賀 濤 王 偉 李 蕾 邱世琳 孫善明 宗 蕾

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬慢性非特異性腸道炎癥性疾病， 多從直腸開始向近端發(fā)展，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛及黏液膿便血等，病程較長，易反復(fù)發(fā)作，難以徹底治愈，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。近年來，UC的發(fā)生率呈逐漸上升趨勢[1]。目前關(guān)于該病的病因和發(fā)病機制仍不清楚，但有研究表明，遺傳、環(huán)境、腸道菌群失調(diào)和免疫介導(dǎo)的黏膜屏障損傷參與該病的發(fā)病過程[2，3]。因此，進一步探索其發(fā)病機制、監(jiān)測其病情變化，以進一步為臨床提供更優(yōu)的診療方案顯得極其重要。本研究通過檢測UC腸黏膜組織中黏液基因蛋白2(mucin2，MUC2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達水平，分析其表達與病情嚴(yán)重程度及Mayo內(nèi)鏡評分的相關(guān)性，為UC病情嚴(yán)重程度監(jiān)測、臨床診療提供有力證據(jù)。

對象與方法

1.研究對象：收集濰坊市人民醫(yī)院2017年6月～2020年10月進行結(jié)腸鏡檢查的UC患者54例, 男性27例, 女性27例,患者平均年齡48.28±16.04歲。依照改良 Truelove 和Witts 疾病嚴(yán)重程度分型，輕度13例，中度32例，重度9例[4];內(nèi)鏡下黏膜嚴(yán)重程度依照Mayo內(nèi)鏡評分，0分6例，1分14例，2分23例，3分11例[5]。同時選取10例健康對照組作為對照組，其中男性10例，女性10例，平均年齡49.71±12.04歲，各組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)：入組標(biāo)準(zhǔn): (1) UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年,北京)》[6]。(2)各項檢查資料完整。(3)患者及患者家屬均簽署知情同意書。(4)對照組無其他疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有嚴(yán)重并發(fā)癥，如腸梗阻;局部狹窄、腸穿孔、中毒性巨結(jié)腸。(2)有癌變可能者。(3)合并有神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重的原發(fā)性疾病者。(4)合并有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病者。(5)哺乳或妊娠期女性。

3.主要的試劑及器材：EGFR(表皮生長因子受體)抗體試劑、MUC2(黏蛋白2)抗體試劑、PCNA(增殖細胞核抗原)抗體試劑、免疫顯色試劑均購自廣州安必平科技股份有限公司。切片機(LEICA：RM2235)、組織包埋冷凍機(BM450A型)購自常州派斯杰設(shè)備有限公司。病理組織漂烘儀(PH60)購自常州派斯杰設(shè)備有限公司

4.免疫組化檢測EGFR、PCNA、MUC2表達：UC組和正常對照組的結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本經(jīng)10%的甲醛溶液固定后,脫水、透明、石蠟包埋，3μm厚連續(xù)切片,HE染色證實組織結(jié)構(gòu)及病變程度。嚴(yán)格按操作說明進行免疫組化染色:常規(guī)脫蠟脫水,過氧化氫孵育10min清除內(nèi)源性過氧化物酶,高溫、高壓枸櫞酸鹽行抗原修復(fù),滴加一抗,37℃孵育70min,滴加二抗,37℃孵育60min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,二甲苯透明,中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。染色成功后所有切片均在同一條件下進行光學(xué)顯微鏡檢查。采用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件，分析測定積分吸光度(A)值，以其平均值代表蛋白表達水平。

5.觀察指標(biāo)：比較UC組和對照組EGFR、MUC2及PCNA表達水平。比較UC組中不同疾病嚴(yán)重程度及MSE患者的EGFR、MUC2及PCNA表達水平差異。分析不同疾病嚴(yán)重程度以及MSE與患者的EGFR、MUC2及PCNA表達水平的相關(guān)性。

結(jié) 果

1.UC組與對照組各指標(biāo)水平的比較：免疫組化結(jié)果顯示，EGFR、MUC2、PCNA在UC組和對照組結(jié)腸黏膜組織中均有表達(圖1)，EGFR主要表達在胞質(zhì)及胞膜，MUC2主要表達在胞質(zhì)，PCNA主要表達在細胞核。UC組的EGFR、MUC2表達水平低于對照組，而PCNA表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 正常對照組及UC組結(jié)腸黏膜組織中EGFR、MUC2、PCNA蛋白表達的比較

圖1 EGFR、MUC2、PCNA 在正常腸黏膜和病變黏膜中的表達(免疫組化,×200)A.EGFR在UC黏膜的陽性表達;B.EGFR在正常黏膜的陽性表達;C.MUC2在UC黏膜的陽性表達;D.MUC2在正常黏膜的陽性表達;E.PCNA在UC黏膜的陽性表達；F.PCNA在正常黏膜陽性表達。與對照組比較，*P<0.05

2.不同疾病嚴(yán)重程度UC患者各指標(biāo)水平的比較：輕度、中度及重度患者的EGFR、MUC2表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著病情加重,患者的MUC2、PCNA水平下降，EGFR表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表2)。

表2 不同疾病嚴(yán)重程度UC患者黏膜組織中EGFR、MUC2、PCNA表達水平的比較

3.不同Mayo內(nèi)鏡評分UC患者各指標(biāo)的比較：不同MSE患者的EGFR、MUC2、PCNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。隨著MSE分值升高，MUC2、PCNA水平下降，EGFR表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，表3)。

表3 不同MSE UC患者黏膜組織中EGFR、MUC2、PCNA表達水平的比較

4.EGFR、MUC2、PCNA表達水平與臨床病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性：UC患者黏膜組織中的EGFR(r=-0.273，P=0.046)、MUC2(r=0.437，P=0.001)表達水平與臨床病情嚴(yán)重程度呈負相關(guān)；PCNA表達水平與臨床病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.641，P<0.001)。

5.UC患者黏膜組織中EGFR、MUC2表達水平與PCNA表達水平的相關(guān)性：UC患者黏膜組織中EGFR(r=-0.365，P=0.007)、MUC2(r=-0.315，P=0.020)表達水平與PCNA呈負相關(guān)。

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，目前病因仍不清楚，其中，免疫因素是導(dǎo)致UC產(chǎn)生的關(guān)鍵，因此對該病發(fā)病機制的研究顯得尤為重要[7，8]。本研究通過對筆者醫(yī)院55例UC患者結(jié)腸黏膜組織中的PCNA、EGFR、MUC2的表達情況進行檢測，分析其與臨床及內(nèi)鏡疾病病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探索PCNA、EGFR、MUC2表達對UC進展的影響，以期為臨床上更好地治療UC提供參考。

正常生理狀況下，MUC2有維持腸道黏膜上皮完整性、潤滑和保護腸道黏膜的作用[9]。腸組織MUC2蛋白產(chǎn)物的下降提示腸黏膜防御能力降低[10]。Ozaki等[11]研究發(fā)現(xiàn)UC患者腸道上皮MUC2表達下降是疾病復(fù)發(fā)的獨立危險因素。此外，MUC2黏蛋白缺陷小鼠會出現(xiàn)腸上皮細胞形態(tài)的異常和潰瘍產(chǎn)生，出現(xiàn)結(jié)腸炎的表現(xiàn)，而MUC2表達水平的恢復(fù)和黏液層的形成可以改善結(jié)腸炎癥狀[12～14]。EGFR信號通路作為人體中的關(guān)鍵信號通路，介導(dǎo)細胞的凋亡和增殖，與結(jié)腸黏膜損傷的發(fā)生有關(guān)，因此，干預(yù)EGFR信號通路為治療UC提供了可能[15，16]。有研究顯示潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜受損會影響EGFR表達，進而減少對結(jié)腸黏膜的保護及修復(fù)作用，并發(fā)現(xiàn)EGFR水平與UC復(fù)發(fā)密切相關(guān)[17，18]。

PCNA與細胞的生長增殖密切相關(guān)，可加快恢復(fù)結(jié)腸上皮屏障功能，減輕炎性細胞浸潤。研究表明PCNA在結(jié)腸炎癥組織中表達增加，提示其在結(jié)腸炎癥黏膜修復(fù)機制中起重要作用[19，20]。一旦腸杯狀細胞破壞導(dǎo)致MUC2的表達發(fā)生變化，腸黏膜將失去保護，致使黏膜屏障受損，通透性增高，進而使腸腔內(nèi)的細菌、抗原、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)進入黏膜固有層，誘發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致UC的加重[21]。UC異常的免疫反應(yīng)將干擾EGFR蛋白/EGFR信號通路途徑，影響細胞的凋亡和增殖，進而導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的損傷；而EGFR可阻止由氧化劑所導(dǎo)致的腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙，從而促進組織的恢復(fù)，是腸黏膜的營養(yǎng)因子。PCNA在G1后期和S期表達明顯，是判斷結(jié)腸黏膜上皮增殖活性的一個可靠指標(biāo)[22]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在UC活動期比緩解期結(jié)腸組織表達更高，揭示UC炎性反應(yīng)將促使黏膜上皮細胞增殖，從而促進結(jié)腸黏膜損傷的修復(fù)[23]。在UC發(fā)病過程中，MUC2、EGFR的表達水平顯著降低，直接提示黏膜屏障受損，腸腔自身保護能力下降，從而導(dǎo)致或加重UC的發(fā)生；PCNA的表達水平升高，提示腸道黏膜細胞處于增殖活躍狀態(tài)，有利于黏膜修復(fù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UC組黏膜組織MUC2、EGFR表達較對照組下降，PCNA表達較對照組上升，提示UC通過造成EGFR、MUC2、PCNA異常表達進而影響腸黏膜屏障功能，最終導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生或加重。

本研究發(fā)現(xiàn)EGFR、MUC2表達水平與PCNA表達呈負相關(guān)，表明EGFR、MUC2有助于結(jié)腸上皮增殖及黏膜修復(fù)。隨著疾病活動度的增加，MUC2、EGFR表達下降，PCNA表達升高，相關(guān)性分析表明EGFR、MUC2、PCNA與MSE均具有相關(guān)性。MSE越高，EGFR、MUC2表達水平越低，而PCNA表達越高，提示在UC患者病程嚴(yán)重程度增加，腸黏膜杯狀細胞減少，黏蛋白的表達降低，黏膜通透性增高，不能有效清除腸黏膜表面細菌，對腸黏膜產(chǎn)生損傷，容易誘發(fā)和加劇腸道炎性反應(yīng)，也可作為評價病情嚴(yán)重程度及黏膜愈合的指標(biāo)。

綜上所述，EGFR、MUC2、PCNA在UC發(fā)病中可能具有重要作用,同時可作為評價疾病嚴(yán)重程度、判斷黏膜內(nèi)鏡愈合程度的重要指標(biāo)。但其在發(fā)病中具體的作用機制以及是否可作為黏膜愈合甚至組織學(xué)愈合的指標(biāo),仍需擴大樣本量及后續(xù)開展深入研究予以進一步證實。