鄧艷玲，翁文玉，招澤豪，施健新，陳灼均，鄧煜，周志昆

（廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東東莞 523808）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是中老年女性常見(jiàn)的代謝性、全身性骨病。婦女絕經(jīng)后，體內(nèi)雌激素水平驟然下降，骨形成和骨吸收偶聯(lián)失衡，導(dǎo)致骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞，容易發(fā)生骨折[1]。隨著人口老齡化，PMOP的防治已成為全球關(guān)注的重要問(wèn)題。本課題組在前期臨床研究中，將黃芪三仙湯分別與尼爾雌醇、鈣爾奇作對(duì)照治療PMOP患者，證實(shí)了黃芪三仙湯可提高絕經(jīng)后婦女的雌激素水平，改善骨代謝，增加骨密度[2-3]；動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，該方可提高PMOP大鼠血清中骨鈣素、鈣離子、磷離子等的濃度[4]，可促進(jìn)成骨細(xì)胞（OB）中護(hù)骨素和護(hù)骨素配體的表達(dá)[5]。前期研究結(jié)果表明，黃芪三仙湯可有效治療PMOP，但其作用機(jī)制仍不完全明確。有研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)[6]。在多種病理生理過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化中起著至關(guān)重要的作用[7-8]。故本研究從PI3K/Akt信號(hào)通路出發(fā)，在細(xì)胞水平探討黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞的調(diào)控作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物黃芪三仙湯，由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿葉、丹參、三七、當(dāng)歸、延胡索、威靈仙、仙茅等9味中藥組成，各中藥材由東莞國(guó)藥公司提供；鹽酸雷洛昔芬片（易維特）由西班牙LILLY，S.A.公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：C626623。

1.2 試劑與儀器LY294002（美國(guó)MCE公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（日本同仁公司）；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；茜素紅（美國(guó)Sigma公司）；抗兔磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）1、Akt1、p-Akt2、Akt2、雌激素受體α（ERα）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨橋蛋白（OPN）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix（Osx）等抗體（美國(guó)Abcam公司）；NBT/BCIP堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Western Blot Marker、顯影劑（碧云天生物技術(shù)有限公司）。雙能X線骨密度儀（美國(guó)Hologic公司）；顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；垂直電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 體內(nèi)研究

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物84只SPF級(jí)3月齡雌性未生育的SD大鼠，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800008198，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南，符合國(guó)際公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)定[9]，并獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3.2 藥物制備①黃芪三仙湯按黃芪∶淫羊藿葉∶威靈仙∶三七∶延胡索∶丹參∶當(dāng)歸∶肉蓯蓉∶仙茅=15∶10∶10∶5∶10∶10∶8∶10∶10的比例組成。用蒸餾水煎煮2 h，藥液過(guò)篩。反復(fù)煎煮2次，4℃儲(chǔ)存。②鹽酸雷洛昔芬混懸液的配制：取60 mg鹽酸雷洛昔芬片磨碎后，加入96 mL雙蒸水，充分溶解，配制成濃度為0.625 mg/mL的雷洛昔芬混懸液。③含LY294002的培養(yǎng)液配制：將5 mg LY294002粉末加入162 μL二甲基亞砜（DMSO）充分溶解備用，使用時(shí)，每1 mL培養(yǎng)液加入1 μL配好的LY294002。

1.3.3 動(dòng)物分組與PMOP動(dòng)物模型的建立將84只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為7組，即正常組，模型組，假手術(shù)組，黃芪三仙湯高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。除正常組外，其余6組大鼠以異氟烷進(jìn)行麻醉和消毒。模型組和黃芪三仙湯高、中、低劑量組大鼠從背部?jī)蓚?cè)切口，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢[10]；假手術(shù)組進(jìn)行切除脂肪的假手術(shù)，即切除兩側(cè)卵巢附近同樣大小的脂肪；正常組不進(jìn)行任何處理。為了防止感染，每只大鼠在術(shù)后3 d內(nèi)肌肉注射20萬(wàn)U青霉素。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)12周。可根據(jù)骨密度和骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果判斷是否成功構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型[11]。

1.3.4 給藥按人與動(dòng)物用藥等效劑量換算方法[大鼠每天給藥劑量（mg/kg）=人每天給藥劑量（mg）/60 kg×6.25]，計(jì)算大鼠的等效給藥量。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，黃芪三仙湯高、中、低劑量組大鼠分別給予27.501、9.167、3.056 g/kg的黃芪三仙湯水煎液灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組給予雷洛昔芬混懸液6.25 mg/kg灌胃；正常組、假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每天1次，10 mL/kg，持續(xù)12周。

1.3.5 取材給藥結(jié)束后，禁食24 h，處死大鼠，分離股骨，去除附著在股骨上的肌肉。將右側(cè)股骨，浸泡于4%福爾馬林溶液中，用于制備骨切片；將左側(cè)股骨置于-80℃冰箱中保存，用于測(cè)量骨密度。

1.3.6 骨密度的測(cè)定應(yīng)用雙能X線骨密度儀檢測(cè)大鼠股骨全段、股骨遠(yuǎn)端、股骨近端的骨密度。

1.3.7 股骨石蠟切片制備和蘇木素-伊紅染色檢測(cè)骨組織形態(tài)學(xué)變化取右側(cè)股骨，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定48 h，固定完成后置于EDTA脫鈣液中浸泡脫鈣，每2 d更換1次脫鈣液，直至用針可刺進(jìn)骨皮質(zhì)時(shí)為脫鈣完成。用刀將股骨從冠面對(duì)半切開(kāi)，制作蠟塊、切片。將切片進(jìn)行烤片、脫蠟至水、蘇木素染色、分色、伊紅染色、梯度酒精脫水后，用二甲苯透明5 min×2次，中性樹(shù)膠封片。最后置于顯微鏡下（×20）觀察拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）和骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)股骨組織p-Akt1、Akt1、p-Akt2、Akt2、ERα蛋白表達(dá)將儲(chǔ)存?zhèn)溆玫墓晒侨〕?，剪掉股骨遠(yuǎn)端骨組織，并置于裝有裂解液的預(yù)冷研缽中，向研缽中加入液氮，研磨至看不見(jiàn)顆粒狀骨組織，離心取上清液并測(cè)定濃度（具體步驟參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)）。然后加入5×Buffer的上樣緩沖液，混勻，離心，95℃變性5 min，根據(jù)BCA法測(cè)出的結(jié)果，分別計(jì)算出各樣品含30 μg蛋白的溶液體積，確定蛋白上樣量進(jìn)行上樣。以70 V恒壓電泳約30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入分離膠后，將電離分離儀電壓調(diào)至90 V，以90 V恒定電壓電泳90 min后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜儀電流調(diào)至300 mA，恒流轉(zhuǎn)膜90 min）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，對(duì)照Marker分子量參照表，切出需要的PVDF膜條帶，轉(zhuǎn)移至50 g/L脫脂奶粉的洗膜槽中，封閉90 min，加入稀釋比為1∶1 000的p-Akt1、Akt1、p-Akt2、Akt2、ERα等一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST溶液漂洗3次，將條帶置于稀釋比為1∶1 000的羊抗兔、羊抗鼠混合二抗溶液中，在搖床上室溫孵育60 min，用TBST沖洗3次，加入顯影劑，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。最后應(yīng)用ImageJ軟件測(cè)量所有波段的光密度（OD）值。

1.4 體外研究

1.4.1 含藥血清的制備和原代PMOP成骨細(xì)胞的培養(yǎng)42只3月齡雌性SD大鼠，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800008198。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，包括正常血清組、黃芪三仙湯血清組和雷洛昔芬血清組，每組14只。按照人與動(dòng)物用藥等效劑量換算方法計(jì)算各組大鼠的等效給藥量。黃芪三仙湯血清組大鼠給予9.167 g/kg黃芪三仙湯灌胃，雷洛昔芬血清組大鼠給予6.25 mg/kg雷洛昔芬混懸液灌胃，正常血清組大鼠給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，給藥1周。最后一次灌胃后1 h，麻醉大鼠，心臟穿刺采集血樣，離心獲得血清樣品，水浴滅活，過(guò)濾，-80℃儲(chǔ)存。

參考文獻(xiàn)研究[12]，從模型組大鼠的顱骨獲得原代PMOP成骨細(xì)胞。

1.4.2 CCK-8法檢測(cè)PMOP成骨細(xì)胞的增殖活力將PMOP成骨細(xì)胞以密度7×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞黏附后，在無(wú)血清ɑ-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養(yǎng)基，分別添加濃度為2.5%、5%、10%、15%、20%（v/v）的正常血清、黃芪三仙湯血清、雷洛昔芬血清孵育細(xì)胞72 h后，吸棄原始培養(yǎng)基，添加10%CCK-8培養(yǎng)基孵育2 h。最后，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的OD值，以評(píng)估不同血清濃度對(duì)PMOP成骨細(xì)胞增殖活力的影響。

在后續(xù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，種板和饑餓處理后，分別添加含20%正常血清、黃芪三仙湯血清和雷洛昔芬血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h，添加10%CCK-8培養(yǎng)基，測(cè)量OD值，以評(píng)估不同處理時(shí)間對(duì)PMOP成骨細(xì)胞增殖活力的影響。

1.4.3 堿性磷酸酶活性的測(cè)定將PMOP成骨細(xì)胞以密度為2×104個(gè)/孔接種到24孔板中。細(xì)胞黏附后，在無(wú)血清ɑ-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養(yǎng)基，分別加入含有20%正常血清、20%雷洛昔芬血清、20%黃芪三仙湯血清、20%黃芪三仙湯血清+10 μmol/L LY294002抑制劑的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后，按照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)堿性磷酸酶活性。方法：采用70%乙醇固定細(xì)胞15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，37℃用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色緩沖液孵育30 min，最后風(fēng)干并在顯微鏡下觀察、拍片。

1.4.4 礦化分析將PMOP成骨細(xì)胞以密度為2×104個(gè)/孔接種在24孔板中。細(xì)胞黏附后，在無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養(yǎng)基，分別加入含有20%正常血清、雷洛昔芬血清、黃芪三仙湯血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞3 d。礦化分析：PBS洗滌細(xì)胞后，70%乙醇固定15 min，然后用超純水洗滌，并于37℃用5.0 g/L茜素紅孵育30 min，最后除去超純水，自然風(fēng)干并在顯微鏡下觀察拍片。為了定量基質(zhì)礦化和鈣沉積，將茜素紅染色劑充分溶解于氯化十六烷基吡啶（CPC）的10%水合物溶液中，振蕩30 min，然后將溶解的染色劑放入96孔板中，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)量562 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.4.5 Western Blot法檢測(cè)PMOP成骨細(xì)胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα、Runx2、OPN、Osx

蛋白的表達(dá)將PMOP成骨細(xì)胞以密度2×105個(gè)/孔添加至6孔板中。細(xì)胞黏附后，在無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養(yǎng)基，并加入含20%正常血清、20%雷洛昔芬血清、20%黃芪三仙湯血清、20%黃芪三仙湯血清+10 μmol/L LY294002的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞3 d，提取細(xì)胞總蛋白。下一步操作方法參考“1.3.8”項(xiàng)下。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。進(jìn)一步兩兩比較，若方差齊則采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪三仙湯對(duì)PMOP大鼠股骨骨密度的影響圖1結(jié)果顯示：與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨各段的骨密度均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雷洛昔芬組的股骨全段、股骨遠(yuǎn)端、股骨近端的骨密度均明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪三仙湯高、中劑量組股骨遠(yuǎn)端、股骨近端的骨密度均明顯增加（P＜0.05），股骨全段的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），黃芪三仙湯低劑量組股骨遠(yuǎn)端的骨密度明顯增加（P＜0.05），股骨全段和股骨近端的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠造模成功，黃芪三仙湯可有效改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，且呈劑量依賴性。

圖1 各組大鼠骨密度比較Figure 1 Comparison of bone mineral density（BMD）in various groups of rats

2.2 黃芪三仙湯對(duì)PMOP大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織形態(tài)學(xué)、計(jì)量學(xué)的影響圖2-A結(jié)果顯示：正常組、假手術(shù)組的骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)完整；模型組骨小梁斷裂、缺失嚴(yán)重，骨髓腔中出現(xiàn)大量空腔，表現(xiàn)出明顯的骨丟失。與模型組比較，雷洛昔芬組的骨小梁斷裂、缺失情況得到了明顯的改善，骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，而黃芪三仙湯各劑量組的骨小梁斷裂、缺失情況也均有所改善，且效果呈一定的劑量依賴性，其中，黃芪三仙湯低劑量組仍存在較為嚴(yán)重的骨小梁斷裂、缺失，黃芪三仙湯中劑量組有部分骨小梁缺失、斷裂，黃芪三仙湯高劑量組骨小梁只有少部分缺失或斷裂。

圖2-B結(jié)果顯示：模型組大鼠的骨小梁數(shù)量較正常組、假手術(shù)組均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組和黃芪三仙湯高劑量組的骨小梁數(shù)量均顯著增加（P＜0.05），黃芪三仙湯中、低劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2-C結(jié)果顯示：模型組大鼠的骨小梁面積百分比較正常組、假手術(shù)組均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組的骨小梁面積百分比均顯著增加（P＜0.05），黃芪三仙湯低劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2-D結(jié)果顯示：模型組大鼠的骨小梁分離度較正常組、假手術(shù)組均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組的的骨小梁分離度均顯著降低（P＜0.05），黃芪三仙湯低劑量組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端組織形態(tài)學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)分析比較Figure 2 Comparison of distal femur bone morphology and morphometric analysis in various groups of rats

整個(gè)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果表明，黃芪三仙湯各治療組對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)具有改善作用，且呈劑量依賴性。

2.3 黃芪三仙湯對(duì)PMOP大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα表達(dá)的影響圖3、圖4結(jié)果顯示：模型組大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組和正常組（P＜0.05）。與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2表達(dá)比較Figure 3 Comparison of expression of p-Akt1/AKT1 and p-Akt2/Akt2 in femur tissue in various groups of rats

圖4 各組大鼠股骨組織ERα蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of protein expression of ERα in femur tissue in various groups of rats

2.4 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞增殖的影響圖5結(jié)果顯示：與2.5%濃度的雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組比較，含有5%、10%、15%和20%濃度的對(duì)應(yīng)藥物血清組PMOP成骨細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)（P＜0.01），且20%濃度的藥物血清組PMOP成骨細(xì)胞增殖能力更明顯（P＜0.001）。

圖5 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞增殖的影響Figure 5 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on proliferation of PMOP osteoblasts

以20%濃度的含藥血清處理24 h后，與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組PMOP成骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.01），黃芪三仙湯血清組則不明顯（P＞0.05）；培養(yǎng)48、72 h后，與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)（P＜0.01），且72 h作用效果優(yōu)于48 h（P＜0.001）。

2.5 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞分化和礦化的影響圖6、圖7結(jié)果顯示：與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組堿性磷酸酶活性明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，PMOP成骨細(xì)胞產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)。與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)顯著增加（P＜0.001）。

圖6 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞分化的影響Figure 6 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on differentiation of PMOP osteoblasts

圖7 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞礦化的影響Figure 7 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on mineralization of PMOP osteoblasts

2.6 黃芪三仙湯對(duì)PMOP成骨細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白活化和ERα表達(dá)的影響圖8、圖9結(jié)果顯示：與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細(xì)胞中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。添加PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，黃芪三仙湯血清+LY294002組中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對(duì)表達(dá)量較黃芪三仙湯血清組降低（P＜0.05）。

圖8 各組PMOP成骨細(xì)胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2蛋白表達(dá)比較Figure 8 Comparison of relative expression of p-Akt1/Akt1 and p-Akt2/Akt2 in of various groups PMOP osteoblasts

圖9 各組PMOP成骨細(xì)胞ERα蛋白表達(dá)比較Figure 9 Comparison of ERα protein expression in various groups of PMOP osteoblasts

2.7 黃芪三仙湯通過(guò)PI3K/Akt通路對(duì)PMOP成骨細(xì)胞分化的影響圖10結(jié)果顯示：雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組的堿性磷酸酶活性較正常血清組升高（P＜0.01）。LY294002干預(yù)后，與黃芪三仙湯血清組比較，黃芪三仙湯血清+LY294002組的堿性磷酸酶活性顯著降低（P＜0.001）。

圖10 各組PMOP成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性比較Figure 10 Comparison of ALP activity in various groups of PMOP osteoblasts

圖11結(jié)果顯示：黃芪三仙湯血清組和雷洛昔芬血清組的成骨分化相關(guān)因子Runx2、Osx和OPN蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常血清組（P＜0.05）。LY294002干預(yù)后，與黃芪三仙湯血清組比較，黃芪三仙湯血清+LY294002組的Runx2、Osx和OPN蛋白相對(duì)表達(dá)量仍顯著降低（P＜0.05）。

圖11 各組PMOP成骨細(xì)胞Runx2、Osx和OPN蛋白表達(dá)比較Figure 11 Comparison of protein expression of Runx2，Osx and OPN in various groups of PMOP osteoblasts

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）可歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”的范疇。歷代醫(yī)家對(duì)PMOP的中醫(yī)辨證，多以腎虛、血瘀為主。腎藏精，精生骨髓，髓養(yǎng)骨，正如《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》所云：“腎生骨髓，在體為骨。”故腎虛是PMOP最主要的病機(jī)[13]。而絕經(jīng)后女性體質(zhì)特點(diǎn)除“虛”外，另一特征為“瘀”?！夺t(yī)林改錯(cuò)》言：“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀。”故血瘀也是骨痿的關(guān)鍵病機(jī)。因此，“補(bǔ)腎活血”被認(rèn)為是PMOP的主要中醫(yī)治法。黃芪三仙湯正是經(jīng)典的補(bǔ)腎活血復(fù)方，由淫羊藿、肉蓯蓉、威靈仙等溫陽(yáng)補(bǔ)腎中藥和黃芪、當(dāng)歸、丹參、三七、延胡索等活血養(yǎng)血中藥共同組成。

血清藥理學(xué)是指在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間給動(dòng)物灌服中藥或中藥復(fù)方后，收集血液，分離出血清，采用提取的含藥血清替代中藥或中藥復(fù)方進(jìn)行體外藥理實(shí)驗(yàn)的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法[14]。由于中藥及中藥復(fù)方成分多樣復(fù)雜，需經(jīng)體內(nèi)吸收、代謝等過(guò)程，最終入血的成分才是中藥有效成分[15]。

本研究從PMOP大鼠模型股骨中提取原代PMOP成骨細(xì)胞，用含黃芪三仙湯的血清進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)PMOP成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化的影響。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，含有黃芪三仙湯的血清促進(jìn)了PMOP成骨細(xì)胞的增殖，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯。在PMOP成骨細(xì)胞分化和礦化過(guò)程中，高表達(dá)的ALP和細(xì)胞內(nèi)的礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞的表型標(biāo)志物[16]。本研究結(jié)果顯示，黃芪三仙湯血清組的ALP活性、經(jīng)茜素紅染色的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量都較正常血清組顯著增高，表明黃芪三仙湯可促進(jìn)PMOP成骨細(xì)胞分化、礦化能力。故認(rèn)為，黃芪三仙湯可通過(guò)促進(jìn)PMOP成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，從而促進(jìn)骨形成和減少骨質(zhì)流失。

ERα被認(rèn)為是雌激素骨骼保護(hù)作用的主要調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，在激素水平正常的情況下，雌激素可通過(guò)ERα發(fā)揮級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與維持骨代謝平衡[17]。本研究成功構(gòu)建PMOP大鼠模型后，觀察成骨細(xì)胞中ERα的表達(dá)情況，體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，黃芪三仙湯可顯著提高PMOP大鼠股骨組織ERα的表達(dá)，且體外研究結(jié)果顯示，與黃芪三仙湯血清組比較，加入PI3K/Akt抑制劑LY294002后，PMOP成骨細(xì)胞ERα蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低。既往有研究表明，通過(guò)ERα調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)可防止去卵巢引起的骨質(zhì)疏松[6]。ERα與PI3K的 調(diào) 節(jié) 亞 基p85結(jié) 合 可 激 活PI3K/Akt，活化的Akt能夠磷酸化ERα中ser167，這提示PI3K/Akt信號(hào)通路與ERα之間有雙向調(diào)節(jié)作用[18-19]。p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2是PI3K/Akt通路的核心蛋白。本研究結(jié)果顯示，黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細(xì)胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2活化水平較正常血清組明顯升高，加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002后，p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2升高現(xiàn)象被抑制，這表明黃芪三仙湯可通過(guò)促進(jìn)PMOP成骨細(xì)胞中ERα的表達(dá)進(jìn)一步激活PI3K/Akt信號(hào)通路，發(fā)揮促成骨作用。

Runx2、Osx、OPN是調(diào)節(jié)成骨分化及骨發(fā)育的關(guān)鍵因子[20-23]。體外研究結(jié)果顯示，黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細(xì)胞Runx2、Osx、OPN蛋白表達(dá)增強(qiáng)，加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，翻轉(zhuǎn)了黃芪三仙湯血清對(duì)PMOP成骨細(xì)胞Runx2、Osx、OPN的促進(jìn)作用，表明黃芪三仙湯可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路增強(qiáng)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物Runx2、Osx和OPN的蛋白表達(dá)，促進(jìn)PMOP成骨細(xì)胞的分化，加速骨形成。

綜上所述，黃芪三仙湯可提高PMOP大鼠的骨密度，改善骨小梁結(jié)構(gòu)，并可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化，其機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)骨細(xì)胞ERα及成骨分化關(guān)鍵因子Runx2、Osx和OPN的表達(dá)，促進(jìn)骨形成。