胡 寅，崔 莎，李卓君，胡 琴，邱志方

（1.湖北文理學院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院 襄陽 441003；2.襄陽愛爾眼科醫(yī)院 襄陽 441003）

糖尿病性視網膜病變是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，該病可分為增殖性和非增殖性，其中增殖性已經成為成年人致盲的主要原因[1-2]。中國是糖尿病第一大國，預計達到2030年，糖尿病性視網膜病變的患病率已經高達22.4%[3]。目前全球糖尿病性視網膜病變已經超過1700萬[4]，故對糖尿病性視網膜病變的防治具有非常重要的意義。糖尿病性視網膜病是與高糖相關的慢性進行性視網膜疾病[5]。糖尿病視網膜病變的發(fā)病率比較高，相關研究報道顯示，5年內的糖尿病患者發(fā)生糖尿病視網膜病變的發(fā)病率為4.7%[6]，10年以內發(fā)生糖尿病視網膜病變的發(fā)病率為7.9%[7]。糖尿病性視網膜病變的發(fā)生和發(fā)展會引起不同程度的視覺損傷和視力減退。

糖尿病視網膜神經病變主要病理改變?yōu)樯窠浤z質細胞增生和神經節(jié)細胞凋亡，高糖環(huán)境下，低血流灌注會引起視網膜缺氧、缺血，導致神經營養(yǎng)因子缺乏、視網膜神經水腫以及維軸漿流中斷，引起視網膜神經的原發(fā)性損傷[8-9]。因此，保護高糖損傷的神經節(jié)細胞能延緩或可減輕視網膜神經變性。另外，也有研究顯示糖尿病視網膜神經病變與氧化應激損傷有關。氧化應激可以損害視網膜內皮細胞和線粒體，導致視網膜缺血缺氧，加重炎癥反應，使細胞發(fā)生凋亡，最終出現視網膜出血和滲出等[10-11]。

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然的多酚植物抗毒素，存在于葡萄、藍莓、蔓越莓等天然植物中[12]。RES具有抗氧化活性、改善炎癥、清除自由基、延緩衰老、保護神經和心血管的作用[13]。已有研究表明，RES對青光眼視網膜損傷具有一定的保護作用[14]。然而RES是否能改善高糖誘導的視網膜神經節(jié)細胞損傷既往少有報道。本研究用鏈脲佐菌素誘導小鼠發(fā)生糖尿病并用RES進行干預，提取小鼠視網膜神經節(jié)細胞，檢測神經節(jié)數量及凋亡情況，并檢測氧化應激指標、核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶1（Heme oxygenase-1，HO-1）通路的變化，以期為臨床糖尿病性視網膜病變治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

野生型C57BL/6小鼠60只和Nrf2敲除的C57BL/6小鼠20只，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。12周齡，體質量（28±2）g，許可證號SCXK（湘）2019-0004，將野生型C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組、高糖組和RES組，每組20只，Nrf2敲除的C57BL/6小鼠為RES+Nrf2敲除組。

1.2 主要試劑

白黎蘆醇，購自美國Selleck，批號：L13007；RIPA蛋白裂解液，購自武漢Servicebio公司，批號：GB 21009；HE染色液，購自碧云天生物技術研究所，批號：G1016；Bax、Cleaved Caspase3、Nrf2、HO-1一抗，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：A10036、A12013、A10017、A12073；多聚甲醛購自美國sigma公司，批號B5011；BCA蛋白試劑盒，美國Millipore，批號M0119；MDA、SOD、8-OHdG含量試劑盒，購自北京索萊寶公司，批號190314、190607、190523。

1.3 主要儀器

XSP-63XDV型倒置熒光顯微鏡（上海光學儀器）；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀）；Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific）；酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病視網膜病變小鼠模型構建和藥物干預

小鼠模型的構建和藥物干預參考Luo等[15]人的研究方法進行，高糖組和RES組、RES+Nrf2敲除組中的小鼠禁食8-10 h，按照小鼠體質量60 mg·kg-1劑腹腔注射鏈脲佐菌素，連續(xù)注射5天后，第7天取小鼠尾部靜脈血檢測血糖，血糖＞11.1 mmol·L-1作為糖尿病成功建模的標準，對照組小鼠連續(xù)注射等量的檸檬酸緩沖液5天。再將各組小鼠連續(xù)飼喂專用飼料3個月，每個月進行1次眼底檢查，糖尿病小鼠出現視網膜出血或者新生血管，即糖尿病視網膜病變小鼠模型成功，對照組的小鼠給予正常飼料喂養(yǎng)。將RES溶解在25%乙醇中，然后用生理鹽水稀釋，RES組和RES+Nrf2敲除小鼠每天腹腔注射20 mg·kg-1的RES，連續(xù)注射5天，對照組小鼠注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射5天。

1.4.2 HE染色

將小鼠麻醉并處死，取出大鼠的部分視網膜組織在4%多聚甲醛中進一步固定1 h。用不同濃度的酒精作為脫水劑，逐漸去除組織塊中的水分。用二甲苯代替組織塊中的酒精，然后用蠟包埋組織，切片機取薄切片。蘇木精和伊紅溶液染色，光學顯微鏡拍照。

1.4.3 神經節(jié)細胞提取和鑒定

按照Altmann[16]等方法提取各組小鼠的視網膜神經節(jié)細胞，小鼠麻醉處死，鈍性分離眼球，去角膜，鞏膜、玻璃體，分離獲得到視網膜神經上皮層，置于玻璃試管的木瓜蛋白酶混合溶液中。20 min后，丟棄液體，加入DMEM/F12細胞培養(yǎng)液制成懸液，調整細胞密度10×106cells·mL-1，將稀釋后的細胞懸液加入6孔板中，顯微鏡下觀察細胞濃度及細胞貼壁，將稀釋后的5-Fu和尿苷混合儲備溶液加入6孔板中，置于37℃的5%的CO2中培養(yǎng)，24 h后，棄去原培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，加l mL破膜工作液，室溫孵育l0 min，PBS洗3次，滴加3%的過氧化氫溶液，避光孵育20 min，棄除3%過氧化氫溶液，滴加一抗Brn3a，4oC孵育過夜。再加CY3標記二抗，室溫孵育50 min，加入非特異性細胞核染色液DAPI染液，室溫孵育，統(tǒng)計每個視網膜顯微鏡視野內的細胞數量，使用Image J軟件進行手工計數。

1.4.4 流式細胞儀檢測

視網膜神經節(jié)細胞凋亡率收集各組細胞樣本，采用熒光雙染色法（Annexin V-FITC/PI）在流式細胞儀上進行細胞凋亡率檢測，PBS洗滌貼壁細胞，加入胰酶消化細胞，再加入培養(yǎng)基終止消化，用移液槍輕輕吹打細胞制成懸液，轉移至流式管，離心處理，300 r·min-1離心5 min，棄上清，加入3 mL PBS重新懸浮細胞，采用300 μL Binding Buffer重懸，在加入5 μL Annexin V-FITC和PI，避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測。

1.4.5 氧化應激指標檢測

每組取5只小鼠分離小鼠視網膜組織，采用RIPA裂解液均漿，然后進行離心處理，4℃離心25 min（2500 r·min-1），按ELISA試劑盒說明書操作，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量。

1.4.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白及Nrf2和Ho-1蛋白表達

每組取5只小鼠分離小鼠視網膜組織，采用RIPA緩沖液收集蛋白樣品，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，使用12% SDS-PAGE在140 V電壓下分離樣品中的不同蛋白質，然后以300 mA的電流將蛋白質轉移到PVDF膜上，加入Bax（1∶500稀釋）、Cleaved Caspase3（1∶500 稀 釋）、Bcl2（1∶500 稀釋）、Nrf2（1∶1000稀釋）和HO-1（1∶1000稀釋）一抗，37℃孵育1 h，PBS緩沖液洗3次。然后，將山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）與該膜在37℃下孵育1 h，滴加ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝光，A1phaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.4.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計學分析，數據均符合正態(tài)分布，采用t檢驗或ANOVA檢驗。以均數±標準差（）表示，多樣本間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RES對視網膜組織的影響

HE染色結果顯示，高糖組的視網膜神經節(jié)細胞層（GCL）和內核層（INL）明顯的消失或減少，外核層（ONL）厚度也顯著下降。與高糖組相比，RES組可以減輕高糖誘導引起的損傷，而RES+Nrf2敲除組較RES組相比，視網膜神經節(jié)細胞層（GCL）、內核層（INL）有所減少，外核層（ONL）厚度有所降低，見圖1A。高糖組視網膜厚度明顯低于對照組（P＜0.01），RES組視網膜厚度顯著高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組視網膜厚度相對低于RES組（P＜0.05）。見圖1B。

2.2 RES對神經節(jié)細胞數量的影響

高糖組中的神經節(jié)數量明顯低于對照組（P＜0.05），RES組中的神經節(jié)數量明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的神經節(jié)數量顯著低于RES組（P＜0.05），見圖2。

2.3 RES對神經節(jié)細胞凋亡的影響

高糖組中的凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的凋亡率明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的凋亡率顯著高于RES組（P＜0.05），見圖3。

2.4 RES對神經節(jié)細胞凋亡相關蛋白的影響

高糖組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達顯著高于RES組（P＜0.05），見圖4A、4B和4C；高糖組中的Bcl2蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.05），RES組中的Bcl2蛋白表達明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的Bcl2蛋白表達顯著低于RES組（P＜0.05），見圖4A和4D。

2.5 RES對小鼠視網膜氧化應激的影響

高糖組中的SOD水平明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的SOD水平明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的SOD水平顯著低于RES組（P＜0.05），見圖5A；高糖組中的MDA和8-OHdG水平明顯低于對照組（P＜ 0.05），RES組中的MDA和8-OHdG水平明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的MDA和8-OHdG水平顯著高于RES組（P＜0.05）。見圖5B和5C。

圖1 視網膜組織HE染色（×100）

圖2 RES對神經節(jié)細胞數量的影響

2.6 RES對Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

高糖組中Nrf2和HO-1的蛋白表達顯著低于對照組（P＜0.05），RES組中Nrf2和HO-1的蛋白表達明顯高于高糖組（P＜0.01），RES+Nrf2敲除組Nrf2和HO-1的蛋白表達顯著低于RES組（P＜0.05）。見圖6A和6B。

圖3 RES對神經節(jié)細胞凋亡的影響

圖4 RES對神經節(jié)細胞凋亡相關蛋白的影響

圖5 RES對小鼠視網膜氧化應激的影響

圖6 RES對Nrf2和Ho-1蛋白表達的影響

3 討論

3.1 高糖誘導視網膜神經節(jié)細胞損傷

在視網膜的各級神經元中，神經節(jié)細胞是視網膜中唯一參與形成視神經纖維的神經元，也是唯一把視網膜視覺信息傳遞到視覺中樞的傳出神經元，在視覺形成中有重要作用[17]。高糖導致的神經節(jié)細胞損傷主要與谷氨酸興奮性毒性、免疫炎癥損傷、氧化應激、線粒體功能障礙、鈣離子超載和神經營養(yǎng)因子缺乏等有關[18]。本研究建立糖尿病視網膜病變小鼠模型，發(fā)現視網膜神經節(jié)細胞層和內核層明顯消失或減少，外核層厚度也顯著下降，另外神經節(jié)數量明顯減少。另外還發(fā)現，高糖可導致視網膜神經節(jié)細胞的凋亡明顯增加，并且出現氧化應激損傷。這與既往報道一致[17]。

3.2 RES對視網膜神經節(jié)細胞損傷、凋亡及氧化應激的改善作用

現代藥理學研究顯示[14]，RES具有抗氧化活性、改善炎癥、清除自由基、延緩衰老、保護神經和心血管的作用，被證實可有效抑制視網膜損傷。然而RES對高糖誘導的視網膜神經節(jié)細胞損傷的改善作用既往少有報道。本研究采用HE染色驗證RES對視網膜組織的影響，結果顯示RES可以減輕高糖誘導引起的損傷，增加神經節(jié)數量，以及GCL、INL和ONL。視網膜損傷與氧化應激、凋亡密切相關。糖尿病可造成視網膜神經節(jié)細胞軸突突觸功能障礙和不可逆的損傷，從而阻斷視覺信號的傳遞，導致視網膜神經節(jié)細胞凋亡，最終造成視功能不可逆性損傷[19]。氧化應激可以損害視網膜內皮細胞和線粒體，導致視網膜缺血缺氧，加重炎癥反應，進一步促進細胞凋亡，最終出現視網膜出血和滲出等[10-11]。本研究發(fā)現，RES干預后SOD水平升高，MDA和8-OHdG水平明顯降低，同時Nrf2和Ho-1的蛋白表達明顯升高。另外Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達水平降低，而Bcl2蛋白表達水平升高，提示RES可以通過降低凋亡和氧化損傷而改善受損的視網膜神經節(jié)細胞。

3.3 RES通過Nrf2/HO-1通路發(fā)揮作用

Nrf2/HO-1通路與氧化應激密切相關，是保護機體免遭活性氧導致內源性和外源性應激損傷的主要細胞通路，Nrf2是細胞抗氧化應激的關鍵轉錄因子，當受到氧化活性物質刺激時Nrf2和HO-1啟動子部位結合，調控下游抗氧化酶和II相代謝酶基因的轉錄活動，增強機體抗氧化能力[20]。越來越多的研究表明，Nrf2/HO-1通路在糖尿病大鼠視網膜氧化應激反應中起著最重要的作用，比如白皮杉醇可通過激活Nrf2/HO-1通路促使糖尿病大鼠視網膜氧化還原狀態(tài)的恢復[21]，樺褐孔菌多糖經Nrf2信號通路可明顯抑制糖尿病大鼠視網膜組織氧化應激和炎癥反應[22]。RES是否可作用于Nrf2/HO-1通路，既往未見報道。但有研究發(fā)現[23]，RES對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷具有保護作用，而這種保護作用可能依賴于HO-1的表達。本研究敲除Nrf2基因后，RES對視網膜神經節(jié)細胞的抗凋亡和抗氧化應激作用發(fā)生逆轉，提示RES可能是通過Nrf2/HO-1通路發(fā)揮作用。

3.4 總結

綜上所述，RES對糖尿病性視網膜病變小鼠視網膜和神經節(jié)細胞具有一定的保護作用，RES通過激活Nrf2和HO-1抑制氧化應激，從而抑制神經節(jié)細胞的凋亡，保護糖尿病性視網膜病變視網膜的完整性。