盧盛娟 鄧木英 莫國君 雷丹青 夏愛軍 孫 潔 鐘大妮 譚曉虹 岑 洪 廖成成

(1 前海人壽廣西醫(yī)院藥學部，廣西南寧市 530200，電子郵箱：424039059@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學生命科學研究院，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥學部，南寧市 530007；4 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院淋巴血液腫瘤內科，南寧市530021)

B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin′s lymphoma，B-NHL)是一類最常見、最具侵襲性的淋巴系統(tǒng)腫瘤，占非霍奇金淋巴瘤確診病例的30%～58%[1]。它的形態(tài)學和遺傳學具有較明顯的異質性，早期癥狀不明顯，且缺乏有效的治療策略，患者預后不良[2]。雖然淋巴瘤化療已經(jīng)進入靶向藥物及免疫特異性治療時代，但蒽環(huán)類腫瘤化療藥物依舊是B-NHL化療的基石。研究證實，采用單純藥物治療B-NHL患者的治愈率不到40%[3]。因此，迫切需要尋找新的生物標志物預測B細胞淋巴瘤的侵襲性和預后。

近年來已有研究表明，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)可通過多種機制對細胞功能進行調控[4-5]。LncRNA HOX轉錄反義RNA有可能通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/活化B細胞κ輕鏈增強子的核因子途徑促進彌漫性大B淋巴瘤細胞的增殖和抗凋亡能力，并且與淋巴瘤患者的預后較差密切相關[6]。有學者在基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中對1 659例彌漫性大B淋巴瘤患者的基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)了多個與患者預后密切相關的LncRNA，并且LncRNA相關的信號通路以細胞凋亡通路為主[7]。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫篩選與B-NHL預后相關的LncRNA，探討敲低LINC01410的表達對B-NHL細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及器材 B-NHL Raji、Ramos細胞系(南京翼飛雪生物，批號：YCL-0189、YCL-0483)；外周血單個核細胞[peripheral blood mononuclear cell，PBMC；廣州雷德倍爾公司LDEBIO，批號：1501-HLA(A0201)]；Gibco胎牛血清(美國Life公司，批號：10091130)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基(南京建成科技，批號：P001-3)；1640培養(yǎng)基(南京建成科技，批號：P004-3)；慢病毒載體SV40(上海吉凱基因，批號：POSE0051)；慢病毒包裝質粒(上海吉凱基因，批號：POSE2975)；多柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：2102E1)；細胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒(AAT Bioquest，批號：TJ35000)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒(TaKaRa公司，批號：630109)；NucleoZOL 試劑(上海GENE公司，批號：740404.200)；逆轉錄試劑盒和SYBR實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，批號：GSAE0219793、RR420A)；兔抗多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]多克隆抗體(美國CST公司，批號：9542S)；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(美國Proteintech公司，批號：10494-1-AP)及熒光標記的山羊抗兔IgG(美國LI-COR公司，批號：926-32211)。倒置相差熒光顯微鏡(Olympus公司，型號：1600004S)；實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號：StepOne)；流式細胞儀(BD LSRFortessa，型號：FACSCaibur)。

1.2 生物信息學分析 B-NHL表達譜數(shù)據(jù)集(GSE10846)下載自GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，數(shù)據(jù)集中共有420例B-NHL患者的資料，收集以上患者的一般情況、治療情況和預后信息。所有生物信息學分析均采用R語言。LncRNA注釋信息(gencode.v26.long_noncoding_RNAs.gtf)來源于Gencode數(shù)據(jù)庫V26(http://www.gencodegenes.org/releases/current.html)。通過Cox回歸模型計算出各個LncRNA的風險比及其95%可信區(qū)間，按照風險比降序展示前30個LncRNA(風險比均>1)。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR 法檢測PBMC和B-NHL細胞系中LINC01410的RNA相對表達水平[8]：按照NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_121647.1)中人LINC01410和GAPDH (內參)的基因全序列設計引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物并完成鑒定，引物序列見表1。采用NucleoZOL法提取PBMC、Raji和Ramos的總RNA。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書，分別取各組細胞總RNA 1 μg進行逆轉錄，合成cDNA，再按照定量 PCR 試劑盒說明書，分別以cDNA為模板加入反應體系，上機檢測。以上操作均在冰上進行。反應體系： cDNA 1 μL，2×SYBR Green PCR Mastermix 8 μL，上下游引物各0.8 μL，加入無酶水至20 μL。反應程序：95℃變性1 min，95℃退火15 s，61℃延伸45 s，擴增40個循環(huán)。每個樣本重復檢測3次，采用2-△△Ct法分析LINC01410的RNA相對表達水平。

表1 實時熒光定量PCR引物設計

1.3.2 LINC01410敲低B-NHL細胞系的建立：將慢病毒空載體SV40和慢病毒sh-LINC01410載體質粒分別插入慢病毒包裝質粒中，形成慢病毒空載體和LINC01410敲低包裝的慢病毒(sh-NC組和sh-LINC01410組)，先于Raji、Ramos細胞中加入1.5 μL感染劑，再加500 μL慢病毒感染Raji、Ramos細胞96 h后，在綠色熒光顯微鏡下觀察轉染情況，并用嘌呤霉素篩選感染后的Raji、Ramos細胞，嘌呤霉素的篩選濃度為1/5 000，培養(yǎng)24 h,獲得細胞轉染率不隨時間延長而降低的穩(wěn)轉株。采用PCR法檢測各細胞系中LINC01410 RNA的相對表達水平，方法同1.3.1。實驗重復3次。

1.3.3 實驗分組：將Raji和Ramos細胞分別隨機分為慢病毒對照組、LINC01410敲低組、多柔比星組、LINC01410敲低+多柔比星組。(1)慢病毒對照組：sh-NC+二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；100 μL)；(2)LINC01410敲低組：sh-LINC01410+DMSO(100 μL)；(3)多柔比星組：sh-NC+多柔比星(100 ng/mL,100 μL)；(4)LINC01410敲低+多柔比星組：sh-LINC01410+多柔比星(100 ng/mL,100 μL)。各組均于37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。

1.3.4 CCK-8法檢測LINC01410對B-NHL細胞活力的影響[8]：取Raji和Ramos細胞系各組細胞，以4×103個/孔的密度接種到96孔板中。每孔加入CCK-8溶液20 μL，恒溫37℃孵育2 h后，將96孔板置于酶標儀中，振蕩溶解10 min，檢測450 nm波長處各孔的吸光度值(A450)，實驗重復3次。以慢病毒對照組為對照組，其余組為實驗組，計算細胞活力。細胞活力=(實驗組A450-對照組A450)/對照組A450×100%。

1.3.5 流式細胞術檢測LINC01410對B-NHL細胞凋亡的影響[8]：取Raji、Ramos細胞系各組細胞，以1×105個/孔接種到24孔板中，置于5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液加入1.5 mL離心管中，并用PBS洗滌兩次，2 min/次，取500 μL結合緩沖液重懸細胞。每管依次加入8 μL Annexin V-FITC和8 μL PI，輕柔充分混勻后，室溫避光孵育15 min，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.3.6 蛋白質免疫印跡法檢測B-NHL細胞中PARP蛋白的相對表達水平：取Raji、Ramos細胞系各組細胞，加入 100～200 μL含1%苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀測定蛋白裂解液(Biosharp公司，批號：BL504A，現(xiàn)配現(xiàn)用)，冰上充分裂解30 min。吸取150 μL混合液轉移至1.5 mL EP管中，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，即細胞總蛋白。使用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。分別取30 μg蛋白進行電泳、轉膜、封閉、掃膜，再加入6 mL PARP抗體(稀釋比例1 ∶2 000)，4℃孵育過夜。第2天加入熒光標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1 ∶10 000)室溫避光振搖孵育 1 h。采用雙色紅外成色系統(tǒng)掃膜。以GAPDH作為內參，使用Image J軟件通過分析條帶灰度值計算PARP蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法計算總生存率，組間比較采用log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用SynergyFinder軟件包分析協(xié)同作用，synergy值>10提示有協(xié)同作用。

2 結 果

2.1 LncRNA表達和B-NHL患者總生存期之間的風險比分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫共鑒定出GSE10846轉錄本LncRNA 13 208個。運用Cox回歸模型對LncRNA的表達量與患者總生存期之間的風險比進行分析，結果顯示前30個高風險比的LncRNA的風險比范圍為2.41～20.80，其中LINC01410的風險比為2.51。見圖1。

圖1 LncRNA表達和B-NHL患者總生存期之間的風險比分析(前30個)

2.2 PBMC和B-NHL細胞系Raji、Ramos中LINC01410 RNA相對表達水平的比較 淋巴瘤細胞系Raji、Ramos中LINC01410 RNA的相對表達水平高于PBMC，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 在PBMC和B-NHL細胞系Raji、Ramos中LINC01410 RNA相對表達水平的比較(x±s)

2.3 慢病毒感染B-NHL細胞后LINC01410 RNA的相對表達情況 在Raji、Ramos細胞系中，sh-LINC01410組的LINC01410 RNA表達水平均較sh-NC組降低(均P<0.05)，表明成功構建低表達LINC01410的B-NHL細胞。見表3。

表3 慢病毒感染B-NHL細胞后LINC01410 RNA的相對表達情況(x±s)

2.4 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞活力的影響 在Raji、Ramos細胞系中，慢病毒對照組、LINC01410敲低組、多柔比星組和LINC01410敲低+多柔比星組的細胞活力依次降低(均P<0.05)。見表4。且100 ng/mL多柔比星與sh-LINC01410共同作用對Raji、Ramos細胞活性的抑制作用最大，協(xié)同分數(shù)分別為14.100、17.376。見圖2。

表4 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞活力的影響(x±s，%)

圖2 多柔比星、sh-LINC01410及其聯(lián)合作用對B-NHL細胞活力的影響

2.5 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞凋亡的影響 在Raji、Ramos細胞系中，慢病毒對照組、LINC01410敲低組、多柔比星組、LINC01410敲低+多柔比星組的細胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。見表5及圖3。

表5 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞凋亡的影響(x±s,%)

圖3 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞凋亡的影響

2.6 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞中PARP蛋白表達的影響 Raji細胞系中， LINC01410敲低組和慢病毒對照組的PARP蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而Ramos細胞中，LINC01410敲低組的PARP蛋白相對表達水平均較慢病毒對照組升高(P<0.05)。在Raji和Ramos細胞系中，多柔比星組與LINC01410敲低+多柔比星組的PARP蛋白相對表達水平均較慢病毒對照組升高，LINC01410敲低+多柔比星組的PARP蛋白相對表達水平較多柔比星組升高(均P<0.05)。見表6和圖4。

表6 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞中PARP蛋白相對表達水平的影響(x±s)

圖4 多柔比星、sh-LINC01410及二者聯(lián)合作用對B-NHL細胞中PARP蛋白相對表達水平的影響

2.7 LINC01410基因的表達對侵襲性B-NHL患者生存率的影響 根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集(GSE108460)中B-NHL患者的LncRNA表達譜，以LINC01410表達量中位數(shù)為界，高于中位數(shù)者為高表達(或過表達)，低于中位數(shù)者為低表達，通過Kaplan-Meier生存分析可知，LINC01410過表達的B-NHL患者的中位生存時間為4.7年，而LINC01410低表達者各時間點的生存率均大于50%，尚無法估計中位生存時間，LINC01410過表達者的生存時間短于LINC01410低表達者(P=0.0078)。見圖5。

圖5 Kaplan-Meier生存分析

3 討 論

B-NHL可通過化療或免疫化療治愈且治愈率相對較高，但仍有部分患者的療效欠佳或治療后復發(fā)，其主要原因是腫瘤異質性引起耐藥[9]。目前尚未發(fā)現(xiàn)治療B-NHL的特定靶基因。LncRNA在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到關鍵作用，故受到越來越多的關注。不同于微小RNA，LncRNA的轉錄本大于200 nt，能夠更加穩(wěn)定地存在于細胞中，但不編碼下游蛋白質。哺乳動物中LncRNA轉錄本數(shù)量超過蛋白編碼RNA的數(shù)十倍[10]，這提示LncRNA在疾病，尤其是腫瘤疾病的發(fā)生中所起的作用遠超出預期，因此對LncRNA的研究是當前腫瘤研究的重要方向[11]。研究證實[12]，LncRNA能夠通過多種機制對細胞功能進行調控：LncRNA能作為順式作用元件直接影響下游基因的表達，或者通過形成RNA-RNA、RNA-DNA復合物影響目的基因的表達，還能通過RNA 干擾機制降解mRNA。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出30個與B-NHL預后高度相關的LncRNA，分析這30個LncRNA與B-NHL患者總生存時間的關系，篩選出高風險比的LINC01410，此外，LINC01410 RNA在B-NHL Raji、Ramos細胞系中的相對表達水平高于PBMC(均P<0.05)，這些結果表明LINC01410是淋巴瘤發(fā)生和發(fā)展的重要生物標志物。

研究發(fā)現(xiàn)，LINC01410為消化道腫瘤的促進分子，其可通過靶向微小RNA-532激活核因子κB通路，上調核因子κB的表達，進而上調LINC01410的表達，而核因子κB通路可能在胃癌耐藥機制中起著至關重要的作用，其主要原因可能是LINC01410能促進胃癌血管的生成和轉移[13]。另一項研究表明，LINC01410可通過促進結腸上皮細胞系HT-29、HCT116細胞的增殖和侵襲進而對結腸產(chǎn)生致癌作用[14]。然而，在淋巴瘤方面尚無LINC01410的相關報道。本研究結果顯示，LINC01410敲低后，Raji和Ramos細胞活力明顯降低，給予多柔比星干預后細胞活力降低更明顯，當多柔比星與sh-LINC01410共同作用時，細胞活力降至最低，表明敲低LINC01410能抑制B-NHL細胞增殖，且LINC01410敲低后的B-NHL細胞經(jīng)多柔比星干預后，增殖抑制作用更明顯?？傊?，敲低LINC01410能減弱B-NHL細胞系的增殖能力，與多柔比星聯(lián)用能對多柔比星的化療殺傷起增效作用。

本研究結果還顯示，敲低LINC01410能促進B-NHL細胞系Raji和Ramos細胞的凋亡，多柔比星和sh-LINC01410二者聯(lián)合作用時促凋亡效果更明顯。但是，敲低LINC01410前后Raji細胞的PARP蛋白相對表達水平變化并不明顯，而在敲低LINC01410后，或與多柔比星共同作用下，Ramos細胞中PARP蛋白相對表達水平均明顯升高。以上結果表明敲低LINC01410能協(xié)同多柔比星，通過上調PARP蛋白相對表達水平促進B-NHL細胞凋亡。這可能與LncRNA可通過多種調節(jié)機制在細胞的轉錄、轉錄后水平及染色體修飾等方面發(fā)揮調節(jié)作用有關[15]。

本研究結果顯示，LINC01410高表達的B-NHL患者的中位生存時間僅有4.7年，而LINC01410低表達者5年生存率大于70%，高于既往臨床實驗總體的5年生存率(50%)[16]，這說明LINC01410或可作為預測B-NHL患者預后的指標，及時區(qū)分出難治復發(fā)性或多柔比星耐藥的患者，為精準治療及進一步尋找多柔比星耐藥的關鍵靶點提供理論基礎。

綜上所述，LINC01410過表達提示B-NHL患者預后不良。敲低LINC01410可上調凋亡蛋白PARP的相對表達水平，促進B-NHL細胞凋亡，抑制B-NHL細胞活力，且其與多柔比星聯(lián)用可產(chǎn)生增效協(xié)同作用。