袁建玲， 邵鐘銘， 鄒園， 伍彩霞， 鄭阿秀， 邢敬慈，白建榮， 揭偉，2△， 申志華△

血清反應(yīng)因子N端片段對鼻咽癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響*

袁建玲1，3， 邵鐘銘1， 鄒園1， 伍彩霞1， 鄭阿秀1， 邢敬慈1，白建榮1， 揭偉1，2△， 申志華1△

（1廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；2海南醫(yī)學(xué)院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室，海南 ?？?571199；3北京大學(xué)深圳醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518036）

探討血清反應(yīng)因子N端剪切片段（SRF-N）對鼻咽癌（NPC）細(xì)胞增殖和遷移能力的影響與機(jī)制。應(yīng)用SRF全長（SRF-Full，1～508 aa）、SRF-N（1～254 aa）及陰性對照（NC）慢病毒顆粒感染人NPC細(xì)胞系6-10B，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選結(jié)合Western blot檢測Flag標(biāo)簽化融合蛋白的表達(dá)獲得單克隆細(xì)胞株，CCK-8實驗分析細(xì)胞活力的改變，劃痕損傷修復(fù)實驗和Transwell實驗分析細(xì)胞遷移能力，細(xì)胞-基質(zhì)黏附實驗分析細(xì)胞黏附能力，Western blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測SRF-Full和SRF-N對啟動子的調(diào)節(jié)效應(yīng)。成功用SRF-Full、SRF-N及NC慢病毒感染6-10B細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選結(jié)合Flag標(biāo)簽蛋白的表達(dá)獲得相應(yīng)的單克隆細(xì)胞株，分別標(biāo)記為6-10BSRF-Full、6-10BSRF-N和6-10BNC。與6-10BNC細(xì)胞相比，6-10BSRF-Full細(xì)胞活力、遷移能力和與基質(zhì)的黏附能力均顯著增強(qiáng)（<0.01），而6-10BSRF-N細(xì)胞較6-10BSRF-Full細(xì)胞活力、遷移能力及黏附能力均顯著下降（<0.01）。6-10BSRF-Full細(xì)胞中波形蛋白（vimentin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）和Snail1的表達(dá)水平較6-10BNC細(xì)胞顯著升高（<0.01），上皮鈣黏素（E-cadherin）表達(dá)水平顯著下降（<0.01）；而6-10BSRF-N細(xì)胞中vimentin、N-cadherin和Snail1的表達(dá)水平較6-10BSRF-Full細(xì)胞顯著下降（<0.05），E-cadherin表達(dá)水平顯著上升（<0.05）。雙螢光素酶活性實驗結(jié)果表明，與NC相比，SRF-Full顯著激活啟動子（<0.001）；與SRF-Full相比，SRF-N顯著抑制啟動子活性（<0.01）。SRF-Full促進(jìn)而SRF-N抑制NPC細(xì)胞的增殖和遷移；SRF-N抑制啟動子活性而介導(dǎo)NPC的EMT；SRF-N具有潛在的抗NPC作用。

鼻咽癌；血清反應(yīng)因子N端片段；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是起源于鼻咽黏膜的上皮性惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前對NPC侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不甚清楚。課題組前期已經(jīng)報道了部分基因的表達(dá)異常與NPC的增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)，豐富了NPC發(fā)病學(xué)理論［1-3］。新近，有關(guān)單細(xì)胞測序技術(shù)在NPC上的應(yīng)用，更為闡明基因、環(huán)境因素在NPC的發(fā)病機(jī)制提供了新思路［4-5］。盡管如此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和鑒定介導(dǎo)NPC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，仍然是NPC防治研究的重要內(nèi)容。

血清反應(yīng)因子（serum response factor， SRF）屬于MADS（Mcm1， Agamous， Deficiens and SRF）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，進(jìn)化保守，在生物體內(nèi)普遍存在。通過與輔因子相互作用并結(jié)合CArG序列元件［CC（A/T）6GG］，SRF調(diào)控了超過200個下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，涉及細(xì)胞的生長、遷移、骨架形成等方面，其表達(dá)和活性的異常與包括腫瘤在內(nèi)的很多人類疾病關(guān)系密切［6-9］。SRF過表達(dá)促進(jìn)某些腫瘤的臨床進(jìn)展，提示SRF可能是潛在的腫瘤預(yù)后判斷和治療靶標(biāo)［8-10］。

2003年Chang等［11］報道在心力衰竭的心臟組織中全長SRF（SRF-Full， 1～508 aa）可被caspase-3剪切成N端片段（SRF-N， 1～254 aa）及C端片段（SRF-C， 255～508 aa）。由于SRF-N含有完整MADS結(jié)合域但不含有催化結(jié)構(gòu)域，因此可與SRF-Full競爭性結(jié)合靶基因的CArG盒，從而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。本研究假設(shè)SRF-N具有一定的抗腫瘤特性，以NPC細(xì)胞系6-10B為對象，體外研究過表達(dá)SRF-N對NPC細(xì)胞增殖、遷移、黏附、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）等特性的影響，為基于SRF-N靶點的抗NPC研究提供參考資料。

材料和方法

1　細(xì)胞系

NPC細(xì)胞系6-10B為南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系惠贈，我室常規(guī)培養(yǎng)傳代后液氮凍存。293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2　主要試劑及儀器

基于pEZX-PG04.1構(gòu)建的啟動子、陰性對照（negative contorl， NC）及突變型（mutant， Mut）啟動子過表達(dá)質(zhì)粒，螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒，SRF-Full和SRF-N過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；Matrigel（Corning）；鼠抗人Flag單克隆抗體（Sigma）；兔抗人E-cadherin和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）單克隆抗體（CST）；鼠抗人N-cadherin、vimentin和β-actin單克隆抗體，兔抗人Snail1單克隆抗體，HRP或FITC標(biāo)記的II抗（武漢三鷹技術(shù)有限公司）；X-tremeGENE? HP DNA轉(zhuǎn)染試劑和定量PCR試劑盒（Roche）；Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）；RNA抽提試劑盒、RT試劑盒和Lipofectamine 3000（Invitrogen）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）、RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液（HyClone）；蛋白酶抑制劑、RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）。ECL發(fā)光劑、PVDF膜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；定量PCR儀（Roche）；熒光顯微鏡（Olympus）；凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；蛋白電泳儀（Bio-Rad）。

3　方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)用新配制的RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含10% FBS、1×105U/L青霉素和0.1 mg/L鏈霉素）重懸復(fù)蘇后離心沉淀的6-10B細(xì)胞，經(jīng)吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿，并置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待貼壁細(xì)胞完全生長匯合后，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化傳代，待細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后，收獲細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液。

3.2慢病毒感染SRF-N過表達(dá)、SRF-Full過表達(dá)及NC過表達(dá)慢病毒顆粒參考既往方法獲得［12］。6-10B細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后完全培養(yǎng)液重懸，以每孔4×104個細(xì)胞接種于6孔板中，分為3組，標(biāo)記為陰性對照病毒（6-10BNC）組、SRF-N過表達(dá)慢病毒（6-10BSRF-N）組及SRF-Full過表達(dá)慢病毒（6-10BSRF-Full）組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時，進(jìn)行病毒感染。以感染復(fù)數(shù)100 感染6-10B細(xì)胞，計算SRF-Full、SRF-N及NC病毒的體積，0.5 mL polybrene病毒工作液稀釋各組病毒；將稀釋好的病毒液加入6孔板內(nèi)進(jìn)行感染，12 h 內(nèi)棄去病毒液，更換2 mL新鮮的完全培養(yǎng)液；24 h后換液；48 h后添加嘌呤霉素（2.0 mg/L）篩選；72 h后換液，在熒光顯微鏡下觀察GFP信號來判斷感染效果，培養(yǎng)細(xì)胞以備后續(xù)實驗。

3.3單克隆細(xì)胞株篩選6-10BSRF-Full、6-10BSRF-N和6-10BNC混合克隆細(xì)胞經(jīng)過2.0 mg/L嘌呤霉素抗性篩選3 d后，以0.5 mg/L的濃度維持培養(yǎng)。采用有限稀釋法，將這3種細(xì)胞分別用0.25%胰酶消化并轉(zhuǎn)移至96孔板，調(diào)整濃度為每孔1個細(xì)胞，待生長出單克隆細(xì)胞團(tuán)后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況，并在孔板背面相應(yīng)位置做好標(biāo)記。將轉(zhuǎn)染陽性的單克隆細(xì)胞株經(jīng)消化傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過Western blot檢測含F(xiàn)lag標(biāo)簽化的融合蛋白的表達(dá)水平。

3.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力將上述3組細(xì)胞按每孔2×103個共100 μL接種于96孔板， 每組6個復(fù)孔，邊緣孔用無菌PBS填充，過夜孵育。貼壁后，分別在培養(yǎng)時點0、24、48及72 h向每孔細(xì)胞加入10 μL CCK-8試劑，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻液體，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度（）值。

3.5Western blot提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，取50 μg蛋白用于凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后加入Ⅰ抗（Flag， 1∶3 000； PCNA， 1∶1 000； N-cadherin， 1∶500； E-cadherin， 1∶500； vimentin， 1：500； Snail1， 1∶1 000； β-actin， 1∶2 000）4 ℃過夜孵育，TBST洗滌，HRP標(biāo)記的IgG Ⅱ抗（1∶3 000）室溫孵育2 h，ECL發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得目的蛋白條帶。

3.6細(xì)胞基質(zhì)黏附實驗配制Matrigel，每孔2 μg鋪于96孔板內(nèi)。挑選對數(shù)生長期狀態(tài)良好的上述3種細(xì)胞，消化計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔4×104接種在鋪膠的96孔板中，每組4個復(fù)孔；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2和4 h；棄上清，PBS沖洗3次；每孔加入100 μL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液和10 μL CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm處測定各孔的值（代表黏附細(xì)胞數(shù)）。

3.7Transwell遷移實驗Transwell小室置于24孔板。上述3種培養(yǎng)細(xì)胞消化后用含0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，取2×104個細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，體積為200 μL。Transwell小室的下室中加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μL，置于37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后取出小室并用4%中性甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫液染色5 min，用棉簽小心擦除小室上室面細(xì)胞，PBS洗滌后在20×顯微鏡物鏡下觀察并拍照。以穿膜的細(xì)胞數(shù)差異代表細(xì)胞運(yùn)動能力的改變。每張膜選2個典型視野，每組重復(fù)3孔。

3.8劃痕損傷修復(fù)實驗參考既往方法進(jìn)行操作［2］。簡言之，將上述3種細(xì)胞接種6孔板培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài)，用200 μL吸頭尖每孔劃3條平行線，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，加入含0.5% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，于培養(yǎng)時點0、24和48 h鏡下觀察并拍照，ImageJ 8.0軟件分析傷口愈合程度。

3.9雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?93T細(xì)胞接種24孔板，按照X-tremeGENE? HP轉(zhuǎn)染試劑使用說明書將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞。實驗分組：Promoter-NC+SRF-Full組（SRF-Full過表達(dá)質(zhì)粒組）、Promoter-NC+SRF-N組（SRF-N過表達(dá)質(zhì)粒組）、Promoter-Snail1+SRF-Full組（啟動子和SRF-Full過表達(dá)質(zhì)粒組）、Promoter-Snail1+SRF-N組（啟動子和SRF-N過表達(dá)質(zhì)粒組）、Promoter-Mut+SRF-Full（啟動子突變體和SRF-Full過表達(dá)質(zhì)粒組）和Promoter-Mut+SRF-N組（啟動子突變體和SRF-N過表達(dá)質(zhì)粒組）。每孔啟動子質(zhì)粒、SRF表達(dá)質(zhì)粒和螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒按0.5 μg∶0.5 μg∶0.02 μg轉(zhuǎn)染，每組3個復(fù)孔，按照說明書操作檢測螢光素酶活性。根據(jù)軟件預(yù)測，人基因啟動子存在4個潛在的SRF結(jié)合位點，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游118～101 nt （#1， 5'-CTTCACTAAACGAGGCTG-3'）、786～775 nt （#2， 5'-GCCCAAGTGAGG-3'）、1 395～1 378 nt （#3， 5'-AAACACTGGATAAGGGAA-3'）和1 935～1 924 nt （#4， 5'-GGCCTTATCTGC-3'）處。本研究使用的突變體啟動子序列將上述#1和#3位點同時突變?yōu)?'-GGGCTCTATGGGGGGTTT-3'， #2和#4位點同時突變?yōu)?'-CTATGGGGGGTT-3'。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析。計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析或非配對檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　成功篩選SRF-Full及SRF-N過表達(dá)單克隆6-10B細(xì)胞

按照感染復(fù)數(shù)為100加入SRF-Full、SRF-N過表達(dá)和NC慢病毒，72 h后熒光顯微鏡下觀察到6-10B細(xì)胞中有較強(qiáng)的胞核綠色熒光信號，經(jīng)嘌呤霉素篩選后感染效率達(dá)95%以上（圖1A），通過Western blot成功在預(yù)測分子量大小的位置檢測到SRF-Full-Flag及SRF-N-Flag融合蛋白（圖1B）。采用有限稀釋法， 將轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞接種至96孔板進(jìn)行單克隆細(xì)胞篩選，最終挑選出4個NC，2個SRF-N和4個SRF-Full過表達(dá)單克隆細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示，10個單克隆細(xì)胞株的融合蛋白SRF-Full-Flag及SRF-N-Flag的表達(dá)水平不等（圖2）。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)改變的情況，最終挑選第1號（#1）6-10BNC、第1號（#1）6-10BSRF-N及第3號（#3）6-10BSRF-Full單克隆作為后續(xù)實驗對象。

Figure 1.Observation of lentivirus-infected 6-10B cells and identification of the expression of Flag-tagged fusion protein. A： the GFP fluorescence 72 h after infection of 6-10B cells with lentivirus （scale bars=200 μm）； B： the expression of Flag-tagged fusion protein in virus-infected 6-10B cells.

Figure 2.The expression of Flag-tagged fusion protein in monoclonal cell lines.

2　SRF-Full和SRF-N過表達(dá)后細(xì)胞增殖能力的變化

CCK-8實驗結(jié)果顯示，隨著時間推移，6-10BSRF-Full的活力較同一時點的6-10BNC細(xì)胞增加（<0.01），而6-10BSRF-N的活力較6-10BSRF-Full卻降低（<0.01），見圖3A。通過Western blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)，提示6-10BNC及6-10BSRF-N細(xì)胞PCNA的表達(dá)情況差異不顯著，6-10BSRF-Full細(xì)胞中PCNA表達(dá)水平較二者均顯著增加（<0.01），見圖3B。

Figure 3.The effects of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the proliferation of 6-10B cells. A： cell viability detected by CCK-8 assay； B： Western blot detection of PCNA protein level in virus-infected 6-10B cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs 0 day； ##P<0.01 vs SRF-Fullgroup.

3　SRF-Full和SRF-N過表達(dá)后細(xì)胞遷移能力的變化

劃痕損傷修復(fù)實驗結(jié)果表明，與6-10BNC細(xì)胞相比，48 h后6-10BSRF-Full細(xì)胞劃痕傷口的面積顯著減?。?0.01），而6-10BSRF-N細(xì)胞傷口的面積較6-10BSRF-Full顯著增大（<0.01），見圖4A。進(jìn)一步采用Transwell實驗分析SRF-Full和SRF-N過表達(dá)后對6-10B細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，6-10BSRF-Full細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比6-10BNC細(xì)胞顯著增多（<0.01），而6-10BSRF-N細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)較6-10BSRF-Full細(xì)胞顯著減少（<0.01），見圖4B。

Figure 4.Impacts of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the migration of 6-10B cells. A： representative images of wound healing assay （scale bar=200 μm） and the quantitative results； B： representative images of Transwell migration assay （scale bar=50 μm） and the quantitative results. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs NC group； ##P<0.01 vs SRF-N group； △△P<0.01 vs 24 h.

4　SRF-Full和SRF-N過表達(dá)后細(xì)胞黏附能力的變化

將與Matrigel黏附的細(xì)胞用CCK-8液孵育后，酶標(biāo)儀測定其吸光度值，結(jié)果顯示6-10BSRF-Full細(xì)胞平均吸光度為3.41±0.12，與6-10BNC細(xì)胞的平均吸光度（1.47±0.01）相比顯著升高（<0.01）。6-10BSRF-N細(xì)胞的平均吸光度為1.50±0.01，較6-10BSRF-Full細(xì)胞顯著降低（<0.01），見圖5。

Figure 5.Impacts of overexpression of SRF-Full and SRF-N on the adhesion of 6-10B cell to matrix. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs NC group； ##P<0.01 vs SRF-N group.

5　過表達(dá)SRF-Full和SRF-N后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的改變

Western blot檢測結(jié)果顯示，與6-10BNC相比，6-10BSRF-Full細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin和vimentin）和轉(zhuǎn)錄因子Snail1顯著增加（均<0.01），而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin顯著減少（<0.01）；與6-10BSRF-Full相比，6-10BSRF-N細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（N-cadherin和vimentin）和轉(zhuǎn)錄因子Snail1顯著減少（<0.05），上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量顯著增加（<0.05），見圖6。

Figure 6.Western blot analysis of EMT-related proteins in 6-10B cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group； #P<0.05， ##P<0.01 vs SRF-N group.

6　SRF-Full和SRF-N對Snail1啟動子活性的影響

通過構(gòu)建SRF-Full、SRF-N、NC啟動子、啟動子及啟動子突變體質(zhì)粒，按照既定分組將質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)液上清進(jìn)行螢光素酶活性檢測。結(jié)果顯示，與Promoter-NC+SRF-Full相比，Promoter-Snail1+SRF-Full組啟動子活性顯著增強(qiáng)（<0.01），且Promoter-Snail1+SRF-Full組較Promoter-Snail1+SRF-N組具有更高的啟動子活性（<0.01）；與Promoter-Snail1+SRF-Full組相比，Promoter-Snail1-Mut+SRF-Full組啟動子其活性顯著下降（<0.01）；Promoter-Snail1-Mut+SRF-Full組與Promoter-Snail1-Mut+SRF-N組啟動子活性無顯著差異，見圖7。

Figure 7.The effects of SRF-Full and SRF-N on the activity of Snail1 promoter assessed by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Promoter-NC+SRF-Full group； ##P<0.01 vs Promoter-NC+SRF-N group； △△P<0.01 vs Promoter-Snail1+SRF-Full group.

討論

SRF表達(dá)異常與人類某些疾病的病理生理過程關(guān)系密切，如腫瘤、纖維化、神經(jīng)損傷再生及心功能衰竭等［13］。有報道稱SRF在人類多種腫瘤中高表達(dá)，目前已經(jīng)觀察到SRF高表達(dá)可促進(jìn)人類胃癌［9］、肝癌［14］、甲狀腺癌［15］和宮頸癌［16］等多種惡性腫瘤的進(jìn)展。因此，靶向SRF對腫瘤的分子治療具有潛在的臨床意義。有報道顯示CCG-100602可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SRF的表達(dá)［17］，但該抑制劑的特異性不強(qiáng)，因而挖掘內(nèi)源性SRF抑制分子具有重要的意義。針對前述的SRF-Full可被剪切產(chǎn)生SRF-N分子的事實，結(jié)合SRF-N的結(jié)構(gòu)特點［11］，促使我們思考SRF-N是否具有抗腫瘤特性。本研究即應(yīng)用NPC細(xì)胞模型來進(jìn)行驗證。

我們首先委托上海賽業(yè)生物技術(shù)有限公司基于慢病毒載體pEZ-Lv201分別構(gòu)建了SRF-Full、SRF-N和NC的過表達(dá)質(zhì)粒，包裝了相應(yīng)的慢病毒顆粒并經(jīng)過相應(yīng)質(zhì)檢，提示慢病毒包裝成功并具有較高滴度（未發(fā)表資料）。將相應(yīng)慢病毒分別感染6-10B細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到GFP信號。由于當(dāng)前針對SRF-N的商品化抗體同時也可以和SRF-Full結(jié)合，抗體的檢測結(jié)果特異性不強(qiáng)，因而我們采用檢測Flag與目的蛋白的融合蛋白方式來進(jìn)行外源性蛋白表達(dá)的驗證。結(jié)果顯示，從慢病毒感染的細(xì)胞中分別檢測到分子量分別約70 kD和接近40 kD的Flag融合蛋白條帶。這些陽性條帶大小與預(yù)期的SRF-Full-Flag和SRF-N-Flag的分子量大小一致，提示目的基因成功表達(dá)和慢病毒成功感染。繼而采用經(jīng)典的單克隆細(xì)胞挑選法獲得相應(yīng)單克隆細(xì)胞株，這些表型相對均一的單克隆細(xì)胞為后續(xù)研究奠定了扎實的基礎(chǔ)。

在獲得合格的細(xì)胞模型后，我們從體外實驗角度分析SRF-N對NPC細(xì)胞增殖、遷移、黏附及EMT的影響。結(jié)果表明，與6-10BNC細(xì)胞相比，6-10BSRF-Full的增殖能力增加，而6-10BSRF-N細(xì)胞的增殖活力較6-10BSRF-Full減弱，提示過表達(dá)SRF-Full可促進(jìn)NPC細(xì)胞增殖，而過表達(dá)SRF-N片段在一定程度上抑制了細(xì)胞增殖，這一結(jié)果與Western blot檢測到的PCNA蛋白的趨勢是一致的。此外，本實驗結(jié)果也證實，過表達(dá)SRF-Full可以促進(jìn)6-10B細(xì)胞的遷移和基質(zhì)黏附能力，而SRF-N具有一定的抑制6-10B細(xì)胞遷移和基質(zhì)黏附的能力，進(jìn)一步提示了SRF-N具有拮抗NPC進(jìn)展的生物學(xué)特性。

越來越多的證據(jù)表明SRF過表達(dá)可能影響腫瘤細(xì)胞EMT過程［18-21］。EMT即上皮源性腫瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)源性細(xì)胞表型，通常表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin和ZO-1表達(dá)下降，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如vimentin和N-cadherin等表達(dá)上升，同時功能上發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞侵襲、運(yùn)動能力增加。本研究通過Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，觀察到過表達(dá)SRF-Full能有效誘導(dǎo)6-10B細(xì)胞N-cadherin、vimentin和Snail1表達(dá)增加，同時E-cadherin表達(dá)減弱，過表達(dá)SRF-N則出現(xiàn)與SRF-Full相反的趨勢。由此提示，SRF-Full能促進(jìn)NPC細(xì)胞EMT進(jìn)展，而SRF-N能部分阻斷EMT進(jìn)程。這一結(jié)果也與功能上細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)、遷移與基質(zhì)粘附的結(jié)果趨勢相一致。由此可見，NPC中SRF-Full過表達(dá)可以通過EMT機(jī)制來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而SRF-N過表達(dá)后顯示出一定程度的負(fù)性調(diào)控EMT的作用而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

EMT被認(rèn)為是由相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子信號觸發(fā)的，這些轉(zhuǎn)錄因子主要包括Snail1、Slug、ZEB1、ZEB2和Twist1等，它們的激活被認(rèn)為是使細(xì)胞獲得侵襲性的關(guān)鍵過程［22-23］。既往報道，Snail1是最早被認(rèn)為可通過與E-box基序結(jié)合直接抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄來驅(qū)動EMT的轉(zhuǎn)錄因子之一［24］。研究表明，SRF從胞質(zhì)移位入核以上調(diào)Snail1的表達(dá)，Snail1和SRF的亞細(xì)胞定位影響細(xì)胞的表型和功能［25］，因此，SRF/Snail1信號的活化促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT［26］。本實驗也顯示SRF過表達(dá)顯著增加6-10B細(xì)胞中Snail1的表達(dá)。為探究NPC中SRF與Snail1之間的調(diào)控關(guān)系，我們通過啟動子活性分析實驗證明，SRF-Full增強(qiáng)了Snail1啟動子活性，而SRF-N在一定程度上抑制Snail1的轉(zhuǎn)錄活性，這與預(yù)期結(jié)果相一致。由此可見，SRF-N通過直接抑制Snail1的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)減弱EMT的作用。需要注意的是，本啟動子活性實驗中，細(xì)胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性SRF也可能發(fā)揮了一定作用。此外，Snail1突變型啟動子與SRF-Full和SRF-N較之NC對照啟動子仍具有較高的活性，很可能與SRF與Snail1結(jié)合位點未完全突變有關(guān)，

總之，本研究結(jié)果提示SRF-Full過表達(dá)促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖和遷移能力，而SRF-N過表達(dá)在一定程度上抑制了NPC細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力。機(jī)制上，SRF-N通過抑制Snail1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性來實現(xiàn)調(diào)控NPC細(xì)胞的EMT，SRF-N是SRF-Full的內(nèi)源性拮抗因子。進(jìn)一步明確SRF-N在抗腫瘤治療中的作用具有重要意義和潛在的臨床轉(zhuǎn)化價值。本研究為體外細(xì)胞學(xué)實驗，后期需要從動物實驗及臨床隊列研究的角度進(jìn)一步驗證。

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Effects of N-terminal fragment of serum response factor on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells

YUAN Jian-ling1，3， SHAO Zhong-ming1， ZOU Yuan1， WU Cai-xia1， ZHENG A-xiu1， XING Jing-ci1， BAI Jian-rong1， JIE Wei1，2△， SHEN Zhi-hua1△

（1，，，524023，；2，，，571199，；3，，518036，）

To explore the effects of the N-terminal fragment of serum response factor （SRF-N） on the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma （NPC） cells and its mechanisms.The full-length SRF （SRF-Full， 1 to 508 aa） overexpression， SRF-N （1 to 254 aa） overexpression and negative control （NC） lentiviral particles were used to infect human NPC 6-10B cells， and the monoclonal cells were obtained by puromycin resistance screening. Western blot was applied to detect the expression of Flag-tagged fusion protein. The cell viability， migration and adhesion were analyzed by CCK-8 assay， wound healing assay， Transwell assay and matrix-adhesion assay. The changes in proliferation-associated protein proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related factors were assessed by Western blot. Finally， dual-luciferase reporter assay was used to detect the regulatory effects of SRF-Full and SRF-N onpromoter.The 6-10B cells were successfully infected with SRF-Full， SRF-N and NC lentiviruses. The corresponding monoclonal cell lines， which were obtained by puromycin resistance screening combined with the expression of Flag tag protein， were labeled as 6-10BSRF-Full， 6-10BSRF-Nand 6-10BNC， respectively. Compared with 6-10BNCcells， increased viability， migration and adhesion to the matrix were observed in 6-10BSRF-Fullcells （<0.01）， while these capabilities of 6-10BSRF-Ncells were decreased compared with 6-10BSRF-Fullcells （<0.01）. Compared with 6-10BNCcells， the expression of vimentin， N-cadherin and Snail1 in 6-10BSRF-Fullcells were significantly increased （<0.01）， while the expression of E-cadherin was significantly decreased （<0.01）. Compared with 6-10BSRF-Fullcells， the expression of vimentin， N-cadherin and Snail1 in 6-10BSRF-Ncells was significantly decreased （<0.05）， while the expression of E-cadherin was significantly increased （<0.05）. The results of dual-luciferase reporter assay showed that SRF-Full significantly activatedpromoter compared with NC （<0.01）， while SRF-N significantly inhibitedpromoter compared with SRF-Full （<0.01）.SRF-Full promotes but SRF-N inhibits the proliferation and migration of NPC cells. SRF-N inhibitspromoter activity and mediates EMT of NPC. SRF-N may serve as a potential anti-NPC target.

Nasopharyngeal carcinoma； N-terminal fragment of serum response factor； Cell proliferation； Cell migration； Epithelial-mesenchymal transition

R 363.2； R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.019

1000-4718（2022）03-0535-08

2021-10-11

2022-01-13

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 81402415）；廣東省揚(yáng)帆計劃高層次人才項目（No. 4YF16007G）

申志華 Tel： 0759-2388587； E-mail： szh75@126.com； 揭偉 Tel： 0898-66968217； E-mail： wei_jie@hainmc.edu.cn

▲共同第一作者:并列第1作者

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）