化已經(jīng)成為癌癥診療研究的熱點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)診療一體化不但可以實(shí)時(shí)精確地診斷病情，也能夠同時(shí)加以治療，從而獲得良好的治療效果[1]。

光熱治療作為一種新興的微創(chuàng)治療癌癥方法，是利用納米粒子吸收光能轉(zhuǎn)化為熱能，引起腫瘤部位溫度升高，殺死癌細(xì)胞的方法[2]，在惡性腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[3]。以各種材料開發(fā)的光熱劑作為引導(dǎo)光熱治療的關(guān)鍵媒介也逐漸被研究人員報(bào)道[4-6]。如碳基納米材料[7]、硫化銅納米材料[8]和過渡金屬硫化物[9]等。在這些被開發(fā)的光熱劑中，金納米粒子因?yàn)榫哂歇?dú)特的局域表面等離子共振(LSPR)特性[10]，使其在受激光輻照時(shí)對(duì)光的吸收性能增強(qiáng)，并能夠?qū)⑽盏墓饽芨咝мD(zhuǎn)化為熱能，因此是一種有潛力的光熱劑材料。此外，由于金納米粒子較好的生物兼容性[11]、高穩(wěn)定性和較為簡(jiǎn)單的表面功能化[12-13]的特點(diǎn)，更使其作為一種出色的生物醫(yī)療材料而受到關(guān)注。研究者們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多種金納米結(jié)構(gòu)，如金納米棒[14]、金納米殼[15]、金納米籠[16]和納米球[17]都已被證明在近紅外區(qū)具有等離子體共振特性，并可在近紅外激光照射下產(chǎn)生熱量從而殺死癌細(xì)胞。

光學(xué)相干層析成像(OCT)是一種新興的成像技術(shù)，可以在保持較高分辨率的情況下對(duì)微米級(jí)別的生物組織進(jìn)行成像[18]。由于OCT技術(shù)具有非接觸、無損傷、圖像分辨率高且操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[19]，研究人員不斷開拓OCT在生物成像上的應(yīng)用[20]。最早期Wang等人利用光學(xué)多普勒層析成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)血管的無創(chuàng)造影[21]。之后，人們逐步開發(fā)了許多有針對(duì)性提高OCT成像效果的造影劑作為輔助，比如聚吡咯納米粒子[22]、金、銀等貴金屬納米粒子[23-24]。其中，金納米材料被人們開發(fā)出了多種形貌用于研究其造影性能。

為了達(dá)到更好的診療效果，實(shí)現(xiàn)高效診療一體化，本文將光熱治療與OCT成像相結(jié)合，并選用金納米材料作為診療劑。利用金納米材料尖銳尖端的電場(chǎng)增強(qiáng)特性[25-26]，設(shè)計(jì)制備多尖刺狀結(jié)構(gòu)的金納米星（Au Nano Stars, AuSTs）材料，以提高其表面等離子體共振效應(yīng)，進(jìn)而提升基于金納米星診療劑的光熱治療效果和OCT成像效果。研究結(jié)果顯示制備的金納米星診療劑具有優(yōu)異的光熱特性和生物兼容性，其光熱效率達(dá)到42%，將制備的金納米星診療劑用于乳腺癌細(xì)胞的光熱治療，癌細(xì)胞存活率低至37%。同時(shí)，制備的金納米星診療劑具有優(yōu)異的OCT成像造影特性，在癌癥診療一體化領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料和試劑

檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O, 99%, Alfa Aesar)、鹽酸(HCl, 分析純, 北京化工廠)、氯金酸(HAuCl4·4H2O, 99.99%, Alfa Aesar)、硝酸銀(Ag-NO3, 99%, Alfa Aesar)、抗壞血酸(AA, 分析純, 國藥集團(tuán)上海試劑有限公司)、高糖培養(yǎng)基（DMEM,CORNING）、磷酸鹽緩沖液(PBS, Solarbio)、噻唑藍(lán)（MTT, C18H16N5SBr，Alfa Aesar）。

2.2 金納米星診療劑的制備

金納米顆粒（種子液）的制備：首先配制100 mL濃度為1mM的HAuCl4溶液，加熱至沸騰后，向其中加入15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液。在保持體積穩(wěn)定的情況下，持續(xù)沸騰15 min之后自然冷卻至室溫，得到了AuNPs，將其作為種子液，在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

金納米星的制備：向10 mL濃度為0.25 mM的HAuCl4溶液中加入20 μL濃度為1 M的HCl 溶液。在中速攪拌的條件下加入100 μL種子液。同時(shí)迅速加入100 μL濃度為2 mM的Ag-NO3溶液和50 μL濃度為100 mM的抗壞血酸溶液。1 min后混合溶液從淺紅色變?yōu)樗{(lán)黑色，說明反應(yīng)完成。立即進(jìn)行3 000～5 000 r/min離心。然后使用去離子水進(jìn)行分散。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 金納米星診療劑的表征

使用透射電鏡（TECNAI G2 20 S-TWIN,FEI）和X射線衍射分析儀（D8 Advance，布魯克）觀察金納米星的形貌和結(jié)構(gòu)，使用紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，UV-2450，島津）測(cè)定金納米星的吸收光譜，使用粒度分析儀（ZetaSizer，Malvern）測(cè)定樣品尺寸，808 nm激光器（長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)技術(shù)有限公司）用于材料的光熱特性和體外光熱治療研究，酶標(biāo)儀（M200PRO, Infinite）用于測(cè)定細(xì)胞存活率時(shí)的吸光度，光學(xué)相干層析成像儀（Telesto-1 325 nm, ThorImage）用于OCT成像研究。

2.4 金納米星診療劑的光熱特性曲線測(cè)試

溫度時(shí)間曲線測(cè)試：取不同溶液于離心管中，使用808 nm激光器進(jìn)行照射，記錄溫度-時(shí)間變化曲線。

光熱穩(wěn)定性測(cè)試：取一定濃度的AuSTs溶液于離心管中，2 W/cm2的808 nm激光器照射，照射10 min后停止照射，10 min后再繼續(xù)照射。反復(fù)5個(gè)循環(huán)，記錄溫度-時(shí)間曲線，并比較每個(gè)循環(huán)的最終溫度。

2.5 金納米星診療劑的生物兼容性測(cè)試

細(xì)胞和診療劑培養(yǎng)：將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7接種于96孔板中。用200 μL DMEM培養(yǎng)基孵育24 h后，更換全新的DMEM培養(yǎng)基180 μL，之后向其中分別加入20 μL不同濃度的AuSTs，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)孔。另有一個(gè)空白對(duì)照組，向其中加入20 μL PBS緩沖液，與細(xì)胞再培養(yǎng)24 h。

使用噻唑藍(lán)比色法（MTT）對(duì)金納米星診療劑的生物兼容性進(jìn)行測(cè)試：向上面培養(yǎng)好的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)共培養(yǎng)4 h。移除培養(yǎng)基和未反應(yīng)的MTT，向每個(gè)孔中加入200 μL DMSO來溶解Formazan晶體。室溫下持續(xù)振蕩15 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度。計(jì)算公式如下：細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

2.6 金納米星診療劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行光熱治療實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞和診療劑培養(yǎng)方法同2.5節(jié)。

對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行光熱治療：將上面培養(yǎng)好的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組更換新鮮的培養(yǎng)基，之后進(jìn)行光熱治療實(shí)驗(yàn)。使用808 nm，2 W/cm2激光器對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行照射。記錄時(shí)間以保證每個(gè)孔徑照射時(shí)間為10 min。之后，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性：具體方法同2.5節(jié)。

2.7 金納米星診療劑對(duì)模擬組織進(jìn)行光學(xué)相干層析成像測(cè)試

首先，按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備了模擬組織的第二類組織體模[27]。具體制備方法如下：將0.2 g聚乙烯醇（PVA）加入至10 mL煮沸的去離子水中，并向其中加入4 mL AuSTs溶液。在沸騰狀態(tài)下持續(xù)攪拌30 min后，倒入模具中，進(jìn)行光學(xué)相干層析成像觀測(cè)。

隨后，采用鯽魚眼部作為真實(shí)生物組織，進(jìn)行前房注射AuSTs溶液，觀察注射前后的OCT成像變化。

3 結(jié)果和討論

3.1 金納米星材料的表征

在制備AuSTs的過程中，為了實(shí)現(xiàn)其刺狀結(jié)構(gòu)與尺寸的一致性控制，探究了不同Ag+濃度對(duì)AuSTs形貌的影響。對(duì)制備的AuSTs進(jìn)行了表征（圖1）。圖1（a）、1（b）和1（c）分別是Ag+濃度為1 mM、2 mM和4 mM制備所得AuSTs的透射電鏡照片，可以看出隨著Ag+濃度的增加對(duì)于AuSTs的尺寸沒有明顯的影響，但隨著Ag+的濃度增加，在Au的球核上長(zhǎng)出的尖刺變得更多、更長(zhǎng)且更尖。圖1（b）的插圖為枝狀結(jié)構(gòu)的高分辨透射電鏡照片，經(jīng)測(cè)量，其晶格間距約為2.03 ?左右，與Au的(200)晶面對(duì)應(yīng)，說明已經(jīng)制備出多枝狀的金基納米星材料(AuSTs)。圖1（d）為AuSTs的XRD圖譜，可以看出樣品的衍射峰與標(biāo)準(zhǔn)卡片對(duì)應(yīng)，且衍射峰較強(qiáng)，這說明本文制備的AuSTs材料的結(jié)晶性較好。對(duì)AuSTs進(jìn)行了粒徑分析，其直徑在70 nm左右（圖1（e）），這個(gè)尺寸適合細(xì)胞光熱治療實(shí)驗(yàn)。對(duì)制備的AuSTs進(jìn)行了吸收光譜表征，AuSTs在500～900 nm具有一個(gè)較寬的吸收波段（圖1（f）），吸收峰位于780 nm處，在808 nm處也有較強(qiáng)的吸收，這有利于其在基于近紅外光的光熱治療中的應(yīng)用。

圖1 金納米星的表征。Ag+濃度分別為（a）1 mM，（b）2 mM和（c）4 mM金納米星的透射電子顯微鏡照片。（d）金納米星的XRD圖譜。（e）金納米星的粒徑分析。（f）金納米星的吸收光譜Fig.1 Characterization of AuSTs.Transmission electron micrographs of gold nanostars with Ag+ concentrations of (a) 1 mM,(b) 2 mM and (c) 4 mM.(d) XRD patterns of AuSTs.(e) Particle size of AuSTs.(f) Absorption spectra of AuSTs

3.2 金納米星診療劑的光熱性能研究

本文首先研究了激光器功率對(duì)材料光熱性能的影響，如圖2（a）所示。結(jié)果顯示，隨著激光器功率密度的增加，AuSTs的光熱性能有了明顯的提高。隨后對(duì)不同Ag+濃度所制備AuSTs的光熱性能進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示，由于Ag+濃度為2 mM時(shí)制備的AuSTs在808 nm處具有最高的吸收強(qiáng)度，所以也具有最好的光熱效果，其溫度極限達(dá)到了56.9℃（圖2（b））。腫瘤細(xì)胞的敏感溫度為50℃，在這一溫度環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會(huì)大量死亡，所以制備的金納米星診療劑可以用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行光熱治療。然后，研究AuSTs診療劑濃度對(duì)光熱效果的影響，隨著AuSTs濃度的升高，AuSTs溶液的升溫速率和極限溫度也在進(jìn)一步提高（圖2（c））。在對(duì)不同形貌的金納米材料的光熱性能研究的結(jié)果顯示，與水相比，金納米材料在激光照射10 min后，具有明顯的光熱效果，而AuSTs的升溫速率和極限溫度要明顯高于AuNPs（圖2（d））。此外，研究了AuSTs診療劑的光熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2（e）所示，可見，每次光照后樣品均能升高到相近的溫度，升降溫速率也基本保持不變，說明制備的AuSTs診療劑的光熱穩(wěn)定性較好。依據(jù)公式計(jì)算了AuSTs的光熱轉(zhuǎn)換效率，如下：其中，TMax代表激光照射過程中的最高溫度；TSurr代表環(huán)境溫度；MD為溶液質(zhì)量，CD為溶液比熱容；τs代表特征熱時(shí)間常數(shù)；h為傳熱系數(shù)；S為樣品容器表面積；I為激光功率；Aλ為在某處波長(zhǎng)的吸光度；QDis為樣品容器和溶劑所吸收的能量。

圖2 金納米星的光熱性能測(cè)試。（a）AuSTs在808 nm激光不同功率密度下的溫度-時(shí)間曲線。在808 nm，2 W/cm2激光照射下。（b）不同Ag+濃度制備的AuSTs的溫度-時(shí)間曲線。（c）不同濃度金納米星的溫度-時(shí)間曲線。（d）AuSTs、AuNPs和去離子水的溫度-時(shí)間曲線。（e）金納米星系統(tǒng)的光熱穩(wěn)定性測(cè)試。（f）金納米星系統(tǒng)的特征熱時(shí)間常數(shù)Fig.2 Photothermal property of AuSTs.(a) Temperature-time curves of AuSTs at different power densities.Under 808 nm,2 W/cm2 laser irradiation.(b) Time-temperature curve of AuSTs prepared with different Ag+ concentrations.(c) Temperature-time curves of AuSTs at different concentrations.(d) Temperature-time curves of AuSTs, AuNPs and DI Water.(e) Photothermal stability of AuSTs.(f) Graph of cooling period of the time versus negative natural logarithm of the temperature

具體計(jì)算過程如下：選取圖2（c）中降溫過程，根據(jù)公式(1)和溫度T計(jì)算出θ，然后以-lnθ為橫坐標(biāo)，時(shí)間為縱坐標(biāo)作圖（圖2（f）），擬合直線的斜率即為系統(tǒng)熱時(shí)間常數(shù)τs。隨后帶入公式(2)中計(jì)算出hS，最后根據(jù)公式(3)計(jì)算出AuSTs的光熱轉(zhuǎn)換效率η=42%，而實(shí)驗(yàn)組中的金納米顆粒光熱轉(zhuǎn)換效率為36%。

金納米星的光熱效率高于金納米顆粒是因?yàn)榻鸺{米星比金納米顆粒具有更多尖銳的尖端結(jié)構(gòu)和更大的金核，而金納米材料的中心核的尺寸、尖刺的長(zhǎng)徑比、尖刺的長(zhǎng)度和數(shù)量越多，其具有的LSPR效應(yīng)越強(qiáng)[10]。而金納米材料的光熱轉(zhuǎn)換過程主要依賴LSPR效應(yīng)，因此金納米星的光熱轉(zhuǎn)換效率要遠(yuǎn)高于金納米顆粒。同時(shí)，金納米星的多尖端結(jié)構(gòu)使其在近紅外區(qū)存在較大的吸收截面，使入射的近紅外光能夠高效被吸收，以用于光熱轉(zhuǎn)換[28]。

3.3 金納米星診療劑的光熱治療效果研究

對(duì)AuSTs診療劑的生物安全性進(jìn)行研究，使用MCF-7乳腺癌細(xì)胞通過噻唑藍(lán)比色法(MTT)進(jìn)行了生物兼容性測(cè)試，結(jié)果如圖3（彩圖見期刊電子版）所示，不同濃度下，細(xì)胞的存活率均可達(dá)到80%以上，隨著診療劑濃度的增加，細(xì)胞存活率下降非常緩慢，說明制備的AuSTs診療劑具有較好的生物安全性。

圖3 金納米星診療劑的生物兼容性測(cè)試Fig.3 Biocompatibility test of AuSTs

隨后研究了不同濃度的AuSTs診療劑對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的光熱治療效果。如圖4（彩圖見期刊電子版）所示，選擇808 nm，2.0 W/cm2的激光對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行照射，在不使用AuSTs診療劑或不經(jīng)激光照射時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用不明顯。而在使用AuSTs診療劑并經(jīng)激光照射后，對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果顯著提高。隨著AuSTs診療劑濃度的增加，癌細(xì)胞的存活率接近直線下降。使用濃度為100 μg/mL的AuSTs診療劑對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行光熱治療后，癌細(xì)胞存活率大幅降低為37%，說明制備的AuSTs診療劑具有優(yōu)異的乳腺癌細(xì)胞光熱治療效果。

圖4 金納米星診療劑的光熱治療效果Fig.4 The photothermal therapy effect of AuSTs

3.4 金納米星診療劑的OCT成像造影效果研究

使用聚乙烯醇(PVA)制作了模擬第二類組織體模[27]用于OCT成像研究，結(jié)果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。從圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)中可以看出，添加去離子水前后的組織體模的OCT圖像沒有明顯差異，而添加了30%聚乙二醇（PEG）作為造影劑的組織體模的信號(hào)強(qiáng)度也沒有明顯提高，這說明去離子水沒有造影效果，而PEG作為一種常用的造影劑在30%濃度下的造影效果也不如AuSTs理想。在使用AuSTs診療劑后，組織體模的OCT成像效果顯著提高，而且成像深度也有較大提升，可以達(dá)到近2 mm。此外，對(duì)于圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)中框選區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)，在深度測(cè)量范圍內(nèi)，使用AuSTs診療劑后樣品的成像信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于不使用AuSTs診療劑時(shí)樣品信號(hào)的強(qiáng)度（圖5(d)）。而且使用AuSTs診療劑后，當(dāng)深度從0變化到0.8 mm時(shí)，樣品的成像信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在0.8 mm處信號(hào)最強(qiáng)，說明AuSTs診療劑在0.8 mm深度下的濃度最大，隨著AuSTs診療劑濃度的增加，樣品成像信號(hào)也逐漸變強(qiáng)，并且在組織體模的更深處同樣有較強(qiáng)的信號(hào)。

圖5 AuSTs作為造影劑在OCT成像中的效果。（a）加入去離子水的組織體模。（b）嵌入PEG-200的體模成像效果。（c）嵌入AuSTs的體模成像效果。（d）對(duì)（a)、（b)和（c)中框選區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。鯽魚眼部AuSTs造影劑注射前（e）和注射后（f）的OCT成像效果。（g）對(duì)（e）和（f）中框選區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.5 OCT imaging with AuSTs as contrast agents.OCT image of simulated tissue with (a) DI water, (b) PEG-200, and(c) AuSTs.(d) OCT signal intensity on depth of simulated tissue with DI water, PEG-200 and AuSTs.The OCT imaging effects of AuSTs in the eyes of crucian carp before (e) and after (f) injection.(g) Statistics on the signal strength of the area selected in (e) and (f)

此外，OCT也被常用于眼科疾病的診斷。本課題組利用鯽魚眼部作為活體模型，來研究AuSTs作為診療劑在體內(nèi)的應(yīng)用。為了清晰地進(jìn)行比較，先對(duì)鯽魚眼部進(jìn)行OCT成像。在圖5(e)中可以清晰地看出眼部的角膜、前房和晶狀體結(jié)構(gòu)。而前房部位由于房水透明導(dǎo)致這一部位的信號(hào)強(qiáng)度較弱。在前房注射AuSTs作為造影劑之后，其信號(hào)強(qiáng)度有了明顯提高（圖5(f)）。對(duì)框選區(qū)域進(jìn)行了信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，如圖5(g)所示，在相同部位信號(hào)強(qiáng)度有了大約10倍的提高。這說明制備的AuSTs診療劑是一種優(yōu)異的OCT成像造影劑。

4 結(jié) 論

這項(xiàng)工作利用尖端結(jié)構(gòu)增強(qiáng)金納米材料的局域表面等離子共振特性，成功設(shè)計(jì)制備了AuSTs診療劑，使其在近紅外區(qū)域具有優(yōu)異的光熱特性，其光熱轉(zhuǎn)換效率高達(dá)42%。此外，將制備的AuSTs診療劑用于對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的光熱治療以及對(duì)組織體模進(jìn)行OCT成像的應(yīng)用研究。由于具有較高的光熱轉(zhuǎn)換效率，AuSTs診療劑具有較好的腫瘤光熱治療能力，當(dāng)AuSTs診療劑濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行光熱治療后，癌細(xì)胞存活率低至37%。由于具有較高的光散射特性，AuSTs診療劑具有較好的OCT成像造影能力，在使用AuSTs診療劑后，模擬組織樣品的成像深度和信號(hào)強(qiáng)度顯著提升,與空白對(duì)照組相比，添加AuSTs診療劑的模擬組織成像深度可達(dá)2 mm。由此可知，制備的AuSTs診療劑既具有高效的光熱治療能力，又具有出色的OCT成像造影能力，有望在未來多種功能協(xié)同作用的診療一體化平臺(tái)中進(jìn)行更廣泛的應(yīng)用。并且，金納米粒子作為一種易于偶聯(lián)修飾的納米材料，其在多功能和高效率的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著非常好的應(yīng)用前景。