張 楊,鄭前興,2,吳仁人*,李國(guó)棟,鐘 義**,陳中穎,韋思業(yè),李開(kāi)明

有氧和厭氧環(huán)境下指示微生物的穩(wěn)定性特征

張 楊1,鄭前興1,2,吳仁人1*,李國(guó)棟1,鐘 義1**,陳中穎1,韋思業(yè)1,李開(kāi)明1

(1.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655；2.昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650500)

建立有氧和厭氧水環(huán)境模擬反應(yīng)器,利用熒光定量PCR和高通量測(cè)序技術(shù)探究了豬源擬桿菌標(biāo)記物、部分指示微生物和潛在致病菌在有氧及厭氧水環(huán)境中的變化特征.結(jié)果表明,指示微生物Streptococcaceae、Lactobacillaceae、Carnobacteriaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae在不同反應(yīng)器中均呈現(xiàn)出衰減趨勢(shì),但在有氧環(huán)境中的衰減幅度顯著大于厭氧環(huán)境.因此,這幾類(lèi)指示微生物在有氧條件下適用于解析近期發(fā)生的污染事件.擬桿菌標(biāo)記物GenBac和Pig-2-Bac在有氧環(huán)境和厭氧環(huán)境中均表現(xiàn)出二階段衰減模式,且第一階段為主要衰減階段.但擬桿菌標(biāo)記物在有氧環(huán)境中的衰減速率顯著大于厭氧環(huán)境,表明有氧環(huán)境中擬桿菌標(biāo)記物的穩(wěn)定性較差.相關(guān)性分析顯示潛在致病菌、和與擬桿菌標(biāo)記物表現(xiàn)出較好的相關(guān)性(<0.05),但僅與標(biāo)記物在有氧和厭氧環(huán)境中的相關(guān)性系數(shù)較為接近(0.913～0.953),表明擬桿菌標(biāo)記物可作為的指示標(biāo)記物.

糞便污染；微生物污染源解析；標(biāo)記物；指示微生物；穩(wěn)定性

隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展,糞便廢水排放已逐漸成為地表水水質(zhì)惡化的主要原因之一,糞便中攜帶的致病微生物還能導(dǎo)致介水性疾病的爆發(fā),給人類(lèi)的健康帶來(lái)潛在威脅[1-2].為有效防治糞便廢水的污染,糞大腸菌群、大腸埃希氏菌和腸球菌等傳統(tǒng)指示微生物一直作為判斷水體受糞便污染程度的指標(biāo).然而,傳統(tǒng)指示微生物可能在溫度條件適宜,營(yíng)養(yǎng)水平較高的水體中天然存在[3-4],且無(wú)法提供糞便污染宿主來(lái)源等信息[5].微生物污染源解析技術(shù)(MST)可以通過(guò)分子生物學(xué)手段識(shí)別污染物的宿主來(lái)源,還可以排除自然環(huán)境中土著微生物對(duì)源解析結(jié)果的干擾[6-7].MST技術(shù)通?？煞譃榉菐?kù)依賴法和庫(kù)依賴法兩類(lèi).非庫(kù)依賴法主要是針對(duì)不同宿主腸道內(nèi)特征微生物的基因片段開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的標(biāo)記物,具有易操作、成本低、時(shí)效強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[5].

目前,大多數(shù)標(biāo)記物主要針對(duì)各宿主腸道內(nèi)的擬桿菌特異性基因片段開(kāi)發(fā)而來(lái).一方面,擬桿菌標(biāo)記物具有較強(qiáng)的宿主特異性,如豬源擬桿菌標(biāo)記物Pig-1-Bac和Pig-2-Bac在我國(guó)有較好的適用性,特別是Pig-2-Bac的特異性達(dá)到了88%,可有效識(shí)別來(lái)自于豬糞廢水的污染[8].另一方面,擬桿菌作為專(zhuān)性厭氧菌,在進(jìn)入第二生境后難以增殖,不會(huì)影響對(duì)于糞便污染水平的判斷.而傳統(tǒng)指示微生物,如大腸埃希氏菌可在適宜的環(huán)境中增殖,使得無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估環(huán)境中的糞便污染強(qiáng)度[9-10].庫(kù)依賴法是利用高通量測(cè)序技術(shù)分析不同宿主糞便中的微生物信息,建立糞便污染分類(lèi)文庫(kù),進(jìn)而與自然環(huán)境中獲取的微生物信息進(jìn)行對(duì)比,識(shí)別糞便排放的宿主來(lái)源[11].該方法的優(yōu)勢(shì)在于不僅可以提供污染源信息,還能提供糞便及自然水體中微生物群落結(jié)構(gòu)和致病菌分布等情況,但該方法存在難以進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析的缺陷[12].因此,目前MST逐漸發(fā)展為同時(shí)結(jié)合2種技術(shù)方法,充分分析各污染源的污染強(qiáng)度及樣本中的微生物群落信息.

盡管MST技術(shù)相比于傳統(tǒng)指示微生物具有諸多優(yōu)勢(shì),但要準(zhǔn)確評(píng)估各污染源的貢獻(xiàn)率還需要掌握標(biāo)記物或腸道微生物在不同水環(huán)境中的穩(wěn)定性特征.目前已有研究探索了不同溫度、營(yíng)養(yǎng)水平條件下標(biāo)記物在水環(huán)境中的變化規(guī)律[9,13],但關(guān)于溶解氧對(duì)標(biāo)記物或腸道微生物環(huán)境行為的影響研究相對(duì)較少.在黑臭水體或富營(yíng)養(yǎng)化較為嚴(yán)重的水環(huán)境中,由于大量有機(jī)污染物的存在和微生物降解等作用[14],水體可能呈現(xiàn)厭氧狀態(tài),而溶解氧的變化對(duì)于微生物群落組成有顯著影響[15-16],因此在有氧和厭氧水環(huán)境中,標(biāo)記物或腸道微生物的穩(wěn)定性表現(xiàn)可能會(huì)有較大差異,從而影響源解析的準(zhǔn)確性.此外,由于致病菌在環(huán)境中的豐度普遍較低,因此研究人員一直致力于尋找可靠的指示微生物用于評(píng)價(jià)水質(zhì)污染和健康風(fēng)險(xiǎn)[17-19].已有研究報(bào)道了人源擬桿菌標(biāo)記物HF183和Hum2對(duì)于潛在致病菌的指示作用[9,20].然而,擬桿菌標(biāo)記物與潛在致病菌之間的相關(guān)關(guān)系可能會(huì)因宿主不同而發(fā)生變化[21],目前關(guān)于豬糞攜帶的潛在致病菌與豬源擬桿菌標(biāo)記物的相關(guān)關(guān)系研究較少.本研究通過(guò)搭建的水環(huán)境模擬反應(yīng)器,模擬豬源腸道微生物在有氧和厭氧水環(huán)境中的變化情況,探究溶解氧對(duì)于標(biāo)記物和腸道微生物穩(wěn)定性的影響,以期為高效開(kāi)展微生物污染源解析工作提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

樣品采集:豬糞樣品取自廣東省某畜牧養(yǎng)殖研究所.利用滅菌勺和滅菌塑料瓶采集新鮮豬糞并放入冰盒中保存,2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理.

主要儀器:熒光定量PCR儀(Light Cycler 480II, Roche公司),紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(DR2800,HACH公司),磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器公司), 溶解氧測(cè)定儀(Pro20,YSI 公司),冷凍離心機(jī)(Sigma 公司).

主要試劑:水體DNA提取試劑盒(D3145-02, Magen公司),熒光染料SYBR TaqⅡ(TIANGEN公司), COD 高量程預(yù)制試劑(HACH公司), LB肉湯培養(yǎng)基(環(huán)凱生物公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級(jí)).

1.2 模擬反應(yīng)器搭建

水環(huán)境模擬反應(yīng)器采用透明有機(jī)玻璃制成,反應(yīng)器為圓柱形,高25cm,直徑為30cm.反應(yīng)器可置于磁力攪拌器上,通過(guò)長(zhǎng)度為8cm的轉(zhuǎn)子對(duì)反應(yīng)器內(nèi)的水體進(jìn)行攪拌,轉(zhuǎn)速約為170～220r/min.

實(shí)驗(yàn)分為有氧組(AeT)和厭氧組(AnT),每組設(shè)置2個(gè)反應(yīng)器作為平行實(shí)驗(yàn),共建立4個(gè)反應(yīng)器.為排除土著微生物對(duì)反應(yīng)器內(nèi)糞源微生物的干擾,有效識(shí)別有氧和厭氧環(huán)境下標(biāo)記物及指示微生物的穩(wěn)定性差異,實(shí)驗(yàn)采用糞便接種至去離子水的方式構(gòu)建各反應(yīng)器.反應(yīng)器建立之前,采用4L滅菌去離子水溶解8g豬糞樣本,充分混勻后依次在37,29μm滅菌濾網(wǎng)中過(guò)濾以去除可能干擾實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì).過(guò)濾完成后,對(duì)制備的糞液進(jìn)行充分混勻,并均分為4份分別置于4個(gè)反應(yīng)器當(dāng)中,每個(gè)反應(yīng)器均通過(guò)滅菌去離子水定容至12L.反應(yīng)器搭建完成后,向厭氧組的2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)通入N2使得反應(yīng)器中水體的溶解氧含量降至0.1mg/L以下,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持25L/h的通氣量,維持厭氧組反應(yīng)器的厭氧環(huán)境.有氧和厭氧組反應(yīng)器均置于磁力攪拌器上,通過(guò)轉(zhuǎn)子對(duì)水體進(jìn)行持續(xù)攪拌.當(dāng)有氧組中擬桿菌標(biāo)記物的濃度趨于穩(wěn)定,不發(fā)生顯著變化時(shí),同時(shí)結(jié)束兩組實(shí)驗(yàn),對(duì)標(biāo)記物的穩(wěn)定性特征進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)共持續(xù)11d.實(shí)驗(yàn)運(yùn)行期間,有氧和厭氧反應(yīng)器溫度變化較為相似,均在18～23℃.有氧反應(yīng)器的pH值變化范圍在6.61～7.78,小于厭氧反應(yīng)器的pH值變化范圍(7.79～9.05).

1.3 分析方法

1.3.1 DNA提取和測(cè)定 每日從各反應(yīng)器中采集100mL水樣,開(kāi)展微生物的變化檢測(cè).水樣采集后采用0.22μm濾膜對(duì)其進(jìn)行抽濾,將微生物截留于濾膜上,按照水體DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取截留在濾膜上的DNA,放入-20℃冰箱留待qPCR和高通量測(cè)序分析.

1.3.2 qPCR和高通量測(cè)序 選取擬桿菌通用引物(GenBac)、大腸埃希氏菌引物(EC23S857)和豬源特異性擬桿菌引物(Pig-2-Bac)分析不同水環(huán)境中標(biāo)記物的變化特征,引物信息如表1所示.

表1 標(biāo)記物信息

qPCR擴(kuò)增體系為20μL:DNA模板2μL; SYBR TaqⅡ 10μL;10μmol/L正、反向引物各0.8μL;ddH2O補(bǔ)足體系至20μL.擴(kuò)增程序采用兩步法: ① 95℃預(yù)變性30min;② 95℃變性5s;③60℃退火延伸15s,重復(fù)40個(gè)循環(huán).熒光染料qPCR的特異性通過(guò)熔解曲線分析實(shí)現(xiàn).

標(biāo)準(zhǔn)曲線:采用已提取的DNA為模板,通過(guò)普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物純化回收,并連接到PMDTM19-T載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)平板劃線法挑取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒.通過(guò)超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度,計(jì)算目的片段拷貝數(shù).同時(shí)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,分別稀釋成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-66個(gè)梯度,每個(gè)梯度的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置3個(gè)重復(fù),進(jìn)行qPCR擴(kuò)增.反應(yīng)結(jié)束后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99,擴(kuò)增效率為92%～102%.

16S rDNA高通量測(cè)序由廣州基迪奧測(cè)序公司完成.針對(duì)已提取的DNA,選取基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用的引物為341F (5-CCTAYGGG- RBGCASCAG-3)和806R(5-GGACTACNNGGGT- ATCTAAT-3).通過(guò)凝膠回收試劑盒(TIANGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物后,利用QuantiFluorTM熒光計(jì)系進(jìn)行定量.按Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序要求開(kāi)展測(cè)序.高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的序列上傳至NCBI序列讀取檔案,登記號(hào)為SUB4479220.原始序列經(jīng)質(zhì)控后獲得高質(zhì)量序列,并在SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析.

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 標(biāo)記物衰減規(guī)律:根據(jù)標(biāo)記物在水體中的變化特征,分別采用一階和二階衰減模型對(duì)標(biāo)記物的變化進(jìn)行擬合,獲取衰減速率[25-27].當(dāng)標(biāo)記物的衰減規(guī)律存在明顯拐點(diǎn),則采用二階衰減模型,否則采用一階衰減模型[25].

對(duì)于表現(xiàn)出二階段衰減趨勢(shì)的標(biāo)記物,其濃度下降主要發(fā)生在第1階段,因此由二階衰減模型模擬的標(biāo)記物衰減過(guò)程,90計(jì)算時(shí)僅考慮第1階段衰減速率(1).

相關(guān)性分析:為探索潛在致病菌與豬源擬桿菌標(biāo)記物的相關(guān)關(guān)系,采用SPSS軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)記物在有氧/厭氧水環(huán)境中的衰減規(guī)律

由圖1可以看出,在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),選用的3個(gè)標(biāo)記物在厭氧水環(huán)境中的濃度下降了約2個(gè)數(shù)量級(jí),而在有氧環(huán)境中則下降了3～4個(gè)數(shù)量級(jí),衰減幅度顯著高于厭氧環(huán)境.衰減趨勢(shì)方面,由AIC(赤池信息量準(zhǔn)則)分析結(jié)果可知GenBac和Pig-2-Bac在所有水環(huán)境模擬反應(yīng)器中的濃度變化均表現(xiàn)出二階段衰減模式,存在拐點(diǎn)(圖1a,b).二階段衰減模型的模擬結(jié)果顯示(表2),GenBac在有氧和厭氧環(huán)境中的拐點(diǎn)分別為第6.19d和第10.25d,Pig-2-Bac在有氧和厭氧環(huán)境中的拐點(diǎn)分別為7.14和9.76d,表明擬桿菌標(biāo)記物在有氧水環(huán)境中的第1衰減階段耗時(shí)普遍小于厭氧水環(huán)境,在溶解氧作用下,擬桿菌標(biāo)記物經(jīng)歷了劇烈變化過(guò)程以適應(yīng)環(huán)境,這也說(shuō)明溶解氧對(duì)于擬桿菌標(biāo)記物的穩(wěn)定性影響顯著.EC23S857在有氧環(huán)境中表現(xiàn)出2階段衰減趨勢(shì),濃度變化的拐點(diǎn)為第8d,但在厭氧環(huán)境中則近似于線性衰減模型.由AIC結(jié)果也可知,一階衰減模型對(duì)于EC23S857在厭氧環(huán)境中濃度變化的模擬效果優(yōu)于二階衰減模型.

表2可以看出,擬桿菌標(biāo)記物GenBac和Pig-2- Bac在有氧環(huán)境下的90小于厭氧環(huán)境3～5d,2種不同模擬環(huán)境下GenBac和Pig-2-Bac的濃度變化規(guī)律也具有顯著差異(<0.05),表明有氧和厭氧條件對(duì)于擬桿菌標(biāo)記物的環(huán)境行為具有顯著影響.導(dǎo)致這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要是擬桿菌標(biāo)記物的第一階段衰減速率(1)在有氧和厭氧條件下差異(<0.05)較大所致.GenBac和Pig-2-Bac在有氧環(huán)境中的1分別高于厭氧環(huán)境62%和66%,而不同模擬條件下標(biāo)記物的第2階段衰減速率(2)則差異較小.這表明擬桿菌在進(jìn)入第二生境后,厭氧環(huán)境可有效避免溶解氧對(duì)擬桿菌的毒性作用,增加了標(biāo)記物在水體中的穩(wěn)定性,使其可以對(duì)時(shí)間跨度較長(zhǎng)的污染事件及污染源進(jìn)行追蹤解析[28].

對(duì)比擬桿菌標(biāo)記物2個(gè)階段的衰減速率還可以看出,在不同水環(huán)境中標(biāo)記物的1普遍高于2,說(shuō)明標(biāo)記物的濃度衰減主要發(fā)生在第一階段.盡管已有諸多研究報(bào)道了光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)水平及土著微生物等外界因素對(duì)于擬桿菌標(biāo)記物衰減的作用機(jī)制各不相同,但衰減規(guī)律普遍呈現(xiàn)出2階段趨勢(shì),且第1階段為主要衰減階段,而本研究從溶解氧的角度也進(jìn)一步揭示了二階段衰減模型普遍適用于模擬擬桿菌標(biāo)記物的變化規(guī)律[26,29].目前,關(guān)于導(dǎo)致標(biāo)記物兩階段衰減速率差異較大的成因尚不明確.Easton等推測(cè)可能是由于此類(lèi)微生物在進(jìn)入水環(huán)境后,逐漸適應(yīng)了環(huán)境壓力,導(dǎo)致出現(xiàn)了衰減速率較低的第二衰減階段[30-31].Strauss等[32]也認(rèn)為可能是微生物群落通過(guò)群體感應(yīng)適應(yīng)了環(huán)境壓力,大幅減小了衰減速率.但具體原因有待進(jìn)一步研究.

表2 標(biāo)記物在有氧/厭氧水環(huán)境中的衰減速率及衰減周期

注:1:一階段衰減速率;2:二階段衰減速率;:顯著性;:實(shí)驗(yàn)天數(shù);“-”代表一階衰減模擬不存在拐點(diǎn)和2.

相比于擬桿菌標(biāo)記物,有氧和厭氧環(huán)境對(duì)于標(biāo)記物的影響較小(圖1c).盡管EC23S857在有氧和厭氧模擬反應(yīng)器中表現(xiàn)出了不同的衰減趨勢(shì),但其在厭氧環(huán)境中的衰減速率與有氧環(huán)境中第一衰減階段的衰減速率差異較小,同時(shí)二者的濃度變化也未表現(xiàn)出顯著性差異(>0.05).這與Pachepsky等[33-34]對(duì)于在水體中變化的研究結(jié)果一致,即作為兼性厭氧微生物,其對(duì)溶解氧變化的響應(yīng)遠(yuǎn)小于光照和濁度等其它環(huán)境因素.

2.2 微生物群落分布

對(duì)好氧和厭氧反應(yīng)器中所有采集的樣本進(jìn)行門(mén)水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析(圖2b),結(jié)果顯示Firmicutes(厚壁菌門(mén))在樣本中占主要地位,平均相對(duì)豐度為40.3%,其次為Proteobacteria(變形菌門(mén), 25.7%),Bacteroidetes(擬桿菌門(mén),22.7%), Actinobacteria(放線菌門(mén),5.9%),Verrucomicrobia(疣微菌門(mén),4.6%)和Planctomycetes(浮霉菌門(mén),0.2%),該結(jié)果與較多研究一致,表明Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes是豬腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群[35-36].采用PCA分析樣本中的OTUs種類(lèi)發(fā)現(xiàn),所有樣本的OTUs種類(lèi)可分為3組(圖2a),第1組主要包括AeT0(有氧反應(yīng)器第0d樣本)和AnT0～AnT5,該組中Firmicutes占主要地位.第2組中包含了大部分有氧反應(yīng)器中的樣本,該組中Bacteroidetes占主要地位.第3組中主要包括AnT7～AnT10, Proteobacteria占主要地位.在3個(gè)分類(lèi)組之間,Actinobacteria、Planctomycetes的相對(duì)豐度并未表現(xiàn)出顯著差異(T檢驗(yàn),>0.05).

2.3 指示微生物的變化規(guī)律

在科水平上考察有氧和厭氧反應(yīng)器中水樣的微生物組成和變化規(guī)律(圖3).相對(duì)豐度大于1%的腸道微生物共有13類(lèi),其中相對(duì)豐度最高的為Comamonadaceae(13.5%),其次為Streptococcaceae (8.3%), Moraxellaceae(7.1%), Flavobacteriaceae (6.7%), Cryomorphaceae(6.2%), Lactobacillaceae (5.8%), Clostridiaceae(5.6%), Verrucomicrobiaceae (4.6%), Peptostreptococcaceae(4.0%), Carnobacteriaceae (3.9%), Ruminococcaceae(3.3%), Lachnospiraceae (2.3%)和Prevotellaceae(2.2%).在13類(lèi)微生物當(dāng)中, Streptococcaceae、Lactobacillaceae、Carnobacteriaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae 6類(lèi)微生物在有氧和厭氧反應(yīng)器中的相對(duì)豐度均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì),而其它微生物則發(fā)生增殖或波動(dòng)的現(xiàn)象,說(shuō)明6類(lèi)指示微生物的變化規(guī)律較為簡(jiǎn)單且易于預(yù)測(cè),符合作為指示微生物的特征[12,37].而已有部分研究也指出,上述6類(lèi)指示微生物除具有一定宿主指示功能外,還因其在環(huán)境中的變化規(guī)律較為單一而常被視作有效的指示微生物用于庫(kù)依賴法源解析工作中[11-12,21].

圖3 豬源腸道微生物在反應(yīng)器中相對(duì)豐度的變化

然而,隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,6類(lèi)指示微生物在厭氧反應(yīng)器中的衰減速率顯著小于有氧反應(yīng)器.厭氧環(huán)境中,除Prevotellaceae在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的相對(duì)豐度較初始情況下降了約25倍,其它5類(lèi)指示微生物的終末相對(duì)豐度較初始情況僅下降了約2～6倍(圖 3a).而有氧環(huán)境中,6類(lèi)指示微生物相對(duì)豐度的衰減程度顯著大于厭氧環(huán)境,特別是在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的前2d,6類(lèi)指示微生物的相對(duì)豐度在整個(gè)微生物群落中的占比迅速下降至1%以下,隨后保持較低豐度直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(圖3b).由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,厭氧環(huán)境可以使得指示微生物在一定程度上免于溶解氧帶來(lái)的毒害或抑制作用,指示微生物在該環(huán)境條件下,例如黑臭水體或沉積物當(dāng)中,能夠維持較好的穩(wěn)定性,可用于追溯污染事件發(fā)生時(shí)間相對(duì)較久的污染源.有氧環(huán)境中,指示微生物會(huì)在進(jìn)入水體初期發(fā)生快速衰減,可能導(dǎo)致低估污染源的污染水平,因此僅能用于解析近期污染事件中的污染源.而隨后在第二衰減階段維持較低水平,則可能是由于指示微生物逐漸適應(yīng)了環(huán)境壓力,同時(shí)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已足夠支持低豐度指示微生物的生活方式所致[30-31].

2.4 潛在致病菌的分布特征及變化規(guī)律

為探究糞源致病菌在有氧和厭氧環(huán)境中的變化規(guī)律,本研究參照以往關(guān)于糞源致病菌分布的研究,在屬水平識(shí)別出相對(duì)豐度大于0.1%的潛在致病菌共6類(lèi)[21,38-39].總體而言,的相對(duì)豐度最高,達(dá)到了72.0%,其次為(14.6%)、(8.3%)、(2.8%)、(1.5%)和(0.4%),其中(圖4f)僅在厭氧反應(yīng)器中檢出.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,(圖4b)、(圖4d)和(圖4e)在厭氧環(huán)境中的相對(duì)豐度呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),但衰減過(guò)程中存在波動(dòng)變化的現(xiàn)象,特別是和,相對(duì)豐度在實(shí)驗(yàn)的第1～3d有所回升,這可能是微生物對(duì)環(huán)境變化存在一定的應(yīng)激響應(yīng)過(guò)程[40-41].(圖4a)在有氧環(huán)境第2d的相對(duì)豐度較初始值增長(zhǎng)了約2個(gè)數(shù)量級(jí),隨后呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì),但在厭氧環(huán)境中的相對(duì)豐度則變化較小.這與已有關(guān)于的研究較為一致,即作為可引起呼吸道感染及腦膜炎等疾病的一類(lèi)致病菌,通常為專(zhuān)性需氧菌,在有氧條件下,可利用常見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖[42].然而,近年來(lái)也有研究人員通過(guò)厭氧培養(yǎng)方式獲得了的部分菌株,說(shuō)明厭氧環(huán)境中部分菌株可能也具有一定的活性[43],這可能也是本研究中未出現(xiàn)明顯衰減趨勢(shì)的原因之一,但具體原因仍需進(jìn)一步分析.在識(shí)別的6類(lèi)潛在致病微生物當(dāng)中,僅(圖4c)在有氧和厭氧環(huán)境中均表現(xiàn)出衰減趨勢(shì),但其在有氧環(huán)境中的衰減幅度大于厭氧環(huán)境約1.5個(gè)數(shù)量級(jí),表明溶解氧對(duì)于的穩(wěn)定性有顯著影響.

2.5 潛在致病菌與標(biāo)記物的相關(guān)性

本研究識(shí)別的相對(duì)豐度大于0.1%的6類(lèi)潛在致病菌當(dāng)中,僅、和等3類(lèi)微生物與豬源擬桿菌標(biāo)記物在有氧和厭氧兩種環(huán)境中均表現(xiàn)出較好的相關(guān)性(<0.05)(表3).值得注意的是,與標(biāo)記物在有氧和厭氧環(huán)境中的相關(guān)性系數(shù)較為接近(0.913～0.953),表明擬桿菌標(biāo)記物與在不同環(huán)境中的變化規(guī)律較為相似,可作為的指示物用于健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.和與擬桿菌標(biāo)記物在厭氧環(huán)境中的相關(guān)性均高于有氧環(huán)境,這可能是因?yàn)楹妥鳛榧嫘跃?在有氧環(huán)境中的衰減存在一定的波動(dòng)性,導(dǎo)致其衰減規(guī)律與擬桿菌標(biāo)記物的二階段衰減模式存在一定的差異性.已有研究報(bào)道了對(duì)于需氧或兼性厭氧的潛在致病菌而言,即使在有氧環(huán)境中短暫的增殖也會(huì)影響與擬桿菌標(biāo)記物之間的相關(guān)關(guān)系,進(jìn)而干擾擬桿菌標(biāo)記物對(duì)致病菌的指示作用[9].

表3 潛在致病菌和標(biāo)記物的相關(guān)性

注:a相關(guān)性系數(shù);b在0.05級(jí)別相關(guān)性顯著(<0.05);c“-”在AeT中未檢出;黑體表示在2個(gè)反應(yīng)器(AnT、AeT)中,均與標(biāo)記物GenBac、Pig-2-Bac表現(xiàn)出顯著相關(guān)性的潛在致病菌.

3 結(jié)論

3.1 擬桿菌標(biāo)記物GenBac和Pig-2-Bac在有氧和厭氧環(huán)境中均表現(xiàn)出二階段衰減模式,主要衰減過(guò)程發(fā)生在第一階段.但標(biāo)記物在有氧環(huán)境中的衰減速率顯著大于厭氧環(huán)境,其在有氧環(huán)境中的穩(wěn)定性較差.

3.2 識(shí)別出的6類(lèi)指示微生物Streptococcaceae、Lactobacillaceae、Carnobacteriaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae在有氧和厭氧環(huán)境中均表現(xiàn)出衰減趨勢(shì),可用于推測(cè)糞便污染水平.但6類(lèi)指示微生物在有氧環(huán)境中的衰減幅度均大于厭氧環(huán)境,適用于解析有氧環(huán)境中的近期污染事件.

3.3 相對(duì)豐度大于0.1%的潛在致病菌當(dāng)中,僅、和與擬桿菌標(biāo)記物表現(xiàn)出較好的相關(guān)性(<0.05).但僅有與標(biāo)記物在有氧和厭氧環(huán)境中的相關(guān)性系數(shù)較為接近(0.913～0.953),因此擬桿菌標(biāo)記物可作為的指示物用于健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.

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The stability of microbiological indicators in aerobic and anaerobic environment.

ZHANG Yang1, ZHENG Qian-xing1,2, WU Ren-ren1*, LI Guo-dong1, ZHONG Yi1**, CHENG Zhong-ying1, WEI Si-ye1, LI Kai-ming1

(1.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China；2.Faculty of Environment Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)., 2022,42(3)：1327～1334

We investigated the variations of pig-associated genetic markers, several microbiological indicators and potential pathogens in anaerobic and aerobic treatments using qPCR and Illumina sequencing methods. The six indicators (Streptococcaceae、Lactobacillaceae、Carnobacteriaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae and Prevotellaceae) had a similar decay trend in anaerobic and aerobic treatments, but these taxa persisted longer in anaerobic than aerobic treatments. Hence, the six indicators all can be used for identifying the recent pollution issues in aerobic water environment. The genetic markers including GenBac and Pig-2-Bac showed biphasic decay model in both aerobic and anaerobic treatments, and the first decay stage contributed the majority decay. However, the decay rates of genetic markers were significantly higher in aerobic than anaerobic treatments, which suggests the poor stability of the markers in aerobic water environment. For the identified potential pathogens, thegenetic markers presented higher correlation with,and(<0.05), but onlyshowed similar correlation coefficient in both anaerobic and aerobic treatments (0.913～0.953), which demonstrate the usefulness of thegenetic markers for predicting the presence of.

fecal pollution；microbial source tracking (MST)；genetic markers；indicators；stability

X172

A

1000-6923(2022)03-1327-08

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,助理研究員,博士,主要從事環(huán)境微生物研究.發(fā)表論文7篇.

2021-08-09

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2020A1515011109);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(202002030377);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)(PM-zx703-202104-070,PM-zx703-202104-128,PM-zx703-202104-064)

*責(zé)任作者, 正高級(jí)工程師, wurenren@scies.org;**高級(jí)工程師, zhongyi@scies.org