高麗麗，李 青

p16蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，p16在細(xì)胞周期的阻滯期具有抑制細(xì)胞增殖的功能[1]。Ki-67表示細(xì)胞周期進(jìn)展及增殖活躍[2]。兩者同時表達(dá)在一個細(xì)胞周期則提示細(xì)胞周期失調(diào)。正常生理狀態(tài)下，p16和Ki-67的表達(dá)相互制約，不會同時表達(dá)于一個細(xì)胞中。若p16/Ki-67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測陽性，提示子宮頸上皮內(nèi)病變2級(cervical intraepithelial neoplasias 2, CIN2)及以上病變[3-6]。Van等[7]提出p16與Ki-67免疫組化雙染可獨立于形態(tài)學(xué)找及癌細(xì)胞。Ikenberg等[8]同樣發(fā)現(xiàn)，在子宮頸高級別上皮內(nèi)病變中p16/Ki-67免疫組化雙染法比細(xì)胞學(xué)檢查具有更高的靈敏度。近年，越來越多的實驗室應(yīng)用全自動免疫組化儀進(jìn)行p16/Ki-67雙染，但手工染色仍占多數(shù)。本實驗分別進(jìn)行p16/Ki-67手工染色和全自動免疫組化儀雙染，比較染色效果，優(yōu)化染色流程，最終達(dá)到良好的染色結(jié)果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年1～3月上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院存檔的子宮頸活檢標(biāo)本35例，其中子宮頸慢性炎15例，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low squamous intraepithelial lesion, LSIL)9例，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high squamous intraepithelial lesion, HSIL)9例，鱗狀細(xì)胞癌2例。病理診斷均經(jīng)兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師分別閱片后共同確診。組織均經(jīng)固定、脫水、包埋和切片后待用。

1.2 主要試劑及儀器p16(SD390兔抗)/Ki-67(MIB1鼠抗)檢測試劑盒(手工)購自廣州深達(dá)公司。BOND聚合物檢測系統(tǒng)DS9800/DS9390購自德國Leica公司。全自動免疫組化染色均在Leica BOND MAX全自動免疫組化儀上操作。

1.3 手工染色流程(1)烤片：60 ℃ 1～2 h。(2)脫蠟水化：將組織切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，無水乙醇Ⅰ 1 min，無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各30 s，雙蒸水沖洗30 s。(3)抗原修復(fù)：pH 9.0的EDTA修復(fù)液高溫高壓修復(fù)2 min，自然冷卻至室溫。(4)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：室溫孵育5 min，PBS沖洗30 s。(5)一抗孵育：p16/Ki-67抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗。(6)二抗孵育：HRP/AP聚合物室溫孵育20 min，PBS沖洗。(7)Fast-red顯色：Fast-red顯色液(試劑A-Fast-red底物和試劑B-Fast-red底物緩沖液按1 ∶9比例配置)，室溫顯色20～30 min(鏡下觀察適當(dāng)調(diào)整染色時間)，PBS沖洗終止顯色。(8)DAB顯色：DAB顯色液(染色液B-DAB和A-DAB底物緩沖液按1 ∶20比例混勻)室溫顯色3～5 min(鏡下觀察適當(dāng)調(diào)整染色時間)，雙蒸水沖洗終止顯色。(9)復(fù)染：蘇木精染色30～60 s，返藍(lán)后流水沖洗干凈。(10)封片：除去玻片上多余液體，添加適量水溶性封片劑(不用加蓋玻片)，45～55 ℃烘箱烘干10～20 min，直至凝固。

1.4 全自動免疫組化儀染色流程采用順次雙染法：抗原修復(fù)后進(jìn)行第一種抗體的染色并顯色，顯色完畢后再進(jìn)行第二種一抗及第二套顯色系統(tǒng)的染色，最后復(fù)染封固(圖1)。

圖1 Leica BOND MAX全自動免疫組化儀p16/Ki-67雙染運行程序

2 結(jié)果

細(xì)胞內(nèi)顯示棕色著色為p16陽性，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；紅色著色為Ki-67陽性，定位于細(xì)胞核，手工染色與全自動免疫組化儀染色結(jié)果一致，p16/Ki-67染色鮮明，對比明顯(圖2、3)。在同一細(xì)胞中同時存在特異性棕色細(xì)胞質(zhì)和紅色細(xì)胞核著色，便視為p16/Ki-67雙染陽性。

圖2 手工染色：子宮頸上皮細(xì)胞p16/Ki-67雙染陽性，EnVision兩步法 圖3 全自動免疫組化儀染色：子宮頸上皮細(xì)胞p16/Ki-67雙染陽性，EnVision兩步法

3 討論

邱曉陽等[9]研究發(fā)現(xiàn)，p16/Ki-67雙染檢測對于鑒別子宮頸細(xì)胞學(xué)陰性且高危型人乳頭狀瘤病毒陽性而TCT陰性的子宮頸上皮內(nèi)病變2/3級具有較高的靈敏度和特異性，對于組織學(xué)為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變的患者轉(zhuǎn)歸同樣具有預(yù)測價值。潘思瓊等[10]研究表明，p16/Ki-67免疫組化雙染也彌補了TCT中主觀因素導(dǎo)致的漏診及誤診。p16/Ki-67雙染作為子宮頸癌的新興篩查技術(shù)，判讀清晰明確，可減輕診斷醫(yī)師的閱片負(fù)擔(dān)；與Ki-67、p16單染效果相比，雙染更加節(jié)省玻片、試劑，染色更高效；檢測無需特殊儀器，可降低科室成本，適合在各級醫(yī)院開展，尤其是手工染色更適用于欠發(fā)達(dá)地區(qū)。

因此，本實驗旨在探討p16/Ki-67手工染色和全自動免疫組化儀雙染效果，分析兩種染色結(jié)果的一致性。實驗發(fā)現(xiàn)p16/Ki-67雙染試劑盒手工染色與全自動免疫組化儀染色效果一致性高，均適合p16/Ki-67雙染。手工染色實驗體會如下：(1)堿性修復(fù)選擇染色通用性更高的堿性修復(fù)方式。(2)Fast-red顯色液和DAB顯色液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)染色結(jié)束后，切記玻片不能接觸乙醇，乙醇可使顯色劑溶解，導(dǎo)致染色失敗。(4)封片劑為水溶性，無需加蓋玻片。(5)染色順序需考慮到Ki-67為胞核染色而p16為胞質(zhì)、胞核均著色，為避免p16先在胞核中著色形成的顯色物質(zhì)對后續(xù)染色影響，將Ki-67先于p16進(jìn)行染色。

綜上所述，p16/Ki-67免疫組化雙染技術(shù)在病理診斷中尤為重要，一些基層醫(yī)院無法開展全自動免疫組化染色，手工染色可以達(dá)到同樣的效果；全自動免疫組化儀操作也需與其他實驗方法對比，制定出適合本實驗室最優(yōu)的染色流程，從而為臨床診斷提供可靠的結(jié)果。