徐玉平，譚 榮，蔣向輝

（凱里學院大健康學院 凱里 556011）

肝細胞癌（HCC）是一種死亡率很高的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率居世界第六位，死亡率居世界第四位[1]，其在40歲前發(fā)生率較少，而后隨著年齡逐漸升高，70歲達到頂峰，男性發(fā)病率是女性的2-4倍。酒精性肝硬化、肝炎病毒感染、吸煙等是其重要的致病原因。HCC早期不易察覺，病情發(fā)展至中晚期后，常出現(xiàn)食欲減退、乏力、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，還可兼發(fā)上消化道出血、肝昏迷、肝癌破裂出血、肝腎衰竭等嚴重并發(fā)癥。HCC惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預后轉(zhuǎn)歸較差，因此，有“癌中之王”之稱[2]。目前，肝細胞癌的治療手段有手術切除、局部消融、肝臟移植、放化療、介入栓塞術等，但存在供體有限、費用高昂、毒副作用多、易產(chǎn)生耐藥性及腫瘤異質(zhì)性強[3-5]等問題。近年來很多研究表明中藥可通過多通路抗肝癌組織血管生成，抑制癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，對肝細胞癌具有一定治療作用[6]，而且還能增強機體抵抗力、改善臨床癥狀、緩解放化療帶來的不良反應，提高患者生活質(zhì)量。

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi），性寒，味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主治濕溫、暑濕，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，癰腫瘡毒，胎動不安。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有保肝、利膽、抗炎、抗菌、增強免疫、抗腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)保護和心腦血管保護等多種藥理活性[7]，在榮震主任醫(yī)師治療HCC的學術經(jīng)驗整理研究中[8]，無論是復方還是單味藥治療使用頻次最高的前10味中藥都包括黃芩。文獻報道，黃芩湯輔助序貫肝動脈化療栓塞術對原發(fā)性肝癌患者的治療總有效率為67.86%，顯著高于不加黃芩湯對照組的48.21%，治療后患者的NF-κB、HIF-1α水平、AFP、腫瘤體積顯著低于對照組（P＜0.01），抑制了肝癌細胞的生長和擴散[9]。然而關于黃芩治療HCC的臨床研究和相關分子機制卻少見報道。因此，從基因水平深入探討黃芩抗肝細胞癌的核心靶點及其相關分子機制，對HCC的防治具有重要意義，也為黃芩及其有效成分在防治肝癌方面的深入研究、開發(fā)和臨床應用提供參考。

加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）是一種系統(tǒng)生物學方法，通過引入加權的相關系數(shù)，構建共表達的基因模塊，能從高通量數(shù)據(jù)中挖掘出模塊信息，描述不同樣品之間的基因關聯(lián)模式，根據(jù)模塊的內(nèi)聯(lián)性和模塊與表型之間的關聯(lián)性鑒定候補生物標記物或治療標靶。曾祎凡等[10]利用WGCNA技術挖掘促進乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關鍵基因，發(fā)現(xiàn)DDX5和ACTB在循環(huán)腫瘤細胞內(nèi)高表達，其中DDX5很可能是促進乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關鍵基因，在臨床上，DDX5可作為乳腺癌轉(zhuǎn)移早期鑒別的循環(huán)腫瘤細胞標志物，也能為改善乳腺癌預后提供新的治療靶點。由此可見，WGCNA技術廣泛應用于基因靶點或疾病生物標志物的篩選之中，適用于中藥生物活性成分結(jié)合高通量數(shù)據(jù)聯(lián)合闡述疾病潛在的作用基因及多成分、多靶點、多通路的分子機制。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法篩選黃芩的有效活性成分及基因靶點，通過WGCNA分析TCGA和GEO中的HCC相關數(shù)據(jù)，挖掘HCC的hub基因，并對這些基因進行總生存期、無病生存期分析以及免疫組化驗證，同時聯(lián)合GO生物學功能富集分析、KEGG信號通路富集分析進一步探索黃芩抗HCC的相關分子機制，為后期開展黃芩防治HCC的實驗和臨床研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 黃芩活性成分及其靶點的篩選與PPI網(wǎng)絡構建

中藥系統(tǒng)藥理學（TCMSP）數(shù)據(jù)庫收納了在中國藥典中注冊的499種中草藥，包含29 384種成分，3311種靶標和837種相關疾病，提供十二種與ADME（Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion）相關的重要特性，如口服生物利用度、類藥性、半衰期、Caco-2滲透性、血腦屏障等，用于藥物篩選和評估[11]，其中口服生物利用度（OB）、腸上皮細胞通透性（Caco-2）和類藥性（DL）等被認為是中草藥有效性的關鍵指標[12]。本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索黃芩的全部活性成分及其作用靶點，以口服生物利用度（OB）≥40%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[11]，得到黃芩主要的有效活性成分及其對應的作用靶點。再通過檢索UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得去重復項后的靶點蛋白的基因symbol，將靶點上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設置“highest confidence（≥0.900）”，獲得靶點蛋白的相互作用信息及其相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡圖，接著導入Cytoscape3.6.1，利用cytoHubba插件計算MCC（中心性），篩選連接程度排名前15的基因為黃芩抗HCC候選基因靶點。

1.2 HCC數(shù)據(jù)下載

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載與HCC相關的424個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包括正常樣本50個，腫瘤樣本374個，相關參數(shù)設置為：數(shù)據(jù)類別勾選轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、表達類別勾選基因表達量、Workflow類別勾選HTSeq-Counts、組織類別勾選肝和肝內(nèi)膽管、數(shù)據(jù)庫勾選TCGA，數(shù)據(jù)集勾選樣本量最多的一個數(shù)據(jù)庫（即TCGA-LIHC）。

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載與HCC相關的377個臨床數(shù)據(jù)，其中包括病人的生存時間、生存狀態(tài)、性別、年齡、肝癌分期等數(shù)據(jù)，相關參數(shù)設置為：數(shù)據(jù)類別勾選臨床數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)格式勾選bcr xml，組織類別、數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)集與下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時的參數(shù)一致。

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE41804數(shù)據(jù)集的探針矩陣文件，該數(shù)據(jù)集含有20個HCC腫瘤樣品和20個非腫瘤樣品，通過基因芯片平臺GPL570 [HGU133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array下載數(shù)據(jù)集GSE41804的相關注釋信息文件。

1.3 HCC差異基因篩選

利用R語言（4.0.3版）對TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行整理，使用edgeR數(shù)據(jù)包篩選差異表達基因，以log|FC|＞1、FDR＜0.05為篩選條件，通過limma數(shù)據(jù)包獲得差異基因（DEGs），再使用ggplot2、pheatmap數(shù)據(jù)包得到差異基因的聚類熱圖和火山圖，并輸出差異基因的RPKM值用于后續(xù)分析。

GEO數(shù)據(jù)同樣利用R語言（4.0.3版）進行處理，通過使用limma、ggplot2、pheatmap數(shù)據(jù)包得到差異基因及其聚類熱圖和火山圖。

1.4 WGCNA分析

利用R語言（4.0.3版）的WGCNA包構建HCC加權基因共表達網(wǎng)絡，對基因和模塊、基因與臨床性狀進行相關性分析。先通過樣本聚類樹算法過濾掉離群樣本，以保證共表達網(wǎng)絡構建的穩(wěn)定性，同時使共表達網(wǎng)絡中的基因之間的連接服從無尺度網(wǎng)絡分布，然后利用Pick Soft Threshold函數(shù)選擇最合適的軟閾值β。隨后，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓撲重疊矩陣（TOM）以降低虛假相關性和噪聲，計算出1-TOM作為共表達網(wǎng)絡互連的重要生物學指標和基因聚類的距離指標，再采用動態(tài)樹切割算法識別基因模塊，每個模塊至少包含50個基因。最后，計算基因模塊的特征值（ME），對模塊進行層次化聚類，以0.25為剪切高度合并相似模塊，并用不同顏色加以標記，根據(jù)模塊特征關系（ME與臨床特征之間成對的皮爾遜相關性，相關系數(shù)＞0.80）確定具體的模塊。繪制出聚類模塊特征熱圖，并計算MM值（基因顯著性與模塊顯著性的相關系數(shù)）和GS值（基因與臨床特征的相關系數(shù)）?；蝻@著性（GS）定義為基于臨床特征與基因表達之間的線性回歸P值（GS=logP）的log10變換，模塊顯著性（MS）是指模塊中所有基因的GS的平均值。

1.5 HCC交集基因篩選

一般認為hub基因需要滿足以下條件：GS＞0.2，MM＞0.8，P≤0.05[13]。MS與GS的絕對值越大，說明與疾病越相關。根據(jù)WGCNA分析所獲得的聚類模塊特征熱圖，選擇與正常樣本、腫瘤樣本正相關性最高的兩個基因模塊進行數(shù)據(jù)合并，對TCGA、GEO數(shù)據(jù)進行相同處理后，利用R語言（4.0.3版）的VennDiagram數(shù)據(jù)包對上述合并后的兩個模塊基因與TCGA、GEO的差異基因取交集，輸出文本文件并繪制Venn圖，得到最終的HCC相關基因，并將得到的交集基因與黃芩的15個候選基因靶點進行比對，獲得黃芩抗HCC的潛在基因靶點。

1.6 GO與KEGG富集分析

利用R語言（4.0.3版）的org.Hs.eg.db數(shù)據(jù)包對上述交集基因進行ID轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后獲得相應的entrezID，再利用 R 語言（4.0.3版）的 clusterProfiler、enrichplot、ggplot2等數(shù)據(jù)包對交集基因進行GO、KEGG富集分析。

1.7 hub基因識別

將WGCNA構建的hub基因模塊中的全部基因取交集后，導入STRING數(shù)據(jù)庫，基因間相關性打分設置為0.900，從而獲得交集基因網(wǎng)絡關系文件，通過Cytoscape3.6.1對網(wǎng)絡文件進行可視化分析，下載插件CytoHubba計算每個節(jié)點的最大團中心性分數(shù)（MCC值）并排序，將得分排名前10的基因作為hub基因，并將hub基因與黃芩抗HCC的潛在基因靶點整合，用于下一步分析。

1.8 OS與DFS分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對hub基因進行OS、DFS分析，根據(jù)HCC患者hub基因表達量的中位數(shù)進行分組，將HCC患者分為低表達組和高表達組，置信區(qū)間設置為95%并計算P值，癌癥類型選擇LIHC（肝細胞癌），繪制生存曲線用于可視化分析，篩選與HCC相關的核心基因。

1.9 免疫組化驗證

進入HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/），分別在搜索攔中輸入上述篩選到的核心基因名點擊搜索，選擇“pathology”進入病理界面，看該基因在腫瘤樣品中的免疫組化圖譜，找到“protein expression”,找到肝癌，點擊進入肝癌頁面，向下拉可以找到免疫組化的圖片?？贵wHPA代碼必須與正常樣品保持一致。如若要看基因在正常樣品中的免疫組化圖片，可以在搜索欄輸入基因名后，點擊“Tissue”進入組織頁面，余下操作同腫瘤樣品。收集免疫組化圖譜信息，根據(jù)蛋白質(zhì)在組織細胞中的染色程度以及染色細胞百分比，比較正常組織和HCC組織中蛋白表達的差異，并下載保存相應的免疫組化圖片。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分及靶點與PPI網(wǎng)絡

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索到黃芩化學成分143種，以OB≥40%、DL≥0.18為篩選條件，得到19種主要活性成分，分別為黃芩新素、欖核蓮黃酮、甲氧基黃酮、黃芩黃酮II、甲氧基查爾酮、二氫木蝴蝶素、苯基苯并吡喃酮、鼠尾草素、表兒茶素、二甲氧基黃酮、蘇薺苧黃酮、豆甾醇、二羧酸苯酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、表小檗堿、千層紙素、黃烷酮、紅花素、二氫黃芩苷，見表1，其中黃芩新素的OB值、DL值最高，可能是黃芩抗HCC最主要的生物活性成分。

表1 黃芩主要活性成分及其OB、DL值表

19種主要活性成分的靶點去重復項后，導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡，見圖1。將靶點蛋白的相互作用信息文件導入Cytoscape3.6.1，利用cytoHubba插件提取中心子網(wǎng)絡，以MCC進行排序獲得的前15個候選基因靶點依次為 NCOA1、NCOA2、ESR1、AR、RXRA、PPARG、PGR、ESR2、MAPK14、ADRA1B、ADRB2、CYP2C9、PTGS2、ADRA1A、CHRM3，見圖2。

2.2 HCC差異基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載與HCC相關的424個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本，共包括13913個基因，篩選后獲得2703個差異基因，其中下調(diào)基因1680個（左側(cè)），上調(diào)基因1023個（右側(cè)），火山圖見圖3A。

從GEO數(shù)據(jù)庫下載的與HCC相關的20個腫瘤樣品和20個非腫瘤樣品，共包括21 655個基因，篩選后獲得1050個差異基因，其中下調(diào)基因621個（左側(cè)），上調(diào)基因429個（右側(cè)），火山圖見圖3B。

圖1 黃芩主要活性成分靶點的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

圖2 以MCC進行排序獲得的前15個候選基因靶點圖（黃芩）

圖3 HCC差異基因火山圖

2.3 WGCNA分析

本研究中，TCGA數(shù)據(jù)選擇軟閾值β=3（無尺度R2=0.9），動態(tài)樹切割共識別出9個基因模塊，見圖4A；GEO數(shù)據(jù)則選擇軟閾值β=2（無尺度R2=0.9），動態(tài)樹切割共識別出11個基因模塊，見圖4B?；蚰K與臨床性狀之間的相關性如下圖所示，可知TCGA數(shù)據(jù)中與正常樣本、腫瘤樣本正相關性最高的模塊分別是黃綠色模塊（MEgreenyellow，R=0.64，P=2e-50）、藍色模塊（MEblue，R=0.69，P=8e-62），見圖4C；GEO數(shù)據(jù)中與正常樣本、腫瘤樣本正相關性最高的模塊分別是藍色模塊（MEblue，R=0.44，P=0.005）、青綠色模塊（MEturquoise，R=0.75，P=2e-08），見圖4D。因此，我們選擇這四個模塊中的差異基因進行下一步分析。

2.4 HCC交集基因

如圖5所示，TCGA數(shù)據(jù)中黃綠色模塊和藍色模塊合并后共4701個基因，GEO數(shù)據(jù)中藍色模塊和青綠色模塊合并后共5928個基因，這些基因與TCGA數(shù)據(jù)中的2703個差異基因、GEO數(shù)據(jù)中的1050個差異基因取交集，共得到115個基因，而后將這115個交集基因與黃芩的15個候選基因靶點進行一一比對，獲得黃芩抗HCC的潛在基因靶點ADRA1A。

圖4 WGCNA聚類樹狀圖及聚類模塊特征熱圖

圖5 交集基因與差異基因Venn圖

2.5 GO與KEGG富集分析

圖6 基因富集分析圖

GO分析結(jié)果如圖6A所示，上述115個交集基因富集在體液免疫反應、細胞粘附、補體激活、呼吸系統(tǒng)發(fā)育、細胞過渡金屬離子穩(wěn)態(tài)、BMP信號通路的調(diào)節(jié)、反射等生物學過程（BP）；KEGG分析結(jié)果如圖6B所示，上述115個交集基因富集在膽固醇代謝、礦物質(zhì)吸收、基底細胞癌、泛醌和其他萜類醌的生物合成、視黃醇代謝、細胞粘附、吞噬體等通路。如圖7所示，交集基因在HCC中主要涉及Wnt信號通路，即Wnt與細胞膜上的受體結(jié)合，激活第二信使Dvl，從而抑制由GSK-3β、Axin、APC組成的三元復合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β正常磷酸化，造成β-catenin在胞漿內(nèi)大量積聚并移向細胞核內(nèi)，進而與細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活TCF轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)靶基因的表達。

2.6 hub基因識別

通過Cytoscape3.6.1的cytoHubba插件提取上述115個交集基因的中心子網(wǎng)絡，使用CytoHubba插件中的MCC算法計算網(wǎng)絡中每個節(jié)點的最大團中心性分數(shù)（MCC值），按MCC值的大小進行排序，MCC得分排名前10的關鍵基因依次為FCN2、COLEC11、CFP、COLEC10、FCN3、C7、LCN2、HAMP、B3GAT1、LYVE1。將這10個基因與黃芩抗HCC的潛在基因靶點ADRA1A整合，用于下一步分析。

2.7 OS與DFS分析

根據(jù)總生存期曲線和無病生存期曲線，觀察整合后的11個基因在總生存期與無病生存期的基因表達差異是否具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），從而進一步篩選出與HCC密切相關的核心基因。OS分析結(jié)果顯示，具有統(tǒng)計學意義的基因有FCN3（P=0.033）、ADRA1A（P=0.012）、C7（P=0.03）、COLEC10（P=0.015），且這些基因高表達的患者前80個月生存率更高；DFS分析結(jié)果顯示，具有統(tǒng)計學意義的基因有CFP（P=0.029）、FCN3（P=0.0086），且這些基因高表達的患者同樣生存率更高，見圖8。因此，這5個基因可能是黃芩治療HCC的核心基因，分別為纖維膠凝蛋白3（FCN3）、腎上腺素能α1A受體（ADRA1A）、補體C7（C7）、凝集蛋白家族 10（COLEC10）、補體因子備解素（CFP）。其中，纖維膠凝蛋白3在OS、DFS分析中均具有統(tǒng)計學意義，可能是與HCC關系最密切的基因。

圖7 交集基因生成的HCC相關信號通路

圖8 HCC的5個密切相關基因OS、DFS分析

圖9 肝正常組織與HCC組織的免疫組化圖

2.8 免疫組化驗證

通過HPA數(shù)據(jù)庫分別檢索COLEC10、CFP、ADRA1A，免疫組化結(jié)果為空；FCN3、C7免疫組化結(jié)果如圖9所示，抗體CAB025945在正常肝組織中FCN3呈現(xiàn)中等強度染色，在HCC組織中則呈現(xiàn)低強度染色，染色細胞百分比為25%-75%；抗體HPA001465在正常肝組織中C7呈現(xiàn)高強度染色，在HCC組織中則呈現(xiàn)中等強度染色，染色細胞百分比均超過75%。這表明與正常肝組織相比，HCC組織中FCN3、C7基因表達量降低，該結(jié)果與OS、DFS分析所得結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，發(fā)現(xiàn)黃芩可能是通過黃芩新素、欖核蓮黃酮、二氫黃芩苷等活性成分，降低ADRA1A甲基化頻率從而干預HCC的發(fā)生；通過對TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中HCC相關數(shù)據(jù)進行差異基因篩選、WGCNA分析、GO與KEGG富集分析，并經(jīng)過OS、DFS、HPA 分析驗證，發(fā)現(xiàn) FCN3、C7、COLEC10、CFP可能是HCC的核心基因，其作用機制可能涉及體液免疫、補體激活、吞噬作用調(diào)節(jié)和細胞凋亡等過程。

黃芩化學成分眾多，目前為止已被發(fā)現(xiàn)的約有40多種，包括黃酮類化合物、萜類、氨基酸、甾醇、揮發(fā)油和其他成分，其中黃酮類化合物是黃芩主要的有效成分和特征性成分。研究表明，黃酮類化合物中發(fā)揮抗肝癌作用的主要是黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷4種活性物質(zhì)。杜忠良等[14]發(fā)現(xiàn)黃芩素能抑制肝癌移植瘤的生長、誘導腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能與調(diào)控PI3K-AKT通路有關。魯興梅等[15]認為黃芩苷可抑制肝癌荷瘤小鼠瘤組織的增長，其作用機制可能與下調(diào)瘤組織PI3K、AKT和m TOR基因及蛋白表達有關。王曉東[16]證明漢黃芩素能通過線粒體信號通路促進人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡、抑制人肝癌SMMC-7721細胞增殖。本研究綜合網(wǎng)絡藥理學、癌癥基因組圖譜和基因芯片技術，得到黃芩新素、欖核蓮黃酮、二氫木蝴蝶素、二氫黃芩苷等19種黃芩主要活性成分，其中黃芩新素的口服利用度高達104.34%，類藥性也達到了0.44，具有很高的研究價值。而且目前國內(nèi)外對黃芩有效活性成分的研究多集中在黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等含量較高的黃酮類成分，對于黃芩新素的研究非常少，而且多集中在提取及制備工藝方面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芩新素是誘導白血病細胞HL-60和K562凋亡的主要活性成分，其通過上調(diào)PP2A表達，下調(diào)miR-21表達，使PI3K/AKT/mTOR信號通路失活，從而降低肺癌發(fā)生率[17]。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雖然黃芩新素在黃芩中的含量較低，但它能特異性結(jié)合在免疫抑制和腫瘤生長中起重要作用的靶蛋白STAT3。因此，我們猜測黃芩新素是否也能作為一個重要的活性物質(zhì)發(fā)揮抗肝癌作用呢？這也將為黃芩有效成分及藥理作用的進一步挖掘和HCC的防治提供一個新思路。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃芩主要涉及與肝癌相關的信號通路是Wnt信號通路，這與文獻[19]報道一致，Wnt/β-catenin信號通路參與肝臟疾病進展的所有階段，該信號通路的異常將導致肝細胞癌、肝母細胞瘤和膽管癌等多種肝癌的發(fā)生，Wnt/β-catenin信號通路受到多種因子的調(diào)控，當細胞質(zhì)中β-catenin不能正常降解時，Wnt/β-catenin信號通路活化增強，多種腫瘤疾病由此引發(fā)。目前已經(jīng)有多項研究報道了調(diào)控該信號通路可以抑制肝癌的潛在價值[20-21]，因此我們有理由相信黃芩的活性物質(zhì)黃芩新素可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路上下游相關基因的表達，作為防治肝細胞癌潛在藥物的出現(xiàn)是極有可能的。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芩抗HCC的潛在基因靶點ADRA1A，篩選出的HCC核心基因為FCN3、C7、COLEC10、CFP。腎上腺素能α1A受體（ADRA1A）是一類通過結(jié)合兒茶酚胺刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）的G蛋白偶聯(lián)受體，Chen等[22]的研究表明，與癌旁組織相比，在HCC組織中，ADRA1A mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，其啟動子區(qū)的平均甲基化水平顯著增加（17.0% vs.25.2%，P＜0.0001），ADRA1A基因高甲基化可能導致HCC的發(fā)生，這與本研究中ADRA1A的OS分析結(jié)果一致（ADRA1A高表達的患者前80個月生存率更高），因此，ADRA1A是黃芩治療HCC的有前景的基因靶點。纖維膠凝蛋白3（FCN3）是機體天然免疫的關鍵性分子，主要參與補體激活、吞噬作用調(diào)節(jié)和細胞凋亡過程[23]，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CN3功能障礙或表達異常可能造成人類某些感染性疾病、慢性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生[24]，與KEGG富集分析結(jié)果一致。補體C7是補體級聯(lián)反應的下游，通過補體經(jīng)典途徑或者凝集素途徑激活，補體途徑還可激活天然免疫系統(tǒng)，在抵抗細菌等病原體感染中起重要作用。張鑫等[25]報道，通過供肝組織SNP檢測分型發(fā)現(xiàn)，供肝C7 rs6876739基因型與肝移植術后的早期細菌感染顯著相關，這可能與移植肝中C7合成減少有關；Würzner等[26]報道，移植肝合成高達50%以上的C7，說明C7可作為HCC的預后因子。凝集蛋白家族10（COLEC10）是HCC中miR-452-5p的直接靶標，miR-452-5p過表達能夠顯著加速細胞增殖，誘導細胞周期從G1轉(zhuǎn)變，抑制癌細胞的凋亡[27-28]，說明COLEC10是HCC的核心基因之一。OS與DFS分析、以及免疫組化驗證也已證實，F(xiàn)CN3、C7、COLEC10、CFP的異常表達與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關。

綜上所述，本研究初步揭示了黃芩抗HCC的潛在基因靶點和HCC核心基因，探討了其相關分子機制，為后期開展黃芩治療HCC的實驗和臨床研究提供理論參考。但本研究仍然存在不足和局限性：

（1）數(shù)據(jù)來源比較單一

網(wǎng)絡藥理學的重要基礎是對不同來源數(shù)據(jù)進行整合分析，不同數(shù)據(jù)庫如常用的中藥成分數(shù)據(jù)庫（ETCM、TCMSP、TCMID、TCM）數(shù)據(jù)收錄差異大、且數(shù)據(jù)信息之間無有效關聯(lián)相對比較獨立，因此數(shù)據(jù)收集的完整性和整合分析對研究結(jié)果的可靠性、可重現(xiàn)性有較大影響。本研究黃芩活性成分及其靶點的篩選選用的是TCMSP，來源比較單一，一定程度上可能影響研究結(jié)果的重復性。以后我們可以盡量通過整合多個來源的數(shù)據(jù)、同時結(jié)合臨床或?qū)嶒灧椒ㄟM行數(shù)據(jù)采集、檢測和補充[29]。

（2）缺乏更加有效、科學的驗證

本研究遵守2021年世界中醫(yī)藥學會聯(lián)合會發(fā)布的《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》[30-31]，并按要求對其內(nèi)容進行可靠性評價、規(guī)范性評價和合理性評價。但在結(jié)果驗證方面，本研究目前還停留在文獻驗證和計算機實驗驗證階段，缺乏更加科學有效和更具說服力的驗證方式，如體外細胞模型、動物模型實驗驗證，甚至臨床試驗驗證等方式。