＊徐耀瑜 丁嘉穎 張雅慧 趙啟程 張成杰 司偉杰

（安陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院 河南 455000）

引言

癌癥發(fā)生的主要原因是原癌基因的激活和抑癌基因的失活[1]。至今已觀察到許多突變基因，例如RAS原癌基因家族成員——HRAS、KRAS、NRAS。其中KRAS在所有癌癥中高頻突變，特別是胰腺癌（98%）和結(jié)直腸腺癌（45%）[2-3]。KRAS基因編碼GTPase（三磷酸鳥苷酶），結(jié)合GTP（三磷酸鳥苷），水解其為GDP（二磷酸鳥苷）。生長因子與細(xì)胞表面生長因子受體結(jié)合后，激活信號誘導(dǎo)GTP與KRAS結(jié)合，KRAS成為活化狀態(tài)，作為分子開關(guān)來傳遞細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞[4]。

結(jié)直腸癌中KRAS突變主要為第12（G12D）或13（G13D）位氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代。該突變位于磷酸結(jié)合的效應(yīng)結(jié)合環(huán)內(nèi)，導(dǎo)致了GTP水解速率降低，GTPase交替開關(guān)的活性降低，導(dǎo)致KRAS誘導(dǎo)的信號通路改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[5]。KRAS發(fā)生G12D突變后，招募結(jié)合其他蛋白質(zhì)因子，建立異常下游通路。通過AAVS1-CRIPR Cas9定點(diǎn)敲入BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS到SW48細(xì)胞，建立單基因研究系統(tǒng)。富集生物素化肽段，分析與野生型KRAS和突變型G12D結(jié)合的分子。

1.實(shí)驗(yàn)部分

(1)實(shí)驗(yàn)材料

人SW48細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清，2mM L型谷氨酰胺，100units/mL青霉素以及100μg/mL鏈霉素。通過AAVS1-CRISPR Cas9定點(diǎn)敲入融合基因BioIDWT-KRAS和BioID-G12D-KRAS的SW48細(xì)胞。上述細(xì)胞均置于37℃、5% CO2、濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

AAVS1-CRISPR Cas9系統(tǒng)包含AAVS1-CRISPR Cas9 clone（SH100），AAVS1 MCS donor cloning vector-Pure（SH200），5’鑒定PCR引物。Lipofectamine 3000（Thermo Fisher），生物素（Sigma），穩(wěn)定同位素生物素（Iso-Sciences），G蛋白偶聯(lián)瓊脂糖珠（Millipore）。KRAS-4B抗體（3B10-2F2）(Sigma-Aldrich），生物素抗體（A150-109A）（BETHYL laboratories）。

(2)構(gòu)建KRAS(WT/G12D)SW48細(xì)胞

將BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS基因片段分別插入AAVS1 MCS donor cloning vector-Pure（SH200）中。測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒和AAVS1-CRISPR Cas9 clone（SH100）按1:1比例，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染SW48細(xì)胞，1μM puromycin篩選一周，挑選單克隆轉(zhuǎn)至96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)2周。5'PCR擴(kuò)增，及Western blotting檢測BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS的目的條帶及整體生物素標(biāo)記效率，挑選正確插入基因，并且BioID-WT-KRAS和BioID-G12D-KRAS表達(dá)水平相同的SW48細(xì)胞。

(3)穩(wěn)定同位素生物素標(biāo)記BioID-WT-KRAS和BioIDG12D-KRAS細(xì)胞

交替標(biāo)記生物素：

組1，25μM正常生物素培養(yǎng)BioID-WT-KRAS細(xì)胞；

組2，25μM穩(wěn)定同位素生物素培養(yǎng)BioID-G12D-KRAS細(xì)胞；

組3，25μM正常生物素培養(yǎng)BioID-G12D-KRAS細(xì)胞；

組4，25μM穩(wěn)定同位素生物素培養(yǎng)BioID-WT-KRAS細(xì)胞。

每組培養(yǎng)4份15cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞，Western blotting驗(yàn)證，取組1與組2的5mg細(xì)胞裂解液混合（A），取組3和組4的5mg細(xì)胞裂解液混合（B），A、B組均4個重復(fù)，胰酶消化，-80℃凍干。

(4)LC-MS/MS檢測和分析生物素化肽段

富集A組和B組中的生物素化肽段。Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀上分析肽段樣品，全掃描質(zhì)譜從m/z350-1,550開始，分辨率為120,000，m/z為200，AGC最大值200,000個離子，占空比為3s，最大離子測試時間設(shè)定為60ms～100ms。數(shù)據(jù)庫搜索以1%的錯誤發(fā)現(xiàn)率過濾PSM。統(tǒng)計分析BioID-G12D-KRAS組與BioID-WT-KRAS組，差異倍數(shù)2為界限，篩選顯著差異。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)BioID-G12D-KRAS與BioID-WT-KRAS腫瘤細(xì)胞的構(gòu)建

將BioID-G12D-KRAS及BioID-WT-KRAS分別插入到SH200載體，轉(zhuǎn)染SW48細(xì)胞，挑選單克隆繼續(xù)培養(yǎng)，5'PCR方法驗(yàn)證，最終挑選出陽性BioID-G12D-KRAS和BioID-WTKRAS的SW48細(xì)胞各一株（圖1.A）。擴(kuò)大培養(yǎng)后，更換含50μM生物素的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞裂解液，Western blotting檢測，鑒定出BioID-G12D-KRAS和BioID-WT-KRAS的表達(dá)水平相同（55kDa），內(nèi)源性KRAS的表達(dá)水平也接近（圖1.B）。兩類細(xì)胞的生物素化蛋白表達(dá)水平一致（圖1.C）。

圖1 表達(dá)BioID-G12D-KRAS或BioID-WT-KRAS的SW48細(xì)胞

(2)質(zhì)譜檢測及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析

兩種生物素交替標(biāo)記野生KRAS和G12D突變KRAS的SW48細(xì)胞（圖2）。Western blotting檢測到每組樣本中生物素標(biāo)記情況相同，進(jìn)行等比例混合樣本，富集生物素化肽段（圖3）。

圖2 生物素標(biāo)記方法

圖3 兩種生物素標(biāo)記后不同SW48細(xì)胞的生物素修飾情況

富集的肽段經(jīng)LC-MS/MS檢測產(chǎn)生8個質(zhì)譜文件，通過組合數(shù)據(jù)庫搜索匹配，肽段定量分析，A組識別2,918個PSM和730個生物素化肽段，去除無法識別二級質(zhì)譜的肽段，得到117個生物素化肽段（420個PSM）。B組得到716個生物素化肽段（2,632個PSM），去除無法識別到二級質(zhì)譜的肽段，共識別107個生物素化肽段（353個PSM）。分析過程中，參考SW48細(xì)胞的16個天然生物素化蛋白質(zhì)（PC，HLCS，CTTN，MCCC1，HIST1H2BD，CMA1，PTPRO，LRRCC1，TTC24，CA2，NUDT1，HIVEP1，MAP4，F(xiàn)BF1，ACTB，TXNDC12）。最終篩選出BioID-WT-KRAS細(xì)胞中88種生物素化蛋白質(zhì)，BioID-G12DKRAS細(xì)胞中90種生物素化蛋白質(zhì)。

(3)分析腫瘤結(jié)合分子

通過統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性差異的蛋白共13個，其中WTKRAS組中識別到8個生物素化蛋白質(zhì)（AHNAK2，CYSRT1，ABI1，COL17A1，DSC2，SNAP29，PDLIM5，F(xiàn)AM126B），G12D-KRAS組中篩選出5個相互作用分子（SLC5A3，CBARP，BUB1B-PAK6，TC2N，SHB）（圖4.A）。比對這部分?jǐn)?shù)據(jù)，篩選出AHNAK2（AHNAK Nucleoprotein 2，AHNAK核蛋白2）僅在WT-KRAS組中被檢測到（圖4.B），SLC5A3僅在G12D-KRAS組中被生物素化（圖4.C）[6]。

圖4 WT-KRAS與G12D-KRAS的結(jié)合分子比較

WT-KRAS組識別到AHNAK2的同源蛋白AHNAK，是EGFR的已知相互作用蛋白。AHNAK為700 kDa蛋白質(zhì)，在多種細(xì)胞中表達(dá)，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中下調(diào)表達(dá)，AHNAK2功能未知[7]。WT-KRAS組AHNAK2的生物素化肽段豐度高于G12D-KRAS組，AHNAK2可能與WT-KRAS更穩(wěn)定結(jié)合。SLC5A3（Solute Carrier Family 5 Member 3，溶質(zhì)載體家族5A3），其家族有12個分子與KRAS存在蛋白相互作用[8]，主要功能防止高濃度肌醇在細(xì)胞內(nèi)積聚造成高滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損。該分子賴氨酸殘基占全序列的4.3%，本次檢測到2個生物素化標(biāo)記位點(diǎn)，占全部32個賴氨酸殘基的1/16。G12D組SLC5A3的K4位生物素修飾為WT-KRAS組2倍以上。

3.實(shí)驗(yàn)討論

KRAS作為重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的高度調(diào)節(jié)性分子，自身結(jié)構(gòu)改變，影響其與KRAS結(jié)合分子的相互作用，觸發(fā)多樣性的下游信號。發(fā)生突變的KRAS調(diào)控著大部分腫瘤的發(fā)生，其中第12氨基酸突變占所有KRAS突變的90%左右。本研究主要通過比較G12D突變與野生型KRAS于結(jié)合蛋白的差異，指出G12D突變后導(dǎo)致信號通路改變的關(guān)鍵分子，為潛在藥物靶點(diǎn)研究提供線索。

我們利用特異識別生物素化位點(diǎn)[9]，依據(jù)生物素酶標(biāo)記生物素于近距蛋白（小于10nm）賴氨酸殘基的原理，針對G12D突變型和野生KRAS進(jìn)行了腫瘤互作化學(xué)分子研究。

（1）首先構(gòu)建了包含BioID的親本和突變KRAS融合基因的SW48細(xì)胞，且表達(dá)融合蛋白水平一致。兩組細(xì)胞背景一致時，二者不同的生物學(xué)特性，理論上由KRAS突變造成[10]。為簡化分析，本部分采用兩種生物素進(jìn)行標(biāo)記?？紤]可能具體標(biāo)記效率不一致，每種生物素分別標(biāo)記兩種細(xì)胞，最后綜合定量分析出，BioID-WT-KRAS細(xì)胞中88種可能結(jié)合蛋白質(zhì)，BioID-G12D-KRAS細(xì)胞中有90種潛在結(jié)合分子。

（2）又分析發(fā)現(xiàn)，G12D-KRAS有19種結(jié)合蛋白質(zhì)（SLC 5A3，ACTN4，BUB1B-PAK6，CBARP，CXADR，EFNB1，F(xiàn)LNA，GNMT，LYN，MUC13，PFN1，PTTG1IP，RABL3，SHB，SPRED1，SPRED2，TC2N，TR53I11，TUBA1C），WTKRAS識別12種互作分子（AHNAK2，ABI1，AHNAK，COL17A1，CYSRT1，DSC2，F(xiàn)AM126B，PDLIM5，SLC19A1，SLC4A2，SNAP29，CDCA3）。生物素化AHNAK2只在WTKRAS細(xì)胞中被檢測，生物素化SLC5A3僅在G12D-KRAS細(xì)胞內(nèi)被識別。

AHNAK2和SLC5A3將作為潛在的腫瘤互作化學(xué)分子，在后續(xù)進(jìn)行更多的研究，為我們深入認(rèn)識KRAS，研制KRAS靶向藥物提供前期工作基礎(chǔ)。