馮云霞，張 書，謝沛霖，朱 旭，趙曉雯

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢 430022）

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是一類代謝紊亂性疾病，其本質(zhì)是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂，其臨床特點(diǎn)是患者血漿中膽固醇（Total cholesterol，TC）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平升高，并且是各類心腦血管疾病諸如脂肪肝、動脈粥樣硬化、冠心病等的重要誘發(fā)因素[1-2]。近年來，隨著人們生活條件的改變，脂肪攝入與運(yùn)動消耗比例失衡，使高脂血癥的發(fā)病率日益升高，嚴(yán)重威脅著人們的健康[3]。

西醫(yī)是高血脂癥常用治療方法，但是由于西醫(yī)治療產(chǎn)生較大副作用，對生理、心理造成較大創(chuàng)傷，影響治療效果[4]。而在我國，中藥聯(lián)合西藥治療效果更顯著，且長期遵醫(yī)囑服藥治療效果遠(yuǎn)比停止治療效果更明顯[5]。因此，為了更顯著地提高治療高血脂癥的效果，開發(fā)中醫(yī)藥中對其治療的優(yōu)勢療法勢在必行。

腺苷5'-單磷酸激活的蛋白激酶/雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo)（Adenosine 5'-monophosphate -activated protein kinase/ mammalian target of rapamycin，AMPK/mTOR）信號通路在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成一個合成代謝和分解代謝過程的開關(guān)[6-7]，在高血脂、高血糖等引起的氧化應(yīng)激中被認(rèn)為會過度激活mTOR通路，隨之可影響胰島素信號通路，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂加劇，促進(jìn)肝損傷的發(fā)生[8]。對此，針對AMPK通路進(jìn)行的治療具有良好的作用，可用于治療代謝性疾病如糖尿病、肥胖、炎癥和癌癥等[9]，研究控制該通路是重要的研究方向。

辛溫通陽中藥蔥白提取物，指的是從蔥科植物細(xì)香蔥（Bulbus Allii Fistulosi）成熟莖下端蔥白中提取的一類活性成分，在最近的中醫(yī)藥研究指出，具有抗氧化損傷、改善缺血心肌的能量代謝、減少炎癥因子分泌、調(diào)節(jié)血脂的作用[10-11]。但蔥白提取物對但其治療高血脂的機(jī)理暫時不清楚。因此，本課題以大鼠高脂血癥動物模型為研究對象，灌喂蔥白提取物予以治療，初步探討中藥蔥白提取物對高脂血癥大鼠AMPK/mTOR信號通路的影響，為臨床上高脂血癥的治療領(lǐng)域提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康的雄性6周齡SD大鼠48只，每只體重約180-220 g，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0104；于溫度22-26℃，相對濕度50%-60%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。本實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)操作人員均具備《實(shí)驗(yàn)動物專業(yè)技術(shù)考試合格證書》。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合動物管理委員會《實(shí)驗(yàn)動物倫理證》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑

蔥白提取物（取自博心通軟膠囊，批準(zhǔn)文號：鄂藥制字Z20180167），戊巴比妥鈉（貨號P3761，sigma merck公司）；膽固醇，膽酸鈉，甲基硫氧嘧啶，吐溫-80，丙二醇，辛伐他?。ㄘ浱柗謩e為C104028，S161419，H109550，T104865，P103433，S129538 阿拉丁公司）；豬油（展藝公司）；蔥白提取物（武漢市第一醫(yī)院）；TC測試盒，TG測試盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測 試 盒 ，丙 二 醛（Malondialdehyde，MDA）測 試 盒 ，琥 珀 酸 脫 氫 酶（Succinate dehydrogenase，SDH）測試盒（貨號分別為A111-2-1，A110-2-1，A001-3-2，A003-1-1，A022-1-1，南京建成公司）；伊紅，蘇木素（貨號分別為C0109，C0107，碧云天公司）；飽和油紅“O”染色液，甘油明膠封片劑（貨號分別為G1015，G1402，Servicebio公司）；OCT包埋劑（貨號4583，Sakura公司）；化學(xué)發(fā)光試劑（貨號為WBKLS0500，millipore公司）；雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白一抗，腺苷5'-單磷酸激活的蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate -activated protein kinase，AMPK）蛋白一抗，乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl Coenzyme A Carboxylase，ACC）蛋白一抗，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）蛋白一抗，山羊抗兔IgG（貨號分別為PAB30674，PAB30970，PAB39566，PAB36269，SAB43714，bioswamp公司）。磷酸化mTOR蛋白一抗（p-mTOR），磷酸化AMPK蛋白一抗（p-AMPK），磷酸化ACC蛋白一抗（p-ACC）（貨 號 分 別 為 ab137133，ab133448，ab68191，abcam公司）。

1.3 儀器

全自動生化分析儀（型號BS-420，深圳邁瑞公司）；酶標(biāo)分析儀（型號AMR-100，杭州奧盛公司）；正置顯微鏡（型號DM1000，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；石蠟切片機(jī)（型號VCM-3558，維克科教公司）；攤片烤片機(jī)（型號TK-218V，泰維公司）；生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（型號RD-BM/ML，源達(dá)鑫）；生物組織包埋機(jī)（型號KD-BM，科迪公司）；自動組織脫水機(jī)（型號ZT-12M，亞光病理公司）；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（型號Tanon-5200，上海天能公司）；電泳儀（型號mini protean 3 cell，美國Bio-Rad）。

2 方法

2.1 大鼠高脂血癥模型構(gòu)建

設(shè)置正常組5只為空白對照，不進(jìn)行任何處理。另外25只SD大鼠根據(jù)毛新民等[12]的方法配制脂肪乳：丙二醇30%、豬油20%、吐溫-80 20%、膽固醇10%、膽酸鈉2%、甲基硫氧嘧啶1%、加水至100%制成脂肪乳，采用脂肪乳灌胃法構(gòu)建大鼠高脂血癥模型。按照脂肪乳10 mL·kg-1·d-1灌胃，10天即可造成高脂血癥模型。造模10天后，收集大鼠血清進(jìn)行全自動生化檢測血清內(nèi)TC及TG含量進(jìn)行模型鑒定。

2.2 分組干預(yù)

除空白對照組外，將構(gòu)建成功的高脂血癥大鼠模型隨機(jī)分為5組，每組5只：模型組、蔥白低劑量組、蔥白中劑量組、蔥白高劑量組、辛伐他丁組。空白對照組與模型組大鼠每天分別灌喂生理鹽水，蔥白低劑量組每天按25 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，蔥白中劑量組每天按50 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，蔥白高劑量組每天按75 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，辛伐他丁組每天按100 mg·kg-1的劑量灌胃辛伐他丁，連續(xù)4周灌喂。于給藥第4周末處死動物，大鼠3%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，取血后，戊巴比妥鈉過量麻醉致死（100 mg·kg-1），以動物無呼吸無心跳判斷動物死亡。后觀察記錄肝組織重量，收集各組大鼠的肝臟、血清樣本備用。

2.3 各組大鼠血清脂質(zhì)含量檢測

于4℃融解待測血清樣本，用深圳邁瑞B(yǎng)S-420型全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein，HDL-C）的含量，檢測試劑為深圳邁瑞配套生化試劑盒。

2.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)的觀察

將固定好的肝臟組織切取0.3 cm的厚度，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋。切片厚度取3 μm并進(jìn)行水浴處理后，將切片小心貼附于載玻片上，再放入展片器展片，貼平粘緊后烤片。根據(jù)蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosinstaining，HE）的步驟對組織切片進(jìn)行染色并通過顯微鏡拍照，再利用Leica Application Suite 圖象系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。

2.5 生化方法檢測各組大鼠肝臟組織中TC、TG、SDH、SOD及MDA含量

根據(jù)TC測試盒、TG測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒和SDH測試盒的說明書，對大鼠的肝臟組織進(jìn)行檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.6 油紅“O”染色法觀察各組肝臟組織脂質(zhì)沉積情況

用手術(shù)刀將肝臟組織修平整后，用OCT包埋劑包埋切片，取厚度5-8 μm并貼于載玻片上。冰凍切片干燥30 min后，固定洗滌并使用60%異丙醇浸洗。使用油紅“O”染液染色10 min（加蓋避光），洗片后用蘇木素染核3-5 min，最后用甘油明膠封片并通過顯微鏡拍照，使用Leica Application Suite 圖象系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。

2.7 Western blot法檢測各組大鼠肝臟組織中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

在裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑；將肝臟組織剪成細(xì)小的碎片，按比例加入裂解液（每20 mg組織加入200 μL裂解液），于勻漿器中進(jìn)行徹底勻漿。裂解后的樣品放入離心機(jī)中，在4℃下用10000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心力離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書，測定蛋白質(zhì)濃度。將各組樣品進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。膜放入5%的脫脂牛奶中，于室溫?fù)u床封閉2 h。分別加入一抗mTOR（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、ACC（1∶1000）、GADPH（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、p-ACC（1∶5000），于 4℃孵育過夜。洗膜3次后，孵育山羊抗兔二抗（1∶10000），室溫1 h。取化學(xué)發(fā)光液A和B等量混勻，洗膜3次后，將膜放置在暗室中，將發(fā)光液充分加在膜的正面。然后將膜放置在全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中，調(diào)節(jié)掃膜條件進(jìn)行掃膜，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清脂質(zhì)含量檢測

造模后進(jìn)行生化檢測顯示（見表1），模型組與對照組相比，大鼠的血清中TC與TG含量顯著升高（P＜0.05），證明造模成功，可分組干預(yù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。干預(yù)實(shí)驗(yàn)4周后，與空白對照組相比，模型組大鼠血清中TC（6.90±0.24）mmol·L-1、TG（3.29±0.10）mmol·L-1、LDL-C（3.40±0.16）mmol·L-1顯著升高，HDL-C（1.03±0.02）mmol·L-1顯著降低（P＜0.05）；蔥白提取物與辛伐他丁組和與模型組相比，大鼠血清中的TC、TG和LDL-C顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著上升（P＜0.05）。在3個劑量中，蔥白高劑量組的效果最明顯，TC（5.22±0.07）mmol·L-1、TG（1.37±0.02）mmol·L-1和LDL-C（2.13±0.03）mmol·L-1水平都顯著下降，HDL-C（1.71±0.02）mmol·L-1水平（P＜0.05）顯著上升。

表1 各組血清脂質(zhì)含量比較

圖1 不同分組的肝臟組織HE染色結(jié)果

表2 各組肝組織生化檢測結(jié)果比較

3.2 肝臟組織HE染色結(jié)果

結(jié)果如圖1顯示，空白對照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞內(nèi)無脂滴分布，肝索排列整齊，肝竇清晰。模型組大鼠肝細(xì)胞明顯變大，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多數(shù)大小不一的脂滴，將細(xì)胞核擠向一側(cè)，肝竇變窄，肝索排列不齊。用藥4周后，與模型組相比，蔥白提取物低、中、高劑量組的大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性程度逐漸降低，細(xì)胞內(nèi)的脂滴變少變小，特別是蔥白提取物高劑量組得到了明顯改善。

3.3 肝組織生化檢測結(jié)果

肝組織生化檢測結(jié)果顯示（見表2），干預(yù)實(shí)驗(yàn)4周后，與空白對照組相比，模型組大鼠血清中的TC（5.59±0.06）mmol/gprot、TG（2.64±0.03）mmol·gprot-1、MDA（40.40±1.10）mmol·gprot-1水平顯著升高，SOD（15.29±0.56）U·mgprot-1及SDH（29.04±1.67）U·mgprot-1水平顯著降低（P＜0.05）；蔥白提取物組與辛伐他丁組與模型組相比，高血脂癥大鼠血清中的TC、TG及MDA水平下降，SOD與SDH水平升高；在3個劑量組中，蔥白高劑量組的 TC（3.77±0.04）mmol·gprot-1、TG（1.79±0.02）mmol·gprot-1、MDA（20.02±0.13）mmol·gprot-1水平顯著降低（P＜0.05），而SOD（52.32±1.14）U·mgprot-1與SDH（90.78±2.18）U·mgprot-1水平顯著升高（P＜0.05）。

圖2 不同分組的肝細(xì)胞組織油紅“O”染色

表3 AMPK/mTOR信號通路蛋白在不同組中的表達(dá)變化

圖3 AMPK/mTOR信號通路蛋白在不同組中的表達(dá)變化

3.4 油紅“O”染色結(jié)果

結(jié)果如圖2顯示，空白對照組肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核被染色劑染為藍(lán)色，胞質(zhì)中未見明顯橘紅色脂滴，肝細(xì)胞排列清晰；模型組細(xì)胞明顯腫大，胞核藍(lán)染偏向一側(cè)，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量彌漫性紅染脂滴，相鄰肝細(xì)胞脂滴融合，界限模糊。與模型組相比，蔥白低、中、高劑量組胞質(zhì)內(nèi)脂滴逐漸減少；與辛伐他丁組相比，蔥白高劑量組胞質(zhì)內(nèi)脂滴更少。

3.5 蔥白提取物對高脂血癥大鼠肝臟中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的影響

與空白對照組相比，模型組中mTOR蛋白（0.71±0.02）的磷酸化水平升高，AMPK蛋白（0.27±0.01）與ACC（0.25±0.02）蛋白磷酸化水平降低；與模型組相比，蔥白低、中、高組與辛伐他丁組mTOR蛋白磷酸化水平均下降，AMPK蛋白磷酸化水平升高，且蔥白提取物治療組呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。其中，蔥白高劑量組AMPK蛋白（0.53±0.01）與ACC蛋白（0.53±0.01）磷酸化被促進(jìn)，而mTOR蛋白（0.62±0.02）磷酸化被抑制（見表3和圖3）。

4 討論

高脂血癥是影響心血管疾病如動脈粥樣硬化和冠心病的關(guān)鍵因素[13]，治療高脂血癥可以為預(yù)防心血管疾病提供有效的方法。在臨床中，TG、TC、LDL-C和HDL-C是檢測高脂血癥患者的常用指標(biāo)。本研究中的大鼠高脂血癥模型其血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C顯著降低，且病理組織切片染色結(jié)果表明模型組大鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪變性，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)高脂血癥大鼠模型具有可靠性。辛伐他丁作為羥甲基戊二酰輔酶A（Hydroxymethylglutaryl coenzyme A synthase，HMG-COA）還原酶抑制劑，可抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，從而降低血液中的脂質(zhì)水平達(dá)到治療效果[14]，因此在本研究中使用辛伐他丁作為陽性對照。本研究證實(shí)蔥白提取物治療組與辛伐他丁均可降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平且升高HDL-C水平，這與馮云霞等[15]采用蔥白提取物治療高脂血癥大鼠的結(jié)果一致。

祖國醫(yī)學(xué)在治療高脂血癥方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，能有效降低血脂水平，防止動脈粥樣硬化，且藥效溫和、不良反應(yīng)少，受到越來越多患者的青睞[16]。已有文獻(xiàn)報道蔥白提取物具有心臟保護(hù)、抗血栓、抗氧化、護(hù)肝、抗腫瘤等多種顯著的藥理作用[17]。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)能清除超氧陰離子自由基和保護(hù)細(xì)胞免受損傷的重要抗氧化酶之一，其水平高低可間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。丙二醛（MDA）是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化產(chǎn)物，其水平高低可間接反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)氧化情況。本研究中與模型組相比，蔥白低、中、高處理組與辛伐他丁組均能降低大鼠血清中的MDA水平，升高SOD水平，且根據(jù)本研究推測，隨著蔥白提取物濃度的增加，其改善血清各項(xiàng)指標(biāo)的效果越好。Han等[18]研究發(fā)現(xiàn)大果榆樹提取物可通過激活A(yù)MPK途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，Cao等[9]在研究青蒿素對小鼠動脈粥樣硬化的保護(hù)作用機(jī)制中表明青蒿素能通過AMPK/mTOR/ULK1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬，從而減輕動脈粥樣硬化。這表明在降血脂中藥的開發(fā)及其作用機(jī)制的研究中，關(guān)于藥物在AMPK/mTOR信號通路中的作用機(jī)制成為研究藥物機(jī)制的重要方向。為進(jìn)一步探討蔥白提取物發(fā)揮降血脂作用的機(jī)制，課題組研究了各組大鼠肝臟中的AMPK/mTOR通路蛋白的表達(dá)情況，這也是在AMPK/mTOR通路上首次對蔥白提取物的作用機(jī)制進(jìn)行探討。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一種通過激活促進(jìn)脂肪酸氧化和抑制肝臟脂質(zhì)堆積的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過磷酸化和失活其公認(rèn)的下游靶標(biāo)乙酰輔酶A羧化酶（ACC）來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[19]。在AMPK/mTOR通路中，AMPK的磷酸化通過降低mTOR水平來抑制脂肪形成[20]。Han等[21]在研究紅藻素-6-β-龍膽糖苷的降脂作用時，藥物治療組的AMPK磷酸化水平升高，而mTOR磷酸化水平降低，表明該藥物可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路來調(diào)節(jié)大鼠的脂質(zhì)代謝。本研究模型組大鼠的AMPK磷酸化水平較空白對照組有明顯的降低，而mTOR水平則明顯升高，經(jīng)4周治療后，蔥白提取物能明顯促進(jìn)AMPK磷酸化，降低mTOR水平，蔥白高劑量組的干預(yù)效果與辛伐他丁組的結(jié)果相當(dāng)。類似的，Zhu等[22]表明當(dāng)AMPK/mTOR通路被抑制時，會減弱藥物干預(yù)對肝臟脂肪變性的有利作用。因此，我們推測蔥白提取物可以通過影響AMPK/mTOR信號通路來調(diào)節(jié)血脂水平，達(dá)到降低血脂的效果。綜上所述，蔥白提取物能通過調(diào)節(jié)AMPK與mTOR蛋白磷酸化水平，從而影響AMPK/mTOR信號通路來促進(jìn)脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血清中的血脂水平，提示蔥白提取物有作為治療高脂血癥藥物的潛力，其作用機(jī)制有待后續(xù)的深入研究。