黃 莉， 林麗娥， 符祥俊， 郭 麗， 孟 燦

(海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院血液內(nèi)科， 海南 ?？?570311)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是來(lái)源于髓系造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病，臨床以正常造血抑制、組織器官浸潤(rùn)等為主要癥狀[1]。當(dāng)前，多種強(qiáng)效化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用是臨床AML治療的主要手段，但老年AML患者免疫力普遍較低，無(wú)法耐受強(qiáng)效化療藥物，在一定程度上影響了治療療效[2]。若能對(duì)老年患者進(jìn)行綜合性的評(píng)估，擬定個(gè)體化治療方案，將有利于老年患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，AML在細(xì)胞遺傳學(xué)和分子水平上具有高度異質(zhì)性，而基因突變?cè)贏(yíng)ML的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后分層中發(fā)揮重要作用[3]。當(dāng)前，有關(guān)老年AML基因突變的研究多局限于個(gè)別基因，包含多種基因突變的基因突變譜與老年AML患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。本研究分析了AML患者67種基因突變的發(fā)生情況及其與患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，旨在加強(qiáng)對(duì)AML發(fā)病機(jī)制的理解，為老年AML患者臨床治療方案的制定提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年5月至2019年5月在本院接受治療的AML(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)患者117例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床檢查符合AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且均經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及免疫學(xué)檢查確診：外周血或骨髓原始細(xì)胞≥20%、存在克隆性重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常、2個(gè)髓系免疫表型陽(yáng)性且淋系標(biāo)記<2個(gè)或髓過(guò)氧化物(MPO，+)或非特異性酯酶(+)或丁酸鹽(+)；②患者性別不限，年齡≥60歲，均為初診確診患者；③均接受化療治療患者；④患者知情同意，均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性早幼粒細(xì)胞白血病及其他類(lèi)型白血病患者；②合并其它惡性腫瘤、血液疾病患者；③接受造血干細(xì)胞移植患者；④一般臨床資料不完整，不能定期復(fù)查患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。

1.2方 法

1.2.1一般臨床資料收集：收集患者的性別、年齡、初診時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(whtie blood count，WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)和骨髓原始細(xì)胞水平等一般臨床資料。

1.2.2AML分類(lèi)及染色體核型分析：患者就診后行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓血0.2～0.3mL涂片，進(jìn)行形態(tài)學(xué)及細(xì)胞化學(xué)染色檢查；參考法美英(France-America-British，F(xiàn)AB)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將AML患者分為M0～M7型[5]。骨髓細(xì)胞經(jīng)過(guò)24h～48h培養(yǎng)后，收集細(xì)胞常規(guī)制片，采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，根據(jù)患者染色體核型結(jié)果進(jìn)行危險(xiǎn)度分層，將AML患者分為低危核型、中危核型和高危核型。

1.2.3基因突變檢測(cè)：采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因突變檢測(cè)。取患者血液樣本，分離并收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度儀(UV240型，島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司)測(cè)定基因組DNA濃度和純度，樣品稀釋至50ng/μL備用。取樣品基因組DNA10～17ng，采用Ion Torrent檢測(cè)平臺(tái)中的Ion Ampliseq超高多重PCR靶向技術(shù)，富集112個(gè)基因血液系統(tǒng)疾病相關(guān)基因的外顯子區(qū)、UTR及靠近外顯子的部分內(nèi)含子區(qū)域。測(cè)序后數(shù)據(jù)利用dbSNP，1000genome，polyphen2，cosmic等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選和突變驗(yàn)證。

1.2.4治療方案：患者接受DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)方案、IDA(去甲柔紅霉素+阿糖胞苷)方案或以維甲酸、亞砷酸為主的初始誘導(dǎo)化療方案進(jìn)行化療。誘導(dǎo)治療后達(dá)完全緩解患者接受4個(gè)療程的鞏固化療(阿糖胞苷)；部分緩解和原始細(xì)胞下降大于50%者給予第2次誘導(dǎo)化療，2個(gè)療程后再進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，確定是否進(jìn)行鞏固化療。

1.2.5隨訪(fǎng)：對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果顯示基因突變的患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)形式包括門(mén)診定期隨訪(fǎng)、問(wèn)卷及電話(huà)隨訪(fǎng)。隨訪(fǎng)截止為出院后2年，確診之日至死亡或末次隨訪(fǎng)日期為總體生存(OS)時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(P25～P75)表示，行Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，行Fisher確切概率檢驗(yàn)，兩兩比較采用矯正檢驗(yàn)水準(zhǔn)的Bonferroni法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)；預(yù)后影響因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1AML患者一般臨床資料分析：117例患者中，男61例，女56例；中位年齡69(60～79)歲；初診時(shí)WBC中位數(shù)12.83(2.36～53.48)×109L-1，HGB中位數(shù)78.46(61.47～98.71)g/L，骨髓原始細(xì)胞中位數(shù)65.47(10.53～80.24)%；FAB分型及危險(xiǎn)度分層見(jiàn)圖1。

圖1 117例AML患者FAB分型及危險(xiǎn)度分層(A)FAB分型；(B)危險(xiǎn)度分層

2.2AML患者基因突變發(fā)生情況分析：117例患者中，108例(92.31%)患者檢查基因突變，其中單基因突變25例(21.37%)，2個(gè)基因突變共存36例(30.77%)，同時(shí)攜帶≥3個(gè)基因突變的47例(40.17%)。檢測(cè)到的基因突變共涉及67種基因，108例患者中突變檢出率≥10%的突變基因依次為NRAS突變25例(23.15%)，NPM1突變21例(19.44%)，DNMT3A突變17例(15.74%)，TET2突變16例(14.81%)，WT1突變13例(12.03%)，CEBPA突變13例(12.03%)，F(xiàn)LT3-ITD+TKD突變12例(11.11%)，GATA2突變12例(11.11%)，ASXL1突變11例(10.19%)，BCORL1突變11例(10.19%)。其他突變檢出率不足10%但大于5%的突變基因包括：IDH1、IDH2、JAK2、PTPN11、RUNX1、SETBF1、SRSF2突變9例(8.33%)，KIT、ETNK1、NF1、KRAS、SRP72、STAG2、TP53突變6例(5.56%)。突變檢出率不足5%的突變基因包括：ABL1、AKNRD26、ATM、BCOR、BRAF、CALF、CBL、CSF3R、CSMD1、CUX1、DDX41、EP300、ETV6/TEL、EZH2、GATA1、GNAS、IKZF1、JAK1、JAK3、NFE2、KMT2C/MLL3、KMT2D/MLL2/MLL4、MPL、LNK(SH2B3)、PDGFRA、NOTCH1、PHF6、PIGA、PRPF40B、PRPF8、PTEN、RAD21、ROBO1、ROBO2、SF1、SF3A1、SF3B1、SMC1A、SMC3、SUZ12、TET2、U2AF1/U2AF35、U2AF2、ZRSR2。

2.3AML患者基因突變的功能類(lèi)型分布：將突變檢出率≥5%的突變基因按照功能進(jìn)行聚類(lèi)分析，常見(jiàn)突變基因涉及的通路包括：表觀(guān)遺傳學(xué)(占57.41%，包括：DNMT3A、TET2、ASXL1、IDH1、IDH2)，信號(hào)通路(占50.93%，包括：NRAS、JAK2、PTPN11、KIT、KRAS)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(占49.07%，包括：WT1、CEBPA、GATA2、RUNX1、STAG2)，細(xì)胞增殖或凋亡(占25.00%，包括：NPM1、TP53)，剪切因子(占8.33%，包括：SRSF2)，其他(占35.19%)。

2.4部分基因突變與AML患者臨床特征之間的關(guān)系：NRAS基因突變患者HGB水平低于無(wú)突變患者(P<0.05)，NPM1基因突變WBC水平高于無(wú)突變患者(P<0.05)；DNMT3A基因突變患者WBC、HGB和髓原始細(xì)胞水平與無(wú)突變患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 部分基因突變與AML患者臨床特征之間的關(guān)系[M(P25～P75)]

2.5部分基因突變與AML患者染色體核型危險(xiǎn)度分層之間的關(guān)系：NPM1、DNMT3A基因突變?cè)谥形；颊咧械臋z出率高于低、高?；颊?P<0.05)，NRAS基因突變?cè)诘臀！⒅形：透呶；颊咧械臋z出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同染色體核型危險(xiǎn)度分層患者的部分基因突變檢出情況n(%)

2.6基因突變AML患者預(yù)后情況分析：108例AML患者的中位OS為8個(gè)月，兩年累計(jì)生存率為45.37%。NPM1基因突變患者的兩年累計(jì)生存率為66.67%，較無(wú)突變患者(40.23%)高(χ2=4.770，P=0.029)；DNMT3A基因突變患者的兩年累計(jì)生存率為23.53%，較無(wú)突變患者(49.45%)低(χ2=3.949，P=0.038)；NRAS基因突變患者與無(wú)突變患者的兩年累計(jì)生存率(36.00%vs.48.19%)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.080，P=0.216)?；蛲蛔償?shù)目≥3個(gè)患者的兩年累計(jì)生存率為31.91%(15/47)，基因突變數(shù)目<3個(gè)的患者(55.74%，34/61)低(χ2=5.806，P=0.012)，見(jiàn)圖2。

圖2 AML患者的總生存曲線(xiàn)

2.7基因突變與患者OS之間的關(guān)系：多因素分析結(jié)果顯示，NPM1基因未突變、DNMT3A基因突變、基因突變數(shù)目≥3個(gè)與AML患者較差OS相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 基因突變與患者OS之間的關(guān)系

3 討 論

既往研究表明，與年輕成人AML患者相比，老年AML患者的具有的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)預(yù)后不良因素比例較高，臨床療效明顯較差，了解老年AML患者的基因突變特征可為進(jìn)一步理解老年AML的生物學(xué)特點(diǎn)及指導(dǎo)臨床治療提供可靠依據(jù)[6]。近年來(lái)，基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為臨床分析AML的基因突變提供了便利，越來(lái)越多具有臨床意義的基因突變被發(fā)現(xiàn)[7]。本研究應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)分析了老年AML患者的基因突變情況，研究結(jié)果顯示，117例AML患者中，基因突變檢出率達(dá)92.31%，且以同時(shí)攜帶≥3個(gè)基因突變的檢出率最高，與既往研究[8]結(jié)果類(lèi)似，提示AML患者基因突變發(fā)生率較高，大部分患者至少攜帶1個(gè)基因突變。

3.1AML患者基因突變發(fā)生情況分析:本研究中，檢測(cè)到的基因突變共涉及67種基因，其中突變檢出率≥10%的突變基因依次為NRAS、NPM1、DNMT3A、TET2、WT1、CEBPA，F(xiàn)LT3-ITD+TKD、GATA2、ASXL1和BCORL1。Prassek等[9]分析了75歲以上老年AML患者的基因突變譜，發(fā)現(xiàn)患者基因突變個(gè)數(shù)的中位數(shù)是4個(gè)，且以TET2、DNMT3A、NPM1、SRSF2和ASXL1基因?yàn)樽畛Ｒ?jiàn)的突變基因，與本研究結(jié)果存在差異，考慮與納入對(duì)象年齡不同、不同人種基因突變頻率不同有關(guān)。呂曉東等[10]在有關(guān)AML患者克隆異質(zhì)性的研究中指出，AML患者檢出的突變基因主要以信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因、表觀(guān)遺傳相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因?yàn)橹?，認(rèn)為疾病早期出現(xiàn)異?；蛞讓?dǎo)致基因表觀(guān)遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等遺傳信息的不穩(wěn)定性，易造成克隆異質(zhì)性，影響疾病進(jìn)展及預(yù)后。本研究也發(fā)現(xiàn)，AML相關(guān)基因突變主要涉及的通路有表觀(guān)遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖或凋亡和剪切因子等，與既往研究結(jié)果類(lèi)似。

3.2部分基因突變對(duì)AML患者臨床特征及預(yù)后的影響:為明確基因突變與AML患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，本研究選擇性分析了NRAS、NPM1和DNMT3A基因與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，NRAS基因突變患者HGB水平低于無(wú)突變者，NPM1基因突變患者WBC水平高于無(wú)突變者；NPM1、DNMT3A基因突變?cè)谥形；颊咧械臋z出率高于低、高?；颊撸崾綨RAS、NPM1和DNMT3A基因突變與AML患者的臨床特征存在相關(guān)性。NRAS基因可編碼膜蛋白，是一種可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的“分子開(kāi)關(guān)”，其外顯子及密碼子的錯(cuò)義突變參與了AML的發(fā)生發(fā)展，而在A(yíng)ML發(fā)展過(guò)程中，患者骨髓造血功能出現(xiàn)障礙，使機(jī)體不能造血，最終影響WBC、HGB等水平。李甜甜等[11]分析了NRAS基因突變?cè)诔扇薃ML患者中的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)合并NRAS基因突變的患者其HGB水平較無(wú)突變者低。NPM1基因位于人類(lèi)染色體5q35上，可以伴侶蛋白的形式促使核糖體合成，并經(jīng)由抑癌基因p53等調(diào)控細(xì)胞增殖及調(diào)控。肖蓉等[12]報(bào)道在老年急性非早幼粒細(xì)胞白血病患者中，NPM1基因突變陽(yáng)性患者的WBC水平顯著高于NPM1基因突變陰性患者，認(rèn)為NPM1基因突變與CD34、CD117低表達(dá)相關(guān)，患者免疫功能下降，進(jìn)而影響WBC的水平。也有研究發(fā)現(xiàn)，NPM1、DNMT3A基因突變與患者染色體核型危險(xiǎn)度分層之間無(wú)相關(guān)性，可能與患者年齡組成、遺傳學(xué)危險(xiǎn)分組及構(gòu)成不同有關(guān)[13]。進(jìn)一步分析不同基因突變患者的預(yù)后情況可知，NPM1基因未突變、DNMT3A基因突變、基因突變數(shù)目≥3個(gè)與AML患者較差OS相關(guān)，提示基因突變數(shù)目和類(lèi)型與AML患者OS存在明顯相關(guān)性，因此推測(cè)NPM1、DNMT3A等基因突變與基因突變數(shù)目可增加AML患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)度，而NPM1基因突變可能與良好預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，AML患者基因突變率較高，基因突變數(shù)目和類(lèi)型與患者臨床特征、預(yù)后相關(guān)，評(píng)估患者基因突變特征可為AML的疾病診斷、治療選擇及風(fēng)險(xiǎn)分層提供有效的參考信息。