黃秀林， 賁素琴， 肖輝

RNA結(jié)合蛋白HuR對外泌體生成機制的調(diào)控*

黃秀林， 賁素琴， 肖輝△

（上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，上海 200080）

外泌體；RNA結(jié)合蛋白；人類抗原R；腫瘤

外泌體是一類直徑為30～150 nm的膜囊泡，幾乎所有的細胞都能夠分泌外泌體，它含有許多來源于細胞的成分。近年來，越來越多的證據(jù)表明外泌體介導的信號蛋白、RNA、核酸等多種分子的傳遞有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括重塑細胞外基質(zhì)、促進血管生成、干擾免疫反應、促進腫瘤細胞的增殖遷移以及塑造腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境等［1］。多項研究報道RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins， RBPs）可通過調(diào)控外泌體的生物發(fā)生過程進而調(diào)節(jié)外泌體介導的生物學功能［2-5］，其中人類抗原R（human antigen R， HuR）是較具代表性的RBPs之一，廣泛表達于人體各細胞類型中，在細胞的增殖、分化、凋亡、應激和免疫反應中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)［6］。本文綜述外泌體的生成機制以及HuR調(diào)控外泌體生物發(fā)生的作用。

1 外泌體的生成機制

外泌體是大多數(shù)細胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的胞外囊泡，攜帶著蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細胞代謝物、核酸等來自細胞的成分，充當細胞內(nèi)和細胞間生物信息交流的“郵遞員”［7］。經(jīng)典的外泌體生成途徑可概括為3個過程：內(nèi)吞體的形成、多囊泡體（multivesicular bodies， MVBs）的產(chǎn)生以及外泌體的釋放。以下將對依賴轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體分選復合物（endosomal-sorting complexes required for transport， ESCRT）的經(jīng)典外泌體生成途徑和不依賴于ESCRT的外泌體生成途徑分別進行闡述。

1.1依賴ESCRT的經(jīng)典生成途徑外泌體的生成始于內(nèi)吞體的產(chǎn)生，早期內(nèi)吞體成熟為晚期內(nèi)吞體或是MVBs，晚期內(nèi)吞體膜內(nèi)陷并包裹生物分子，在MVBs內(nèi)形成數(shù)個腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles， ILVs）。ESCRT在這一過程中發(fā)揮重要作用，脊椎動物的ESCRT大約由30種蛋白質(zhì)組成，組裝成4種亞復合體（ESCRT-0/I/II/III）及空泡分選蛋白4（vacuolar protein sorting 4， Vps4）復合體［8］。

ESCRT系統(tǒng)主要有3個功能：識別泛素化的“貨物”并防止其降解；使膜變形并分選“貨物”；生成帶有“貨物”的ILVs［9］。ESCRT-0/I/II含有泛素結(jié)合域，它們依次識別泛素修飾的裝載物，其中ESCRT-0啟動分選機制并發(fā)揮主要作用。ESCRT-0亞基肝細胞生長因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物（hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate）通過FYVE鋅指結(jié)構(gòu)域識別泛素化裝載物、與磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate， PI3-P）相互作用定位于內(nèi)吞體［10-11］。ESCRT-0緊接著通過PSAP基序與亞基腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101， TSG101）的氨基末端相結(jié)合招募ESCRT-I，ESCRT-I可連同ESCRT-II增強ESCRT-0的作用并促進內(nèi)吞體內(nèi)出芽。ESCRT-III則在MVBs的分選過程中起到隔離“貨物”及解離ILVs的作用。通常泛素修飾“貨物”需要去泛素化后再包裝入MVBs中，ESCRT-III可招募去泛素酶且包圍“貨物”限制它們在MVBs上的擴散。Vps4復合體的三磷酸腺苷（adenosine-5'-triphosphate， ATP）酶活性提供了ILVs從膜上解離所需的能量，并能分解與膜結(jié)合的ESCRT-III將其單個亞基循環(huán)回收至細胞質(zhì)中［10， 12-13］。然而，并不是所有依賴ESCRT系統(tǒng)分選入ILVs的“貨物”都需要泛素化，Dores等［12］在研究中觀察到蛋白酶激活受體1（protease-activated receptor 1， PAR1）在分選入ILVs時無需泛素化修飾，ESCRT輔助蛋白ALG2相互作用蛋白X（ALG-2 interacting protein X， ALIX）可通過中央V型結(jié)構(gòu)域與PAR1的YPX3L基序結(jié)合直接招募帶電多囊體蛋白4（charged multivesicular body protein 4， CHMP4）/ESCRT-III將其分選入ILVs中，繞過含有泛素結(jié)合域的ESCRT-0/I/II的識別過程。

1.2不依賴ESCRT的生成途徑盡管大量證據(jù)表明ESCRT在調(diào)控ILVs的生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但有研究顯示在ESCRT耗竭細胞的MVBs中依舊有ILVs生成，這說明在外泌體的生成過程中存在不依賴ESCRT的其他調(diào)節(jié)機制［14］。

Trajkovic等［15］最早發(fā)現(xiàn)非ESCRT依賴的ILVs生成調(diào)控機制。他們觀察到基于脂筏的微結(jié)構(gòu)域能夠通過對內(nèi)吞體膜的橫向分離分揀外泌體的內(nèi)容物，該微結(jié)構(gòu)域富含中性鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase， nSMase2），nSMase2可生成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺誘導內(nèi)吞體膜自發(fā)負向卷曲，促進MVBs的內(nèi)出芽。該研究成果表明，神經(jīng)酰胺也是外泌體形成與釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一，但依賴于神經(jīng)酰胺的外泌體生成與分泌機制的細胞類型以及分選入外泌體的內(nèi)容物類型仍有待進一步研究。

Baietti等［16］在研究中觀察到ALIX通過與含PDZ結(jié)構(gòu)域的支架蛋白syntenin的LYPX（n）L基序結(jié)合，將聯(lián)合蛋白聚糖（syndecan）分選入外泌體中，調(diào)控外泌體的生成。syndecan是一類與多種病理狀態(tài)相關(guān)的跨膜蛋白。據(jù)報道，乙酰肝素酶和syndecan能夠共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展；激酶Src通過影響攜帶syntenin-syndecan的“貨物”在內(nèi)吞體的出芽過程，促進外泌體的產(chǎn)生而發(fā)揮促瘤作用［17-18］。因而，在腫瘤細胞源外泌體syndecan介導的促瘤作用中，ALIX可能是關(guān)鍵的調(diào)控因素之一。

Rab GTP酶類（Rab GTPases）在胞內(nèi)囊泡運輸?shù)倪^程中發(fā)揮作用。Ostrowski等［19］通過RNA干擾處理HeLa細胞系后篩選了5個影響外泌體分泌的Rab GTP酶（Rab2b、Rab5a、Rab9a、Rab27a和Rab27b），并進一步鑒定出Rab27a和Rab27b通過效應器突觸結(jié)合蛋白樣蛋白4（synaptotagmin-like 4， Slp4）和Slac2b（缺少C2結(jié)構(gòu)域的Slp同源物）促進MVBs滯留在細胞周圍參與其與質(zhì)膜的對接。近期，Rab31在外泌體生成機制中的研究也取得進展，Wei等［20］觀察到受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases， RTKs）能夠激活Rab31，活化的Rab31與脂筏微結(jié)構(gòu)域中的浮艦蛋白（flotillins）結(jié)合驅(qū)動RTKs進入MVBs形成ILVs，Rab31還可招募蛋白TBC1D2B抑制Rab7，阻止MVBs的降解，進而調(diào)控外泌體的生成。此外，他們認為Rab31可能還參與了多種膜蛋白的外泌體分選機制，但這一推測仍需進一步的研究證實。目前已有多項研究報道RTKs參與了包括非小細胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對化療藥物的耐藥性，因而這一發(fā)現(xiàn)不僅進一步闡明了外泌體生成的機制，也為腫瘤的治療提供了新的策略［20-21］。

總之，經(jīng)典的外泌體內(nèi)吞體生成途徑包括質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷和含有ILVs的MVBs的形成（外泌體的生成途徑總結(jié)見圖1）［22］。多種調(diào)控機制參與到外泌體的生物發(fā)生過程中，從而進一步調(diào)節(jié)外泌體介導的生物學功能，進而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、機體的免疫、炎癥反應等多種病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。然而除了外泌體的經(jīng)典內(nèi)吞體生成途徑以外，近期有新的觀點表明外泌體可通過質(zhì)膜直接萌發(fā)，且這一過程與經(jīng)典的內(nèi)吞體生成途徑同時進行，但其中具體的調(diào)控機制仍有待進一步探索［23-24］。

Figure 1. The mechanisms of exosome formation. The process can be divided into three steps： early endosome biogenesis，multivesicular body （MVB） formation， and exosomes release. The most characterized pathway that depends on endosomal sorting complexes required for transport （ESCRT）， which recognizes ubiquitylated proteins and sorts them into intraluminal vesicles （ILVs）. Other ESCRT-independent mechanisms of exosome formation may involve lipid-raft microdomains， ALG-2 interacting protein X-syntenin-syndecan and Rab GTPases.

2　HuR在外泌體生成中的作用

2.1HuR概述HuR在所有人類細胞中普遍表達，主要分布于細胞核，為基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要參與者之一，涉及多種生理、病理過程［6］。HuR由3個RNA識別基序（RNA recognition motif， RRM）結(jié)構(gòu)域和一個柔性鉸鏈區(qū)組成［25］。前兩個結(jié)構(gòu)域（RRM1和RRM2）形成與RNA結(jié)合的裂隙，RRM3穩(wěn)定RNA-蛋白質(zhì)復合物以及介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用。在RRM2與RRM3之間是一個鉸鏈區(qū)，含有HuR核質(zhì)穿梭序列（HuR nucleocytoplasmic shuttling sequence， HNS）結(jié)構(gòu)域，控制HuR易位，動員HuR進出細胞核。HuR是一種核質(zhì)穿梭蛋白，其功能活動受動態(tài)亞細胞定位的影響。在生理條件下，HuR主要位于細胞核，當暴露于各種應激原時，HuR可移位至細胞質(zhì)，從而穩(wěn)定靶mRNA，促進靶mRNA的翻譯。通過對HuR重要結(jié)構(gòu)域的翻譯后修飾（磷酸化、甲基化、泛素化、蛋白水解性切割等）可影響其豐度、亞細胞定位及其與RNA結(jié)合的活性，進而調(diào)節(jié)HuR的功能，在腫瘤的發(fā)生、細胞凋亡、細胞分裂以及細胞應激反應等許多重要生物學過程中發(fā)揮作用［26］。

HuR主要通過RRMs結(jié)合含有富腺嘌呤和尿苷元件（adenine and uridine rich elements， AREs）的靶mRNA［27］。AREs是位于mRNA 3′非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)mRNA降解的順式元件，它與RBP特異性結(jié)合，從而促進或抑制mRNA的降解［28］。約有7%的人類蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本富含AREs，這些轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)與炎癥、免疫反應、細胞增殖以及其他重要的細胞生物活動相關(guān)［29］。多數(shù)情況下，HuR穩(wěn)定靶mRNA并促進mRNA的翻譯，有研究人員認為這一作用可能是通過與其他RBPs或microRNA競爭，以保護靶mRNA免于降解，或是通過與靶mRNA 5′非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry sites， IRESs）結(jié)合而促進mRNA的翻譯［30］。目前，HuR在腫瘤細胞的異常增殖和凋亡、促進腫瘤新生血管生成、侵襲、遷移等方面的作用已得到廣泛研究，HuR的表達上調(diào)與腫瘤的進展以及預后不良密切相關(guān)［6， 29］。有研究報道，HuR可參與調(diào)控外泌體的生物發(fā)生過程進而調(diào)控腫瘤細胞的生物學特性。

2.2HuR參與調(diào)控外泌體的生成不同細胞來源、不同細胞狀態(tài)下的外泌體包裝的內(nèi)容物不同、發(fā)揮的功能也有所不同。Pérez-Boza等［31］利用測序技術(shù)分析比較了人體原代內(nèi)皮細胞及其釋放外泌體中RNA組成類別的差異，結(jié)果顯示在外泌體中有較多獨特的信使RNA基因型，提示細胞中的某些RNA成分更傾向于被分選、包裝入外泌體中。Villarroya-Beltri等［3］觀察到在腫瘤相關(guān)成纖維細胞中RNA結(jié)合蛋白hnRNPA1可通過結(jié)合miR-196a 5′端的特異基序（UAGGUA），將miR-196A特異性包裝入外泌體誘導腫瘤細胞的順鉑抗性；Santangelo等［4］的研究結(jié)果顯示RNA結(jié)合蛋白SYNCRIP可通過識別hEXO基序同miRNA結(jié)合，促進其釋放到外泌體中。以上研究均提示RNA結(jié)合蛋白在外泌體內(nèi)容物的分選、包裝中的重要作用。

近年來，越來越多的研究表明腫瘤細胞可通過外泌體傳遞分子同腫瘤微環(huán)境進行生物信息交流，從而塑造有利于腫瘤增殖、遷移、侵襲的微環(huán)境，但腫瘤細胞源外泌體選擇性裝載生物分子的具體調(diào)控機制至今尚未闡明。HuR是重要的RNA結(jié)合蛋白之一，在多數(shù)腫瘤細胞中過表達、移位至細胞質(zhì)，并能夠上調(diào)一些促癌因子的表達［32］。進一步了解HuR調(diào)控腫瘤細胞外泌體生物發(fā)生的機制，更有助于闡明HuR介導的促瘤作用。Ahadi等［33］在研究中觀察到前列腺癌細胞外泌體富集的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）中RNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點數(shù)量約為細胞內(nèi)的2倍且富含RNA結(jié)合蛋白HuR結(jié)合位點及miRNA種子序列，提出HuR可能在lncRNA包裝入外泌體的過程中發(fā)揮重要作用，且能與lncRNA共同作用將特定miRNA分選入外泌體。但HuR、lncRNA及miRNA間具體的相互作用機制，仍需進一步探索。Shi等［34］在研究循環(huán)血清外泌體miR-1246在早期胃癌患者診斷中的作用時，通過RNA拉下實驗證實HuR能夠通過AUUUU基序同miR-1246結(jié)合，將其分選包裝入外泌體，釋放到外周循環(huán)中促進腫瘤細胞的增殖作用。Preet等［35］的研究表明，過表達HuR的結(jié)腸癌細胞能夠促進其外泌體的分泌，并在外泌體中檢測到HuR的高表達，由于HuR具有特異性結(jié)合AREs的特性，它的高表達可使外泌體選擇性地攝取更多含有AREs的mRNA，從而影響外泌體中mRNA的裝載。但該研究尚未闡明HuR促進外泌體釋放的具體機制以及HuR介導下外泌體裝載內(nèi)容物的改變在腫瘤中所發(fā)揮的作用。此外，有研究報道，敲除乳腺癌細胞的基因后，外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14， MMP14）的組分明顯減少，降低乳腺癌細胞中MMP14介導的侵襲遷移能力［36］。以上研究證實了HuR在腫瘤細胞外泌體生成中的重要調(diào)節(jié)作用。

HuR不僅能參與腫瘤來源外泌體生成的調(diào)控，還能夠參與細胞應激狀態(tài)下外泌體生物發(fā)生的調(diào)控。Mukherjee等［37］的研究成果顯示，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激或是饑餓狀態(tài)下，人肝細胞系Huh7中HuR可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)取代argonaute 2蛋白與miR-122結(jié)合，在MVBs泛素化時脫離miR-122，促進其向外泌體輸出。此外，我們課題組通過RNA測序觀察到下調(diào)肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞的基因后，細胞中的外泌體成分（exosome component， EXOSC）8、9蛋白明顯下調(diào)，而EXOSC是構(gòu)成外泌體核糖核酸酶復合物的成分之一，屬于RNase PH家族，定位于核仁。EXOSC8是外泌體的6個RNase-PH結(jié)構(gòu)域的亞基之一，也是外泌體中央六聚體通道的一部分。EXOSC8、9能夠與含有AREs的靶RNAs結(jié)合［38］。EXOSC的下降將進一步改變mRNA的代謝促進肺癌的發(fā)生，這一現(xiàn)象也提示了HuR與肺癌細胞源外泌體之間密不可分的關(guān)系。

3 小結(jié)與展望

HuR作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，HuR通過改變腫瘤細胞源外泌體的生物學特性（如圖2所示）、促進關(guān)鍵致癌因子的表達增加腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。目前，外泌體的生成機制的研究已取得較大進展，但腫瘤細胞對外泌體生成的調(diào)控機制相關(guān)的報道仍然較少。進一步探究HuR調(diào)控外泌體生成的機制、闡明其在調(diào)控腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的具體作用機制，有望為腫瘤帶來新的診斷和治療策略，具有重大的臨床轉(zhuǎn)化應用前景。

Figure 2. The RNA-binding protein HuR impacts the loading of cargoes into exosomes. HuR controls AREs （adenine and uridine rich elements）-containing mRNAs loading into exosomes through specific binding to AREs. ESCRT： endosomal sorting complexes required for transport ubiquitination； Ub： ubiquitination； ILV： intraluminal vesicle； MVB： multivesicular body.

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Regulation of exosome formation by RNA-binding protein HuR

HUANG Xiu-lin， BEN Su-qin， XIAO Hui△

（，，，200080，）

Exosomes are nanoscale vesicles secreted by cells， and play a critical role in transmitting biological information. The biogenesis of exosomes consists of three stages， including the invagination of the plasma membrane， the formation of multivesicular bodies， and the release of exosomes. Human antigen R （HuR） is an RNA-binding protein widely involved in development and tumorigenesis. Studies have shown that RNA-binding proteins regulate the biogenesis of exosomes. HuR has been proposed to impact the loading of cargoes into exosomes by recognizing specific RNA motifs and the release of exosomes. Unveiling the regulatory mechanisms of exosome formation by HuR facilitates the understanding of HuR in tumor growth and metastasis. Here we reviews the mechanisms of exosome formation and the regulatory role of HuR in exosome formation.

Exosomes； RNA-binding proteins； Human antigen R； Tumor

R730.2； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.021

1000-4718（2022）03-0553-06

2021-09-17

2022-01-14

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 82172692）；上海市浦江人才計劃項目（No. 2020PJD049）

Tel： 13917673370； E-mail： xiaohui771210@163.com

（責任編輯：宋延君，羅森）