金朝霞， 徐成勝

(長江大學(xué)附屬黃岡市中心醫(yī)院心內(nèi)科， 湖北 黃岡 438000)

血管鈣化(vascular calcification)是慢性腎病和慢性心血管疾病共同的顯著病理改變，也是這類疾病的致病基礎(chǔ)之一。羥基磷灰石(又稱羥磷灰石、堿式磷酸鈣異位沉積于血管壁為其病理特征[1]。血管鈣化是密切相關(guān)于心血管疾病發(fā)病率和死亡率增高的危險(xiǎn)因素，發(fā)病于80%的血管損傷患者和90%的冠狀動(dòng)脈患者中[2]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)在生長因子、機(jī)械應(yīng)激損傷下，從正常的收縮表型向成骨和軟骨表型的分化在血管鈣化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。由于血管鈣化機(jī)制尚未明確，目前有關(guān)預(yù)防和治療血管鈣化的藥物或方法未得到批準(zhǔn)，研發(fā)和臨床的血管鈣化防治目標(biāo)仍面臨長期的探索。肌肽(β-丙酰胺-L-組氨酸)是一種內(nèi)源性二肽，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物效應(yīng)，包括抗炎、抗氧化、抗糖基化、螯合金屬離子、促進(jìn)傷口愈合等，而炎癥、氧化應(yīng)激、糖基化等病理過程都是血管鈣化發(fā)生發(fā)展的誘導(dǎo)因素。然而，肌肽在血管內(nèi)的生理角色尚不清楚，以及肌肽能否抑制血管鈣化。本研究基于血管平滑肌細(xì)胞在體外由高磷誘導(dǎo)成骨向分化為基礎(chǔ)，研究肌肽對血管鈣化的影響。

1 資料與方法

1.1試劑與儀器:試劑：β-磷酸甘油(G9422)和肌肽(C9625)均購于Sigma；α-SMA抗體(博士德 BM0002)；β-catenin(51067-2-AP)、BMP-2(18933-1-AP)和Runx2(20700-1-AP)均購于Proteintech；GSK3β(Phospho-Ser9)購于Signalway(貨號(hào)11002-1)；β-actin(Santa Cruz sc-47778)；小鼠 IgM-SABC 免疫組化染色試劑盒(博士德 SA1026)；堿性磷酸酶試劑盒(南京凱基)；茜素紅S(Sigma，A5533)；BCA定量試劑盒(武漢啟動(dòng)子)；Ⅱ型膠原酶和彈力蛋白酶均購于美國Worthington Biochemical Corporation；滅菌PBS、鏈霉素/青霉素、胎牛血清、DMEM均購于Hyclone公司。儀器：倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司 XDS-1B)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(力新儀器有限公司 HF151UV)；Sunrise A5082酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)；NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀(德國Thermo 公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和Power Pac Universal電泳儀均來自美國Bio-rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級Wistar大鼠，6周齡，80～100克體重，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3原代VSMCs分離培養(yǎng)和鑒定:注射1mL 3%的戊巴比妥用以麻醉大鼠，75%酒精清潔大鼠腹部后，剪開胸腔，小心剪下大鼠胸主動(dòng)脈。無菌操作下，放入滅菌PBS中沖洗血污，在體式顯微鏡下小心去除周邊脂肪和結(jié)締組織，放置于1mg/mL Ⅱ型膠原酶中，37℃消化30 min后小心剝離血管外膜；然后用彎鑷背側(cè)小心刮去血管內(nèi)膜，最終獲得中層組織；將該組織用含10X雙抗的滅菌PBS沖洗三次后，放置于含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，過夜孵育。次日，將中層組織剪成1mm3大小的組織塊，加入消化液(1mg/mL Ⅱ型膠原酶、0.5mg/mL 彈力蛋白酶)酶解90min，每隔15min無菌吹打以利于細(xì)胞脫離；結(jié)束后加入等體積含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，800rpm離心10 min，細(xì)胞沉淀用含20%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸后接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔3d換液，直至細(xì)胞長滿瓶壁，常規(guī)傳代，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4VSMCs的平滑肌細(xì)胞鑒定:取第3代VSMCs接種于6cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至80%左右密度，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗一遍后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，PBST沖洗三遍；經(jīng)5% BSA室溫封閉20min后，經(jīng)抗α-SMA一抗(1∶200)4℃雜交過夜，PBST沖洗三遍后同生物素化山羊抗小鼠IgM室溫雜交20min；最后用DAB顯色。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色陽性的細(xì)胞數(shù)量和總數(shù)量，計(jì)算陽性率。

1.5實(shí)驗(yàn)分組及處理方法:取第3代VSMCs，按照1×105/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換為新鮮的培養(yǎng)液，并分為3組：對照組(無添加)、鈣化組(10mM β-磷酸甘油誘導(dǎo))、肌肽組(10mM β-磷酸甘油誘導(dǎo)和10mM 肌肽干預(yù))。所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，每隔2d換液，連續(xù)10d。

1.6茜素紅S染色:待鈣化誘導(dǎo)和肌肽干預(yù)10d后，棄細(xì)胞上清，4%多聚甲醛固定，超純水清洗2次后，加1%茜素紅染液(pH4.1)室溫染色10min。

1.7堿性磷酸酶活性測定:處理10d后，采用組織裂解液裂解細(xì)胞，取上清進(jìn)行測定。按照說明書依次加入顯色底物、顯色劑，在酶標(biāo)儀520nm處測定各組吸光值。

1.8Western blot:加入組織裂解液裂解各組細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度，用以計(jì)算上樣所需體積；用10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)行蛋白電泳，主要參數(shù)為：恒壓80V，溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入下層膠時(shí)恒壓120V，蛋白Marker所需分子量處充分分開后，停止電泳；然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，200mA恒流轉(zhuǎn)膜2h；經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h后，用一抗4℃雜交過夜，TBST清洗三遍后，放于二抗溶液中，室溫孵育2h；TBST清洗三遍后，最后用ECL顯影、定影。

2 結(jié) 果

2.1原代大鼠VSMCs的生長狀態(tài)和鑒定:由圖1a所示，可見來源于大鼠胸主動(dòng)脈的VSMCs經(jīng)傳代培養(yǎng)后，大部分形態(tài)為梭形的貼壁細(xì)胞。低密度接種后，細(xì)胞成簇狀生長，中心區(qū)域細(xì)胞多層疊加生長，并有平滑肌細(xì)胞特有的“峰—谷”樣生長特征(圖1b)。用抗α-SMA抗體對第3代VSMCs進(jìn)行平滑肌特征鑒定，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞胞漿內(nèi)有棕褐色染色顆粒，證明培養(yǎng)細(xì)胞為VSMCs，經(jīng)顯微鏡下計(jì)數(shù)后證實(shí)，99%的細(xì)胞均為VSMCs，基本沒有內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞的污染(圖2)。

圖1 光鏡下VSMCs細(xì)胞形態(tài)

圖2 免疫組化檢測VSMCs細(xì)胞的α-SMA表達(dá)

2.2肌肽下調(diào)抑制VSMCs的成骨分化:茜素紅染料可特異性的與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，生成紅色產(chǎn)物。經(jīng)β-磷酸甘油的10d誘導(dǎo)，可見對照組VSMCs培養(yǎng)孔內(nèi)無紅色染色，為陰性反應(yīng)(圖3a)；鈣化組培養(yǎng)孔內(nèi)呈顯著陽性反應(yīng)，細(xì)胞外彌漫著紅色的鈣沉積，說明VSMCs鈣化模型成功建立(圖3b)；10mM肌肽干預(yù)組VSMCs的染色強(qiáng)度明顯下調(diào)，僅可見少量的鈣鹽沉積(圖3c)。

圖3 茜素紅染色檢測各實(shí)驗(yàn)組的鈣鹽沉積

2.3肌肽對ALP活性的時(shí)間效應(yīng):如圖4所示，各組ALP活性均隨培養(yǎng)時(shí)間推移而上調(diào)，其中鈣化組在β-磷酸甘油誘導(dǎo)下，ALP活性水平上調(diào)更加明顯，在第8～10天之間，活性顯著高于對照組(P<0.05)；10mM肌肽干預(yù)后，同鈣化組相比較，第4～8天時(shí)，ALP活性水平下調(diào)，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，第10天時(shí)，肌肽組ALP活性顯著低于鈣化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 生化實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)不同時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組的ALP活性

2.4肌肽對鈣化VSMCs成骨細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響:與鈣化組相比較，10mM肌肽干預(yù)后，BMP-2和Runx2的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示肌肽可能在VSMCs向成骨細(xì)胞分化過程的后期發(fā)揮抑制作用(圖5)。

圖5 Western blot檢測各實(shí)驗(yàn)組BMP-2和Runx2的表達(dá)情況

2.5肌肽對VSMCs鈣化進(jìn)程中細(xì)胞凋亡的影響:Cleaved-caspase3是凋亡因子caspase3的激活狀態(tài)，如圖6所示，鈣化組Cleaved-caspase3水平較對照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肌肽組Cleaved-caspase3水平下調(diào)，與對照組水平接近，低于鈣化組蛋白水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 Western blot檢測各實(shí)驗(yàn)組Cleaved-caspase3的表達(dá)情況

2.6肌肽對VSMCs鈣化進(jìn)程中β-catenin信號(hào)通路的影響:如圖7所示，與對照組相比較，鈣化組GSK-3β(Ser9)表達(dá)下降，β-catenin水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與鈣化組相比較，肌肽組GSK-3β(Ser9)蛋白水平顯著上調(diào)，β-catenin水平下調(diào)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 Western blot檢測各實(shí)驗(yàn)組GSK-3β(Ser9)和β-catenin的表達(dá)情況

3 討 論

研究表明機(jī)體鈣磷代謝失衡原因造成的鈣鹽沉積結(jié)果是血管鈣化的主要病理表現(xiàn)，是機(jī)體冠狀動(dòng)脈鈣化重要原因之一[4]。堿性磷酸酶由成骨細(xì)胞生成和分泌，是標(biāo)志成骨細(xì)胞特異性成熟的標(biāo)志物，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor-2,Runx2)是成骨分化過程重要標(biāo)志蛋白，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的作用，同時(shí)，二者還可以上調(diào)ALP表達(dá)[5,6]。β-磷酸甘油在細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷酸鹽，是平滑肌細(xì)胞鈣化的主要誘因[7]。細(xì)胞凋亡在VSMCs的鈣化進(jìn)程中居于初始階段的關(guān)鍵地位，而caspase 3是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志物之一，在凋亡進(jìn)程中居于核心地位，是一切凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的最終共同通路。Wnt信號(hào)通路可影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移，調(diào)節(jié)血管的生成發(fā)育，與血管鈣化密切相關(guān)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，鈣化組的紅色鈣沉積明顯，呈顯著陽性反應(yīng)，在β-磷酸甘油刺激的4～10d內(nèi)，鈣化組的堿性磷酸酶活性水平隨時(shí)間延長穩(wěn)步升高，且均高于同期無處理對照組(P<0.05)，表明血管平滑肌發(fā)生鈣化，而經(jīng)肌肽處理后，鈣沉積明顯減少，堿性磷酸酶活性下調(diào)，提示。同時(shí)鈣化組BMP-2、Runx2水平顯著上升，肌肽干預(yù)后顯著降低(p<0.05)，提示肌肽負(fù)調(diào)控高磷誘導(dǎo)的VSMCs體外骨向分化。鈣化組cleaved-caspase 3(caspase 3活化形式)蛋白水平上調(diào)，肌肽干預(yù)顯著下調(diào)cleaved-caspase 3的蛋白表達(dá)，提示肌肽下調(diào)的VSMCs凋亡可能參與了該細(xì)胞的成骨向表型轉(zhuǎn)化。肌肽組GSK-3β(Ser9)蛋白水平顯著上調(diào)，β-catenin水平下調(diào)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示肌肽抑制了Wnt信號(hào)通路。Ommati[9]等研究發(fā)現(xiàn)異環(huán)磷酰胺腹腔注射大鼠后，尿內(nèi)堿性磷酸酶水平升高，500mg/kg肌肽的干預(yù)可顯著下調(diào)過量激發(fā)的ALP，與本研究結(jié)果相似。這表明肌肽可體外抑制大鼠血管平滑肌鈣化進(jìn)程，在血管鈣化過程中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞凋亡、成骨分化及Wnt信號(hào)通路。

綜上所述，肌肽具有抑制VSMCs鈣化的保護(hù)作用，表現(xiàn)為通過上調(diào)GSK3β磷酸化，抑制β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而降低骨向分化標(biāo)志物蛋白表達(dá)，下調(diào)堿性磷酸酶活性和成骨細(xì)胞成熟、減少鈣沉積，同時(shí)可減少VSMCs的細(xì)胞凋亡水平。本研究為深入探討VSMCs鈣化及成骨向表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并擴(kuò)展了肌肽的新的生物效應(yīng)，為其臨床應(yīng)用提供新的支持。