譚愛華，冉思邈，石和元，林 謙

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院/北京中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動站 北京 100029；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬黃岡中醫(yī)醫(yī)院 黃岡 438000；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 武漢 430065）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種嚴(yán)重威脅老年人群健康的神經(jīng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)主要是記憶力減退，認(rèn)知功能障礙，睡眠結(jié)構(gòu)、人格和行為改變等。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，隨之而來的老年人群健康問題日漸突顯。據(jù)預(yù)測，2030年我國80歲以上老人將占到總?cè)丝诘?5.83%，而到2050年，這一數(shù)據(jù)將提升到26.64%[1]，2050年AD患病人數(shù)為2015年的2.35倍[2]，將給社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和看護(hù)壓力。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中研究發(fā)現(xiàn)其病理特征為淀粉樣蛋白的沉積、tau蛋白的磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞異常凋亡等[3]。

熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSP）是近年抗AD研究中新興的靶蛋白之一，HSP是AD中常見的一類參與蛋白和伴侶蛋白，可以與非天然蛋白結(jié)合并幫助它們獲得正常結(jié)構(gòu)，從而抑制蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，在抑制Aβ淀粉樣蛋白聚集和tau蛋白異常磷酸化中發(fā)揮了重要作用，防止在應(yīng)激條件下發(fā)生蛋白錯(cuò)誤折疊和聚集過程，因此HSP70被認(rèn)為是近年來最有希望的抗AD靶標(biāo)蛋白之一。有研究者報(bào)道了在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中檢測到HSP70表達(dá)水平升高[4]，并發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，在本實(shí)驗(yàn)研究中也觀察到了這一現(xiàn)象。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（HSF1）是熱休克蛋白70（HSP70）的主要調(diào)控因子，聯(lián)系應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的重要樞紐。有研究證實(shí)通過鼻腔給擬AD小鼠以人的HSP70可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]，多項(xiàng)研究報(bào)道了替普瑞酮可誘導(dǎo)腦組織中HSP70表達(dá)增加[6-7]，因此本研究選擇替普瑞酮作為激活HSP70的機(jī)制對照藥物。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯可以改善擬AD動物的病理變化，黃連解毒湯是主治三焦火毒證的清熱解毒名方，出自《肘后備急方》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成。古代文獻(xiàn)中關(guān)于黃連解毒湯治療類AD病證的記載較少，但現(xiàn)代研究中已經(jīng)逐漸對本方治療AD展開研究，如陳國華教授團(tuán)隊(duì)對黃連解毒湯治療AD的臨床研究做了系統(tǒng)回顧分析，認(rèn)為黃連解毒湯聯(lián)合其他西藥或中藥治療可以改善AD患者的認(rèn)知功能[8]，并探討了黃連解毒湯對APP/PS1自由基代謝及海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響[9]。香港浸會大學(xué)李敏教授的團(tuán)隊(duì)近期研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯可以明顯降低擬AD小鼠腦內(nèi)的Aβ水平，有效地改善擬AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其腦內(nèi)的SP和NFTs也減少了三至四成[10]。本研究以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動物模型，探討黃連解毒湯對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及對HSP70蛋白的調(diào)控作用，以期為黃連解毒湯防治AD找到新的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

36只SPF級雄性5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠，12只SPF級雄性5月齡空白對照小鼠，二者均為C57BL/6JNju背景小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，質(zhì)量檢測單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所。動物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所動物房，動物房溫度控制在（22 ± 2）℃，濕度控制在50%左右，小鼠可自由攝食和飲水，本實(shí)驗(yàn)獲得湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審查批號：[2020]IEC012，并嚴(yán)格執(zhí)行《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

1.2 藥物及制備

黃連解毒湯組藥物制備：黃連、黃芩、黃柏、（炒）梔子按照1∶1∶1∶1等質(zhì)量比例，參考國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[11]中標(biāo)準(zhǔn)煎煮流程，加入8倍藥物總質(zhì)量的超純水浸泡30 min，全自動煎藥機(jī)“武火”檔煎至沸騰10 min，轉(zhuǎn)“文火”檔慢煎40 min，煎好后的藥液用滅菌紗布袋過濾去渣得藥液。將所得湯劑用減壓低溫冷凍法制成凍干粉，干燥皿中密封保存，用時(shí)以超純水溶解，本實(shí)驗(yàn)所用中藥飲片均由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司提供，飲片批號分別為：黃連（Y20011013）、黃芩（Y20021027）、黃柏（Y20041082）、（炒）梔子（Y20041088）。所有中藥飲片經(jīng)勁牌持正堂藥業(yè)有限公司檢驗(yàn)室（中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室）檢測合格，并經(jīng)過湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院丁莉副教授鑒定，均為合格正品。替普瑞酮膠囊（商品名：施維舒），購自中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司制造，產(chǎn)品批號：1910078，用時(shí)粉碎后以超純水溶解。

1.3 試劑

無水乙醇（100092683）、中性樹膠（10004160）、二甲苯（10023418）、丙酮（10000418）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，多聚甲醛固定液（武漢Servicebio公司，批號G1101），T-Tau兔抗鼠抗體、HSP70兔抗鼠抗體、HSF1兔抗鼠抗體（武漢Servicebio公司，批號分別為 GB11178，GB11241，GB11931），Aβ1-42抗體（美國SIGMA公司，A9810），HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（武漢Servicebio公 司 ，批 號 分 別 GB11096，GB12105，GB12002），山羊抗小鼠熒光二抗（美國ABclonal公司，批號分別為 A0208、A0207、AS001）

1.4 儀器

IVC-BP5型動物獨(dú)立通氣籠架（蘇州市蘇杭科技器材有限公司）；ZH-0065型Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；PL-203型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DP2000-1XR型微壓循環(huán)全自動煎藥機(jī)（濟(jì)南博華儀器有限公司）；C-20L-ARE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（杭州億捷科技有限公司）；LGJ-18S（電加熱）壓蓋型真空冷凍干燥機(jī)（上海豫明儀器有限公司）；JB-P5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡，DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon）；DYY-5D型電泳儀，Trans-Blot SD型轉(zhuǎn)膜儀，GelDoc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.5 動物分組及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)表法將36只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組（記作Model組）、替普瑞酮組（記作GGA組）、黃連解毒湯組（記作HLJD組），每組12只。同系非轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠12只作為空白對照組（記作Control組）。HLJD組小鼠灌服黃連解毒湯凍干粉水溶液，給藥劑量為相當(dāng)于生藥5.2 g·kg-1·d-1；GGA組小鼠灌服替普瑞酮水溶液，給藥劑量為 0.4 g·kg-1·d-1。Control組和 Model組小鼠灌服等體積超純水，各組小鼠均于每天18:00給藥，每日1次，連續(xù)給藥40天。

1.6 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.6.1 Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

參考課題組前期Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法對各組小鼠學(xué)習(xí)記憶力進(jìn)行檢測[12]，灌胃結(jié)束后進(jìn)行連續(xù)5天的定位航行訓(xùn)練，休息24 h后進(jìn)行空間探查實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 免疫熒光法檢測小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70蛋白

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，從每組小鼠中隨機(jī)選取3只小鼠，腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉溶液，麻醉劑量為0.25 mL·10 g-1，以小鼠皮膚捏夾反應(yīng)和刺激腳趾反應(yīng)消失為達(dá)到深度麻醉標(biāo)準(zhǔn)。麻醉后的小鼠無菌環(huán)境迅速斷頭，冰上剝離頭部皮膚和顱骨，充分暴露全腦，無菌眼科彎鑷從枕側(cè)基底部伸入鼻尖側(cè)，輕柔展開向上向外拖拉，完整取出全腦，用無菌的鋒利手術(shù)刀輕柔切去小腦部分，保留完整大腦組織，生理鹽水沖洗大腦表面血漬，立刻放入裝有4%多聚甲醛固定液的樣本瓶中，4℃避光固定48 h，備用。固定好后進(jìn)行石蠟包埋，包埋好的組織進(jìn)行冠狀切片，使用二甲苯和梯度乙醇對切片進(jìn)行脫蠟，脫蠟后用5%BSA封閉修復(fù)2 h，修復(fù)后用PBS洗片3次。洗片后，滴加一抗HSP70（1∶500），置于4℃孵育過夜，孵育后使用PBS洗片3次，滴加熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h，孵育后使用PBS洗片3次，向切片滴加DAPI核染，于室溫避光孵育10 min。使用PBS洗片，向切片滴加抗熒光淬滅封片劑后封片，熒光倒置顯微鏡下觀察切片，鏡下掃描獲得圖像。

1.6.3 Western blot檢測海馬中HSF1、HSP70蛋白含量表達(dá)水平

各組小鼠隨機(jī)選取2只，麻醉方法同前，達(dá)到深度麻醉標(biāo)準(zhǔn)后，無菌環(huán)境下冰上操作，迅速斷頭取腦，剝離出新鮮海馬組織，RIPA法制備海馬組織總蛋白，并用BCA蛋白試劑盒檢測樣本蛋白濃度，配置10%SDS-PAGE凝膠，每孔依次上樣40 μg后依次電泳和轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜置TBST室溫封閉1 h，洗膜后將膜置于HSF1（1∶1000），HSP70（1∶1000）抗體稀釋液中，并置4℃冰箱孵育過夜；洗膜后將PVDF膜置稀釋后的二抗（1∶10000），室溫孵育1 h；向膜上滴加適量ECL顯色液，置凝膠成像儀曝光各組條帶值；應(yīng)用Image J計(jì)算各條帶灰度值。

1.6.4 免疫熒光檢測小鼠皮層和海馬中HSP70和Aβ1-42、T-Tau共定位關(guān)系

對1.6.2中石蠟包埋的腦組織進(jìn)行兩組切片，脫蠟并進(jìn)行抗原修復(fù)，置5% BSA封閉2h；PBS洗片，其中一組向切片滴加稀釋一抗HSP70（1∶500）和Aβ1-42（1∶200），另外一組向切片滴加稀釋一抗HSP70（1:500）和T-Tau（1∶500），置4℃冰箱孵育過夜；PBS洗片，兩組分別向切片滴加稀釋熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h；PBS洗片，向切片滴加DAPI染色液，室溫避光染色10 min。PBS洗片，滴加抗熒光淬滅封片劑，中性樹膠封片。熒光倒置顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間比較采用LSD法，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)改變

與Control組比較，各組小鼠平均游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），Model組小鼠游泳總路程和平臺潛伏期明顯延長，其差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），穿越平臺次數(shù)明顯減少，其差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與Model組比較，GGA組和HLJD組小鼠游泳總路程和平臺潛伏期明顯縮短，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），穿越平臺次數(shù)均有不同程度的增加，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。各組小鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果見表1，各組小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)代表性軌跡圖見圖1.

2.2 各組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70表達(dá)變化

與Control組相比較，Model組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70表達(dá)量增高；與Model組相比較，GGA組和HLJD組小鼠皮層和海馬各個(gè)區(qū)域的綠色熒光表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)，以CA3區(qū)和DG區(qū)更為明顯，見圖2。

2.3 各組小鼠海馬中HSF1、HSP70蛋白表達(dá)變化

與Control組相比較，Model組小鼠海馬組織中的HSF1、HSP70均明顯上升，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義或高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與Model組相比較，GGA組小鼠海馬組織中HSF1有明顯的上調(diào)，其差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），HLJD組與Model組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），GGA組和HLJD組HSP70蛋白的差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。各組小鼠海馬組織中HSF1、HSP70蛋白表達(dá)變化見圖3.

2.4 HLJD組小鼠腦組織中HSP70和Aβ1-42、T-Tau共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鏡下觀察提示，無論是海馬區(qū)還是在皮層，單獨(dú)的紅色熒光數(shù)量多于單獨(dú)的綠色熒光數(shù)量，這說明給予HLJD之后的小鼠腦內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)增多，而Aβ1-42蛋白表達(dá)減少。鏡下可見由紅色熒光的HSP70和綠色熒光的Aβ1-42重疊的黃色熒光，在胞內(nèi)胞外均可見，部分未重疊的HSP70均勻分布在Aβ1-42周圍，這說明兩者確實(shí)具有相同的表達(dá)位置，HSP70蛋白可能在胞內(nèi)胞外都對Aβ1-42蛋白的生成和進(jìn)一步聚集都發(fā)揮了干預(yù)作用。HLJD組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70和Aβ1-42共定位檢測結(jié)果見圖4。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還觀察到了小鼠腦組織中單獨(dú)的HSP70紅色熒光數(shù)量多于單獨(dú)的Tau綠色熒光數(shù)量，這說明給予黃連解毒湯之后的小鼠腦內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)增多，而Tau蛋白表達(dá)減少。鏡下可見由紅色熒光的HSP70和綠色熒光的Tau重疊的黃色熒光，幾乎都分布在胞外，這說明HSP70可能是在胞外發(fā)揮了對Tau磷酸化的抑制作用。HLJD組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70和Tau共定位檢測結(jié)果見圖5。

表1 各組小鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果（，n = 12）

表1 各組小鼠Morris水迷宮檢測結(jié)果（，n = 12）

注：與Control組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Model組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

穿越平臺次數(shù)（n）4.833 ± 2.17 1.417 ± 0.901**3.417 ± 1.677△3.163 ± 2.41△組別Control Model HLJD GGA平均游泳速度（cm/s）7.393 ± 1.155 7.167 ± 1.030 6.897 ± 0.853 6.767 ± 1.115游泳總路程（cm）193.455 ± 35.441 508.917 ± 46.038**468.700 ± 22.166△440.182 ± 83.630△上平臺潛伏期（s）24.455 ± 3.446 67.417 ± 5.299**61.603 ± 3.718△61.818 ± 3.710△

圖1 各組小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)軌跡圖

圖2 各組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70蛋白表達(dá)（免疫熒光，× 400）

圖3 各組小鼠海馬組織中HSF1、HSP70蛋白表達(dá)變化（n = 2）

圖4 HLJD組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70和Aβ1-42共定位（免疫熒光，× 400）

圖5 HLJD組小鼠皮層和海馬區(qū)HSP70和Tau共定位（免疫熒光，×400）

3 討論

中醫(yī)學(xué)對AD的認(rèn)識，尤其是其癥狀和病機(jī)的認(rèn)識由來已久，根據(jù)AD的臨床表現(xiàn)，可以在中醫(yī)古籍“呆病”“癡呆”“健忘”“善言誤”“不慧”“白癡”“不眠”“童昏”“神呆”中找到一些對應(yīng)的記載，這些記述有些比較貼合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對AD的認(rèn)識，也有一些不完全符合[13]，各種記述對AD的病機(jī)及其發(fā)展變化的描述也不盡相同。中醫(yī)學(xué)對AD的治療上多從“虛”“痰”“瘀”論治，以補(bǔ)虛、補(bǔ)腎、化痰、化瘀等痰瘀同治法為主，近年來清熱解毒法防治AD也越來越受到重視，以黃連解毒湯為代表的清熱解毒法治療AD安全有效，可改善AD患者認(rèn)知功能和日常生活能力[8,14]。我們系統(tǒng)梳理了近70年來的文獻(xiàn)報(bào)道，并對文獻(xiàn)中AD相關(guān)的證素信息進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)從1960年開始，對AD的認(rèn)識逐漸從“虛”“痰”“瘀”“腎”“腦”等證素的單一或復(fù)合描述逐漸豐富為“虛”“痰 ”“瘀 ”“熱 ”“毒 ”“腎 ”“脾 ”“ 心 ”“ 腦 ”“ 肝 ”等 證 素 的單一或復(fù)合描述，從以虛證多見到痰瘀為主，且對AD中的“熱”和“毒”的認(rèn)識越來越豐富和細(xì)致，這可能與時(shí)代的變遷，人們的生活水平發(fā)生改變，人均壽命延長、醫(yī)療條件改善、飲食和環(huán)境變化等多因素影響有關(guān)。

在AD患者綿長的病理進(jìn)程中，痰、瘀與熱互相搏結(jié)，釀為濁毒，損傷腦絡(luò)，而致腦消髓減發(fā)為癡呆。熱結(jié)釀毒是AD發(fā)展至不可逆轉(zhuǎn)的終末環(huán)節(jié)的關(guān)鍵病機(jī)，有研究通過中醫(yī)藥知識圖譜分析認(rèn)為癡呆病機(jī)為痰濁蒙竅、瘀阻腦絡(luò)、痰熱、瘀熱[15]。本團(tuán)隊(duì)也從熱（火）論治癡呆的病因病機(jī)理論和作用機(jī)制作了深入探討[16-18]。近年來許多研究者發(fā)現(xiàn)部分抗炎藥和清熱解毒中藥對老年性癡呆產(chǎn)生有利的影響，并由此提出腦神經(jīng)細(xì)胞淀粉樣變性和內(nèi)毒蘊(yùn)積、熱傷腦絡(luò)的科學(xué)假說[19]。黃連解毒湯為瀉火解毒的良方，在現(xiàn)代研究中也發(fā)現(xiàn)該方能下調(diào)β-APP基因表達(dá)，增強(qiáng)清除過氧化物和抗氧化能力，增加海馬組織中SOD和GSH的活性，減少M(fèi)DA的生成，影響I-κB和NF-κB蛋白表達(dá)，改善大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的病理形態(tài)、體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腸道微環(huán)境，還可以通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用，從而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力[20-22]。此外，也有研究證實(shí)了黃連解毒湯可以在血管性疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化的作用[23]，還可以改善糖尿病和心腦血管疾病相關(guān)的代謝物小分子[24]。

HSP70是HSP中結(jié)構(gòu)和功能最保守的蛋白質(zhì)。HSP70是最普遍存在的一類ATP依賴性伴侶蛋白，可在許多不同條件下發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，在細(xì)胞蛋白質(zhì)量控制和降解系統(tǒng)中起著核心作用[25]。在人體中，HSP70多基因家族對由ATP結(jié)合和水解推動的非天然多肽發(fā)揮著作用[26]。HSP70與蛋白質(zhì)底物結(jié)合，以幫助其折疊、降解、運(yùn)輸、調(diào)節(jié)和防止聚集[27-28]。有研究表明HSP可以改善AD腦內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)控線粒體功能、促進(jìn)與泛素的結(jié)合和降解、在突觸膜上阻止錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集、選擇性降解溶酶體中含有共有肽基序的可溶性蛋白，進(jìn)而使AD病理狀態(tài)的減輕甚至恢復(fù)[29]。

在本實(shí)驗(yàn)中，首先用免疫熒光標(biāo)記的方法證實(shí)了在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因的模型組小鼠腦組織中，由于Aβ淀粉樣蛋白異常增加，導(dǎo)致了寡聚態(tài)的Aβ增多，為了探索清熱解毒法是否是通過調(diào)控HSP70發(fā)揮的作用，本實(shí)驗(yàn)對各組小鼠腦組織中的HSP70進(jìn)行了標(biāo)記，鏡下可見C57正常小鼠的空白對照組無論是皮層還是海馬區(qū)均有少量綠色熒光表達(dá)，Hoshino等[4,30]報(bào)道了轉(zhuǎn)基因AD小鼠的大腦中HSP70表達(dá)水平的升高，這與我們觀察到的結(jié)果一致。各給藥組小鼠皮層和海馬各個(gè)區(qū)域的HSP70綠色熒光表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)，以CA3區(qū)和DG區(qū)更為明顯，這說明清熱解毒可能通過上調(diào)HSP70蛋白發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步對各組小鼠海馬組織中的HSF1、HSP70進(jìn)行了Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通C57小鼠相比，模型組小鼠海馬組織中的HSF1、HSP70均明顯上升。與模型組相比，普瑞酮組小鼠海馬組織中HSF1有明顯的上調(diào)，而黃連解毒湯組與模型組則沒有明顯差異，其余各給藥組與模型組相比，HSP70蛋白的差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HSF1是HSP70激活的上游調(diào)控蛋白，普瑞酮組可以直接激活HSF1的表達(dá)，從而促進(jìn)HSP70蛋白的表達(dá)，故而普瑞酮組組HSF1蛋白的表達(dá)明顯高于其它各組，進(jìn)一步提示黃連解毒湯可能是通過調(diào)控HSP70來發(fā)揮改善小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能的作用。

為進(jìn)一步探索HSP70是不是通過直接抑制Aβ和Tau蛋白聚集發(fā)揮改善小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能作用，結(jié)合既往研究者的研究基礎(chǔ)，通過免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察了HSP70蛋白和Aβ、Tau蛋白之間的共定位關(guān)系，初步推定它們之間可能的作用關(guān)系。在鏡下觀察到，無論是海馬區(qū)還是在皮層，單獨(dú)的HSP70熒光數(shù)量多于單獨(dú)的Aβ熒光數(shù)量，這說明給予黃連解毒湯后的小鼠腦內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)增多，而Aβ蛋白表達(dá)減少。胞內(nèi)外均可見由紅色熒光的HSP70和綠色熒光的Aβ重疊的黃色熒光，部分未重疊的HSP70均勻分布在Aβ周圍，這說明兩者確實(shí)具有相同的定位關(guān)系，HSP70蛋白可能在胞內(nèi)外都對Aβ蛋白的生成和進(jìn)一步聚集都發(fā)揮了干預(yù)作用。同時(shí)還在鏡下觀察到了小鼠腦組織中單獨(dú)的HSP70紅色熒光數(shù)量多于單獨(dú)的Tau綠色熒光數(shù)量，這說明給予黃連解毒湯之后的小鼠腦內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)增多，而Tau蛋白表達(dá)減少。鏡下可見由紅色熒光的HSP70和綠色熒光的Tau重疊的黃色熒光幾乎都分布在胞外，這說明HSP70可能是在胞外發(fā)揮了對Tau磷酸化的抑制作用。

綜合上述分析，黃連解毒湯可改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與其上調(diào)HSP70蛋白抑制Aβ沉積以及Tau磷酸化有關(guān)。