王 帥， 常 穎， 席光偉， 沈 娜

(航天中心醫(yī)院口腔科， 北京 100049)

正畸指矯正牙齒，解除錯(cuò)合畸形[1]。隨著錯(cuò)合畸形發(fā)病率的升高，更多的患者為了牙齒美觀而選擇正畸治療來促進(jìn)牙齒移動(dòng)，改變牙齒排位[2]。然而牙齒正畸過程中，牙槽骨改建移動(dòng)到新的位置耗時(shí)較久，這嚴(yán)重阻礙了患者對(duì)正畸治療的接受度和配合度[3]。故如何運(yùn)用安全有效的方法促進(jìn)牙移動(dòng)，縮短正畸治療的時(shí)間，是大多數(shù)正畸醫(yī)師研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。近來研究發(fā)現(xiàn)，正畸牙在牙槽骨改建移動(dòng)過程中，破骨細(xì)胞分化成熟及功能調(diào)節(jié)可促進(jìn)正畸牙移動(dòng)[4]。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)可抑制核因子κB受體活化因子配體(RANKL)與核因子κB受體活化因子(RANK)結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活化，從而影響破骨細(xì)胞的吸收并參與正畸牙牙槽骨的改建和移動(dòng)[5]。β-隱黃素是從柑橘、南瓜和紅辣椒等水果和蔬菜中攝取的類胡蘿卜素物質(zhì)，具有改善脂質(zhì)代謝，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，以及阻止癌變等藥理作用[6]，但近來研究發(fā)現(xiàn)，β-隱黃素可上調(diào)OPG/RANKL比值，阻止成熟破骨細(xì)胞的形成，抑制牙周炎大鼠牙槽骨的吸收[7]。本研究推測(cè)，β-隱黃素可能對(duì)正畸牙治療過程中牙槽骨改建及破骨細(xì)胞吸收具有一定的影響，故本研究建立大鼠正畸牙移動(dòng)模型，采用β-隱黃素進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)正畸牙移動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠[10～12周齡，體重(320±10)g]，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2019-0006]。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，人工照明12h。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器:β-隱黃素(原料藥，純度99%，批號(hào)：472-70-8，廈門研科生物技術(shù)有限公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：R20570、R20432、R21250，上海源葉生物科技有限公司)；蛋白提取試劑盒(批號(hào)：P0033，碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鼠RANKL單克隆抗體(批號(hào)：11682-R128，北京義翹神州科技股份有限公司)；兔抗鼠RANK單克隆抗體(批號(hào)：bs-7343R-1，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔抗鼠OPG單克隆抗體(批號(hào)：WL02078，沈陽萬類生物科技有限公司)；兔抗鼠β-actin單克隆抗體(批號(hào)：CB100127M，北京西美杰科技有限公司)；羊抗鼠二抗(批號(hào)：SN134，南京生興生物技術(shù)有限公司)；電子游標(biāo)卡尺(型號(hào)ACE101-150，東莞市塘廈愛測(cè)易電子儀器廠)；顯微鏡(型號(hào)CMY-210，南京南派科技有限公司)；蛋白電泳儀、凝膠成像儀(型號(hào)1658033、170-8270，美國(guó)Bio-Rad公司)等。

1.2方 法

1.2.1大鼠正畸牙移動(dòng)模型建立及分組給藥:將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為：正常組、模型組、β-隱黃素低(3μg)、中(6μg)、高(12μg)劑量組[7]，每組10只。除正常組外，其余各組參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建大鼠正畸牙移動(dòng)模型，具體操作方法為：將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，精確制取大鼠上頜牙印模，并用石膏灌模后，于雙側(cè)上頜第一磨牙及切牙同一水平磨0.3mm深的固位溝，并于上頜前牙與第一磨牙之間安裝鎳鈦拉簧，測(cè)量力值約40g，用0.25mm正畸結(jié)扎絲結(jié)扎上頜兩切牙后，用牙釉質(zhì)粘結(jié)劑輔助粘接加強(qiáng)固定，定期檢查矯治器情況，如有脫落及時(shí)補(bǔ)救。安裝矯治器后第1天開始給藥，β-隱黃素低、中、高劑量組分別于大鼠左側(cè)上頜第一磨牙近中牙齦黏膜下注射3μg、6μg、12μg的β-隱黃素(將β-隱黃素用生理鹽水配制成濃度分別為0.25g/L、0.5g/L、1g/L的溶液，注射體積12μL)；正常組和模型組注射12μL生理鹽水；每2天給藥1次，連續(xù)給藥28d。

1.2.2各組大鼠正畸牙移動(dòng)距離檢測(cè):各組大鼠均于末次給藥24h后，精確制取上頜印模，進(jìn)行石膏灌模，并用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量石膏模型上，雙側(cè)上頜第一磨牙近中面到上頜切牙遠(yuǎn)中面的距離，取三次平均值。正畸牙移動(dòng)距離(上頜第一磨牙近中移動(dòng)距離)(mm)=牙移動(dòng)前距離-牙移動(dòng)后距離。

1.2.3各組大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE及TRAP染色:各組大鼠在做完正畸牙移動(dòng)距離后，處死，取雙側(cè)上頜第一磨牙牙根處牙周膜及牙槽骨組織，將左側(cè)組織剪碎混勻，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，其右?cè)組織立即放入4%多聚甲醛中固定24h后，置于10%乙二胺四乙酸中進(jìn)行脫鈣(6～8周)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，制備成約4μm厚的切片，按試劑盒說明書分別行HE和TRAP染色，觀察組織變化。

1.2.4各組大鼠牙根破骨細(xì)胞計(jì)數(shù):取1.2.3項(xiàng)下的TRAP染色切片，隨機(jī)選取5張，在牙根處選取5個(gè)陽性視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野壓力側(cè)及張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值。TRAP染色中破骨細(xì)胞的胞質(zhì)呈粉紅至深紅色為陽性。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測(cè)RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá):取1.2.3項(xiàng)下-80℃保存左側(cè)組織，解凍后用組織勻漿機(jī)碾碎勻漿、離心去上清液，蛋白提取試劑盒提取蛋白，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，脫脂奶封閉2h，加入一抗[RANKL(1∶1000)、RANK(1∶1000)、OPG(1∶1000)、β-actin(1∶2000)]孵育過夜，加入二抗(1∶5000)孵育2h，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像儀拍照，以Image-J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1β-隱黃素對(duì)大鼠正畸牙移動(dòng)距離的影響:與正常組相比，模型組大鼠正畸牙移動(dòng)距離升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠正畸牙移動(dòng)距離升高(P<0.05)，且β-隱黃素各劑量組大鼠正畸牙移動(dòng)距離呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠正畸牙移動(dòng)距離比較

2.2β-隱黃素對(duì)大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE染色形態(tài)的影響:HE染色顯示：正常組大鼠牙周組織及牙槽骨結(jié)構(gòu)正常；與正常組相比，模型組大鼠壓力側(cè)牙周間隙變窄，牙槽骨表面可見多個(gè)破骨細(xì)胞于骨吸收陷窩內(nèi)，且骨吸收陷窩逐漸融合，而張力側(cè)牙周韌帶增寬，可見成骨反應(yīng)，成骨細(xì)胞排列在新生骨周圍；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組張力側(cè)新骨形成逐漸明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE染色圖(200×)

2.3β-隱黃素對(duì)大鼠壓力側(cè)及張力側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)目的影響:破骨細(xì)胞前體TRAP染色為紅色。TRAP染色可見，正常組TRAP紅色較淺；模型組壓力側(cè)及張力側(cè)多核破骨細(xì)胞前體TRAP染色呈強(qiáng)陽性，且壓力側(cè)TRAP染色較張力側(cè)深；β-隱黃素低、中、高劑量組壓力側(cè)TRAP染色呈強(qiáng)陽性，張力側(cè)TRAP染色呈弱陽性。見圖2、圖3。與正常組相比，模型組大鼠壓力側(cè)及張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠壓力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目降低(P<0.05)，且β-隱黃素各劑量組大鼠張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見表2。

圖2 各組大鼠壓力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞TRAP染色圖(400×)

圖3 各組大鼠張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞TRAP染色圖(400×)

表2 各組大鼠壓力側(cè)及張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目比較

2.4β-隱黃素對(duì)大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá)水平比較:與正常組相比，模型組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá)水平及RANKL/OPG比值均升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，RANKL/OPG比值降低(P<0.05)，RANK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且β-隱黃素各劑量組RANKL、OPG蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性升高(P<0.05)，RANKL/OPG比值呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白印跡圖

表3 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL RANK OPG蛋白表達(dá)水平及RANKL/OPG比值比較

3 討 論

正畸牙移動(dòng)的本質(zhì)是牙周膜重塑和牙槽骨重建過程[9]。壓力側(cè)牙槽骨吸收，張力側(cè)牙槽骨形成，是正畸牙移動(dòng)、牙槽骨改建的重要機(jī)制[10]。破骨細(xì)胞是參與牙槽骨吸收的唯一細(xì)胞，其在壓力側(cè)牙槽骨中數(shù)目增多可促進(jìn)牙槽骨吸收，加快牙齒移動(dòng)，但在張力側(cè)數(shù)目增多，則不利于張力側(cè)牙槽骨骨形成及重塑，而易導(dǎo)致骨丟失、牙齒松動(dòng)及脫落[11]。β-隱黃素可調(diào)控成骨細(xì)胞骨形成，及破骨細(xì)胞骨吸收活性，來預(yù)防骨組織喪失、促進(jìn)骨組織重建，并緩解牙周炎作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，β-隱黃素干預(yù)劑量越高，大鼠正畸牙移動(dòng)距離越高，張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目降低越明顯，新骨形成也較模型組明顯，而壓力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目與模型組相比無明顯變化，提示β-隱黃素加速正畸牙移動(dòng)作用，可能是通過抑制張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞活性，加速牙槽骨沉積作用來完成的。

RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路是連接成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞信號(hào)傳遞，影響骨代謝，參與牙周膜重塑和牙槽骨重建的關(guān)鍵通路。RANKL可與RANK結(jié)合促進(jìn)破骨前體細(xì)胞形成、成熟及分化，成熟的破骨細(xì)胞可產(chǎn)生鹽酸溶解骨礦物質(zhì)，啟動(dòng)骨吸收，形成骨窩陷；OPG是成骨分化因子，其N端的D1-D4功能區(qū)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，阻斷RANKL與RANK結(jié)合而抑制破骨細(xì)胞骨吸收過量，利于牙根穩(wěn)定[13]。大量文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在牙槽骨吸收活躍區(qū)域，上調(diào)OPG表達(dá)，改變RANKL/OPG比值，可維持牙槽骨重建中骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，張瑞林等[14]發(fā)現(xiàn)RANKL/OPG比值控制在2.33以內(nèi)，可使正畸牙有效移動(dòng)并防止牙根過量吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)均較模型組升高，RANKL/OPG比值回降至正常水平，但RANK蛋白變化不明顯，推測(cè)β-隱黃素藥物作用，可能通過上調(diào)OPG表達(dá)，來競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，從而使RANKL與RANK結(jié)合受抑制，達(dá)到促進(jìn)RANKL/OPG破骨骨吸收及成骨形成的動(dòng)態(tài)平衡的目的，這就解釋了β-隱黃素干預(yù)治療后張力側(cè)牙槽骨表面破骨細(xì)胞數(shù)目減少，正畸牙移動(dòng)距離較大的原因。

綜上所述，β-隱黃素可能通過上調(diào)RANKL及OPG表達(dá)，降低RANKL/OPG比值，阻斷RANKL與RANK結(jié)合，促進(jìn)矯正牙移動(dòng)，抑制破骨細(xì)胞進(jìn)一步活化，來維持牙周膜重塑和牙槽骨重建中成骨形成與破骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡。為臨床闡明正畸牙移動(dòng)的分子機(jī)制和β-隱黃素的開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考。但β-隱黃素調(diào)控破骨骨吸收及成骨形成動(dòng)態(tài)平衡的作用機(jī)制還需用通路抑制劑來進(jìn)一步驗(yàn)證。