鄒敏， 謝彩英， 甘娜， 農(nóng)志飛， 李崇進， 韋杏△

壯藥龍盤止咳方治療小鼠甲型流感病毒H1N1肺炎的作用及機制*

鄒敏1， 謝彩英2， 甘娜1， 農(nóng)志飛3， 李崇進4， 韋杏2△

（1廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西 南寧 530021；4茂名市中醫(yī)院兒科，廣東 茂名 525099）

探究壯藥龍盤止咳方的抗流感病毒性肺炎作用及其相關(guān)機制。BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、高劑量（10.4 g/kg）龍盤止咳方組、低劑量（5.2 g/kg）龍盤止咳方組和龍盤止咳方（10.4 g/kg）+Toll樣受體3（TLR3）激動劑聚肌胞苷酸［Poly（I：C），20 mg/kg］組，每組20只。采用甲型流感病毒（IAV）H1N1滴鼻法建立病毒性肺炎模型，觀察小鼠一般狀態(tài)，并每組取10只小鼠，記錄15 d的存活率和存活時間；計算肺、脾和胸腺指數(shù)；HE染色觀察肺組織病理變化；實時熒光定量PCR檢測肺病毒載量；ELISA法檢測肺勻漿中白細胞介素6（IL-6）、IL-4、干擾素α（IFN-α）、IFN-β和IFN-γ水平；Western blot檢測肺組織TLR3/視黃酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）/核因子κB（NF-κB）通路相關(guān)蛋白的表達。對照組小鼠精神狀態(tài)良好，在實驗期間未出現(xiàn)死亡；與對照組相比，模型組小鼠在感染后出現(xiàn)典型的流感癥狀，小鼠存活率、存活時間、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低（<0.05），肺指數(shù)，肺組織病理學(xué)評分，病毒載量，肺勻漿中IL-6、IL-4、IFN-γ、IFN-α和IFN-β水平，肺勻漿中IFN-γ/IL-4比值，以及肺組織TLR3、胞核NF-κB p65、RIG-I和干擾素β啟動子刺激蛋白1（IPS-1）表達均顯著增加（<0.05）；與模型組相比，高、低劑量龍盤止咳方組小鼠癥狀明顯減輕，小鼠存活率、存活時間、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、肺勻漿中IFN-α和IFN-β水平及肺組織RIG-I和IPS-1表達均顯著增加（<0.05），肺指數(shù)，肺組織病理學(xué)評分，病毒載量，肺勻漿中IL-6、IL-4和IFN-γ水平，肺勻漿中IFN-γ/IL-4比值，以及TLR3和胞核NF-κB p65表達均顯著降低（<0.05）；而Poly（I：C）可明顯減弱龍盤止咳方對IAV H1N1感染小鼠的肺臟保護作用。壯藥龍盤止咳方有減輕IAV H1N1感染小鼠肺損傷的作用，其機制可能與調(diào)節(jié)TLR3/RIG-I/NF-κB信號通路，抑制過度的先天炎癥反應(yīng)有關(guān)。

壯藥龍盤止咳方；甲型流感病毒H1N1；肺炎；Toll樣受體3；視黃酸誘導(dǎo)基因I；核因子κB

流感是由流感病毒引起并在人與人之間傳播的急性病毒性呼吸道感染。甲型流感病毒（influenza A virus， IAV）感染是其主要致病因素，可擴散到肺部并在肺部大量復(fù)制，引起病毒性肺炎，嚴(yán)重威脅人類健康［1-2］。疫苗提供的免疫效果有限，且需要每年重新接種。目前除接種疫苗預(yù)防外，確診后治療以抗病毒藥物為主，但長期大量使用抗病毒藥可增加病毒的抗藥性，具有較大毒副作用［3］。因此，對高效、低毒藥物的開發(fā)一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點。

Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）是識別細菌、病毒和真菌中病原體相關(guān)分子模式的主要受體，其中TLR3識別病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（double-stranded RNA， dsRNA），并且會誘導(dǎo)核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）的激活，觸發(fā)炎癥細胞因子［白細胞介素6（interleukin， IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ， IFN-γ）］產(chǎn)生［4-5］。視黃酸誘導(dǎo)基因I（retinoic acid-inducible gene I， RIG-I）是病毒誘導(dǎo)的抗病毒干擾素（interferon， IFN）和參與清除病毒感染的促炎細胞因子的重要調(diào)節(jié)劑，是抗病毒免疫的關(guān)鍵介質(zhì)［6］，可被病毒感染細胞中的病毒dsRNA激活，與線粒體抗病毒信號蛋白干擾素β啟動子刺激蛋白1（interferon-β promoter stimulator 1， IPS-1）相互作用，誘導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)，并激活I(lǐng)型和III型IFN的產(chǎn)生［7］。通過RIG-I途徑感知病毒存在對于宿主成功防御RNA病毒感染至關(guān)重要。據(jù)報道，RIG-I過表達增加了IAV感染小鼠的存活率［8］，表明TLR3/RIG-I/NF-κB通路為IAV感染治療的潛在靶點。

近年來，中醫(yī)藥在流感病毒性肺炎的防治上具有其獨特的優(yōu)勢和發(fā)展前景，尤其體現(xiàn)在免疫功能的調(diào)節(jié)上［9-10］。壯藥龍盤止咳方（Longpan-Zhike formula， LPZKF）具有清宣肺氣、化痰止咳、補虛扶正的功效，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，臨床上治療小兒咳嗽（風(fēng)熱犯肺證）療效顯著，且安全性好［11-12］。然而，LPZKF的抗流感作用卻尚未被報道。因此，本研究以IAV亞型H1N1肺炎模型小鼠為對象，旨在探究LPZKF的抗流感病毒性肺炎作用及其相關(guān)機制。

材料和方法

1　材料

1.1實驗動物、病毒和細胞SPF級BALB/c小鼠100只，6～8周齡，雌雄各半，體重（20±2） g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK（京）2019-0009。小鼠適應(yīng)流感病毒A/FM1/47（H1N1， FM1）來自中國疾病預(yù)防控制中心，首先將該病毒在Madin-Darby犬腎（Madin-Darby canine kidney， MDCK）細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0154）中進行噬斑純化，并在9日齡的雞胚胎中進行復(fù)制。在研究之前，在小鼠中預(yù)先滴定病毒庫以確定合適的攻擊劑量。兩次常規(guī)雞胚復(fù)蘇后，血凝滴度為1∶40。通過雙重稀釋法測定了不同濃度的病毒感染后14 d小鼠的死亡率。使用引起20%小鼠死亡的病毒濃度（血凝滴度1∶640），并給予每只小鼠50 μL病毒溶液進行實驗。

1.2藥品及試劑LPZKF含有龍脷葉10 g、魚腥草10 g、柿葉5 g、不出林5 g、盤龍參5 g和甘草5 g。將上述藥材浸入8倍量的水中充分浸泡30 min后，進行煎煮40 min，然后過濾，藥渣再加入6倍量水繼續(xù)煎煮40 min后，再次過濾，合并兩次過濾藥液，煎煮濃縮至100 mL，1 mL相當(dāng)于生藥0.4 g。TLR3激動劑聚肌胞苷酸［polyinosinic：polycytidylic acid， Poly（I：C）］購自上海懋康生物科技有限公司；HE染色試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；小鼠IL-4、IL-6、IFN-γ、IFN-α和IFN-β ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；TRIzol、PrimeScript? RT試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq? II試劑盒購自Takara；實時熒光定量PCR引物購自上海GenePharma公司；兔抗小鼠TLR3、NF-κB p65、GAPDH和histone H3抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG Ⅱ抗購自Abcam；抗RIG-I和IPS-1抗體購自Santa Cruz。

1.3儀器iMark?多功能酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）；BX61電動顯微鏡（Olympus）。

2　主要方法

2.1分組、造模及干預(yù)將小鼠隨機分為5組：對照（control）組、模型（model）組、高劑量（10.4 g/kg）LPZKF（high-dose LPZKF， LPZKF-H）組、低劑量（5.2 g/kg）LPZKF（low-dose LPZKF， LPZKF-L）組和LPZKF+Poly（I：C）［10.4 g/kg LPZKF+20 mg/kg Poly（I：C）］組，每組20只。適應(yīng)1周后，除control組外，其余各組小鼠均用乙醚輕度麻醉，用50 μL IAV H1N1懸浮液（稀釋1∶640）經(jīng)鼻攻擊建立流感病毒性肺炎模型［13］；control組在用乙醚輕度麻醉后，鼻腔滴入50 μL 0.9% NaCl無菌溶液。受感染的小鼠均未死亡。根據(jù)人與小鼠的體重差異計算藥物劑量，小鼠劑量相當(dāng)于人類（按平均體質(zhì)量70 kg體表面積換算）臨床劑量的9.1倍，LPZKF成人每日給藥劑量相當(dāng)于生藥40 g，則小鼠每日給藥劑量為5.2 g/kg，因此設(shè)置低、高劑量藥物劑量為5.2和10.4 g/kg。感染后24 h，給予感染小鼠上述劑量的LPZKF進行灌胃治療，治療組每天灌胃一次，共5 d；LPZKF+Poly（I：C）組小鼠在給予10.4 g/kg LPZKF灌胃的同時腹腔注射20 mg/kg Poly（I：C）［14］。control組和model組在相同時間點給予相同體積的生理鹽水，持續(xù)給藥直至實驗結(jié)束。

2.2小鼠一般狀態(tài)、存活率、肺和免疫相關(guān)器官指數(shù)的變化每天觀察小鼠的癥狀、飲水和食物攝入量、毛發(fā)顏色、活動情況；每組隨機選取10只小鼠，記錄連續(xù)15 d的存活率和存活時間。每組剩余10只小鼠，于感染后5 d末次給藥2 h后處死以收集肺、脾和胸腺組織，PBS洗滌后，用濾紙干燥并稱重。肺、脾或胸腺指數(shù)=肺、脾或胸腺的重量（mg）/體重（g）。

2.3肺組織病理變化觀察取部分新鮮肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。通過使用先前描述的評分系統(tǒng)［15］對H1N1引起的肺組織病理學(xué)變化進行評分來評估肺損傷的嚴(yán)重程度。0到4分分別代表正常、輕度、重度和非常重度肺損傷。具體而言，正常肺為0分，輕度間質(zhì)性肺炎（低于25%）為1分，中度間質(zhì)性肺炎（25～50%）為2分，嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎（50～75%）為3分，非常嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎（肺受累高于75%）為4分。

2.4實時熒光定量PCR檢測肺組織病毒載量取部分肺組織，研磨后在4 ℃下以4 000×離心15 min取上清液為肺勻漿。使用TRIzol提取其中的總RNA，并按照制造商的說明將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR擴增（參數(shù)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)）。每個樣品的分析一式三份進行。PCR產(chǎn)物的IAV量以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算。IAV M基因的正向引物序列為5'-AATGGTGCAGGCGATGAGAG-3'，反向引物序列為5'-TACTTGCGGCAACAACGAGAG-3'；GAPDH的正向引物序列為5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，反向引物序列為5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3'。

2.5ELISA檢測肺勻漿中細胞因子水平取2.4中制備的肺勻漿上清液，根據(jù)制造商的說明使用ELISA試劑盒檢測小鼠肺勻漿中IL-6、IL-4、IFN-α、IFN-β和IFN-γ水平。

2.6Western blot檢測肺組織TLR3/RIG-I/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達取小鼠部分肺組織加入RIPA裂解液研磨后，離心，取上清液為總蛋白溶液，并采用細胞核蛋白提取試劑盒提取細胞核中的蛋白質(zhì)。用BCA法測量蛋白濃度后取等量（25 μg）蛋白質(zhì)通過10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。然后將膜與Ⅰ抗（RIG-I和TLR3，1∶1 000；IPS-1和NF-κB p65，1∶500；GAPDH和histone H3，1∶2 000）在4°C下孵育過夜。在室溫下與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（1∶5 000）孵育2 h后，增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯色，使用Image J軟件測量每個條帶的灰度值。以GAPDH或Histone H3為內(nèi)參蛋白，計算各目的蛋白的相對表達量。

3　統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　LPZKF對小鼠一般狀態(tài)、存活率的影響

control組小鼠精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，行動敏捷，呼吸順暢，體重自然增長；model組小鼠在病毒感染后2 d出現(xiàn)典型的流感癥狀，包括毛皮豎起、身體蜷曲、弓背、食欲不振、飲水減少、抽搐和呼吸急促，同時體重逐漸下降；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠頭發(fā)聳立、呼吸急促、抽搐等癥狀明顯減輕，體重增加；LPZKF+Poly（I：C）組小鼠上述癥狀僅表現(xiàn)出輕微改善，見圖1A。

control組小鼠在實驗期間未出現(xiàn)死亡；病毒感染小鼠在感染后5 d開始死亡，8 d達到高峰；model組病毒感染小鼠均在15 d內(nèi)死亡，平均存活時間為7 d。與control組相比，model組小鼠存活率和存活時間均顯著降低（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠存活率和存活時間均顯著增加（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠存活率和存活時間均顯著降低（<0.05），見圖1B、C。

Figure 1.Changes of body weight， and survival rate and survival time within 15 d of the mice in each group. A： body weight （n=20）； B： survival rate （n=10）； C： survival time （n=10）. Mean±SD. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

2　LPZKF對小鼠肺和免疫相關(guān)器官指數(shù)的影響

與control組相比，model組小鼠肺指數(shù)顯著增加，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠肺指數(shù)顯著降低，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增加（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠肺指數(shù)顯著增加，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（<0.05），見圖2。

Figure 2.Comparison of lung， spleen and thymus indexes of the mice in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

3　LPZKF對小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，control組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無炎性分泌物，無炎性細胞浸潤；與control組相比，model組小鼠肺組織出現(xiàn)炎性損傷，包括肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚及嚴(yán)重的間質(zhì)水腫、血管充血、炎性滲出導(dǎo)致的支氣管阻塞，肺組織病理學(xué)評分顯著增加（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠肺組織病理變化得到了改善，肺泡壁薄，毛細血管擴張，肺泡壁充血少，肺泡間隔無明顯增厚，僅有少量單核細胞和淋巴細胞，細支氣管無炎性滲出，肺組織病理學(xué)評分顯著降低（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠肺組織病理學(xué)評分顯著增加（<0.05），見圖3。

Figure 3.Pathological changes of mouse lung tissues （HE staining， scale bar=100 μm） and the lung histopathological score. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； *P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

4　LPZKF對小鼠肺組織病毒載量的影響

與control組相比，model組小鼠肺組織中病毒載量顯著增加（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠肺組織病毒載量顯著降低（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠肺組織病毒載量顯著增加（<0.05），見圖4。

Figure 4.Comparison of viral load in lung tissues of the mice in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

5　LPZKF對小鼠肺組織炎性因子的影響

與control組相比，model組小鼠肺組織中IL-6、IL-4、IFN-γ、IFN-α和IFN-β水平，以及IFN-γ/IL-4比值均顯著升高（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠肺組織IL-6、IL-4和IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著降低，而IFN-α和IFN-β水平均顯著升高（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠肺組織IL-6、IL-4和IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著升高，而IFN-α和IFN-β水平均顯著降低（<0.05），見圖5。

Figure 5.Comparison of the levels of IL-6， IL-4， IFN-γ， IFN-α and IFN-β in the lung tissues of the mice in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

6　LPZKF對小鼠肺組織TLR3/RIG-I/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達的影響

與control組相比，model組小鼠肺組織中TLR3、胞核NF-κB p65、RIG-I和IPS-1表達均顯著增加（<0.05）；與model組相比，LPZKF-H和LPZKF-L組小鼠肺組織TLR3和胞核NF-κB p65表達均顯著減少，RIG-I和IPS-1表達均顯著增加（<0.05）；與LPZKF-H組相比，LPZKF+Poly（I：C）組小鼠肺組織TLR3和胞核NF-κB p65表達均顯著增加，RIG-I和IPS-1表達均顯著減少（<0.05），見圖6。

Figure 6.The expression of TLR3/RIG-I/NF-κB signaling pathway-related proteins in mouse lung tissues. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs LPZKF-H group.

討論

病毒性肺炎是由具有不同傳染性的病毒引起的一種急性呼吸道感染。1918年大流感、2003年嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征（SARS）冠狀病毒、2009年甲型H1N1流感病毒及2019年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）等暴發(fā)和（或）大流行對人類生活、社會行為和經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生重大影響，且目前尚未開發(fā)出針對這些病毒的特定藥物。與疫苗和化學(xué)藥物不同，中醫(yī)藥在治療病毒性肺炎方面有著悠久的歷史，具有副作用少、治療方法多樣、藥源豐富、耐藥性低等諸多優(yōu)點［10， 16］。

中醫(yī)雖無“病毒性肺炎”之稱，但主要歸咎于“外感病”或“外證”。中醫(yī)通常根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸類為“咳嗽”或“肺脹”。此外，傳染性強、病死率高的病毒性肺炎在中醫(yī)中通常被歸類為“疫病”。中醫(yī)治療“疫病”在中國歷史悠久，臨床經(jīng)驗豐富，療效顯著。中藥在治療病毒性肺炎方面具有多種藥理作用。除了直接或間接的抗病毒作用外，中醫(yī)最大的優(yōu)點是調(diào)節(jié)免疫功能和低副作用［17］。LPZKF中龍脷葉，有潤肺止咳的功效，并有顯著的抗炎活性，可減輕哮喘模型大鼠肺組織與支氣管炎性病變［18］；魚腥草，為肺病圣藥，具有廣譜抗流感病毒和促進免疫功能的作用，治療小兒呼吸道合胞病毒肺炎能夠顯著改善患兒臨床癥狀、調(diào)節(jié)患兒免疫應(yīng)答［19］，與龍脷葉同為主藥；柿葉，肅肺止咳，且其有效成分（如黃酮類、多糖類、萜類和有機酸類）可調(diào)節(jié)免疫［20］；不出林具理氣化痰止咳之功，盤龍參強于潤肺、止咳、滋陰補虛；甘草，補中益氣、潤肺止咳，調(diào)和諸藥，且甘草及甘草酸類成分有抗冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和人巨細胞病毒等呼吸道病毒的作用，可調(diào)節(jié)免疫，改善肺功能［21-22］。由此我們猜想LPZKF可能對IAV感染損傷的肺臟具有保護作用。本研究結(jié)果也顯示，LPZKF可顯著緩解感染小鼠的臨床癥狀，減少體重減輕程度，延長存活時間，減輕肺部病變。這些結(jié)果表明LPZKF可以有效地保護小鼠免受IAV感染。

流感病毒誘導(dǎo)炎癥細胞浸潤肺組織并釋放促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α和IFN-γ），導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性肺炎，誘導(dǎo)死亡。肺指數(shù)可反映肺部感染的嚴(yán)重程度；脾臟和胸腺是免疫相關(guān)器官，脾臟和胸腺指數(shù)反映了小鼠的免疫功能。在本研究中，LPZKF處理的小鼠肺指數(shù)和肺組織病理學(xué)評分較低，表明LPZKF可能降低肺水腫的發(fā)生率，緩解IAV引起的肺部炎癥。此外，本研究數(shù)據(jù)顯示IAV會顯著降低小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，提高肺組織中的IL-6、IL-4和IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值。IFN-γ主要由Th1細胞分泌，IL-4主要由Th2細胞分泌，機體正常時，Th1和Th2細胞功能處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機體受到病毒等微生物感染時，機體Th1和Th2細胞平衡失調(diào)［23］。流感病毒是一種嚴(yán)格的胞內(nèi)病原微生物，感染宿主后主要刺激Th細胞向Th1細胞分化并釋放其標(biāo)志性細胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2等）［24］。而LPZKF可以抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，抑制組織和細胞中的炎癥反應(yīng)，并且LPZKF可以增加胸腺和脾臟指數(shù)，使IAV感染小鼠中增高的IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值降低，逆轉(zhuǎn)Thl/Th2的失衡；提示，LPZKF可抑制過度的先天炎癥反應(yīng)，減少機體的免疫炎癥損傷，從而保護感染IAV的小鼠免受進一步損害。

本研究還發(fā)現(xiàn)，LPZKF可顯著增加IAV感染小鼠肺組織中IFN-α和IFN-β水平；IFN-α和IFN-β是主要的I型IFN，可抑制H1N1病毒的復(fù)制［25］。I型IFN的快速產(chǎn)生和最近發(fā)現(xiàn)的III型IFN構(gòu)成了宿主抵御呼吸道病毒感染的主要防御機制，是抗病毒反應(yīng)的核心和重要組成部分。TLR3和RIG-I均屬于固有免疫的模式識別受體，可識別病毒增殖過程中產(chǎn)生的dsRNA從而激活TLR3信號通路和RIG-I信號通路，最終促進細胞因子產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。TLR3是TLR家族中識別新型H1N1病毒啟動先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的主要成員，介導(dǎo)I型IFN、促炎細胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)；據(jù)報道，2009年H1N1流感感染患者中TLR3表達升高［26］；IAV感染后TLR3信號通路優(yōu)先被激活，誘導(dǎo)NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，以釋放一系列促炎細胞因子，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［27］。RIG-I是一種高度誘導(dǎo)型細胞質(zhì)RNA解旋酶，可感知病毒感染并與抗病毒信號蛋白IPS-1相互作用，激活對IAV的抗病毒反應(yīng)，誘導(dǎo)I型和III型IFN產(chǎn)生，這可能會限制病毒復(fù)制并增加對感染的抵抗力［28］；并且IFN-α和IFN-β水平可以間接反映RIG-I的活化情況。本研究結(jié)果顯示，模型組肺組織病毒載量和RIG-I、胞核NF-κB p65、TLR3、IPS-1蛋白表達均顯著升高，說明TLR3/RIG-I/NF-κB信號通路被激活；model組小鼠肺組織RIG-I、IPS-1表達增加，推測其原因可能是機體在面對感染時所作出的一種代償性的增加，但這種代償性的增加不足以抵抗病毒感染。小鼠口服LPZKF后，病毒復(fù)制和胞核NF-κB p65、TLR3蛋白過表達受到抑制，RIG-I、IPS-1蛋白表達增加；且在LPZKF干預(yù)的基礎(chǔ)上，使用TLR3激動劑Poly（I：C）上調(diào)TLR3的表達后，發(fā)現(xiàn)LPZKF對IAV感染小鼠肺損傷的保護作用被明顯減弱，且RIG-I、IPS-1表達降低。推測原因可能是Poly（I：C）干預(yù)后，TLR3被激活，誘導(dǎo)NF-κB活化并易位至細胞核，促進一系列促炎細胞因子釋放，加重炎癥反應(yīng)，這可能使機體對感染的抵抗力減弱，進而導(dǎo)致RIG-I、IPS-1表達降低。這些結(jié)果表明LPZKF可能通過調(diào)節(jié)TLR3/RIG-I/NF-κB信號通路來抑制過度的炎癥反應(yīng)，進而減輕IAV感染小鼠肺損傷。

綜上所述，壯藥LPZKF可能通過調(diào)節(jié)TLR3/RIG-I/NF-κB信號通路，抑制過度的先天炎癥反應(yīng)，從而減輕IAV感染小鼠的肺損傷。本研究僅初步探討了LPZKF對IAV感染小鼠肺損傷的保護作用，在未來的工作中，我們將進一步研究其他潛在的活性成分是否具有直接的抗病毒或抗炎作用；此外，在后續(xù)的研究中將考慮進行基因敲除或沉默的細胞實驗，深入分析其作用機制是否與TLR3/RIG-I/NF-κB通路有關(guān)。

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Effect of Zhuang medicine Longpan-Zhike formula on influenza A virus H1N1 pneumonia in mice and its mechanism

ZOU Min1， XIE Cai-ying2， GAN Na1， NONG Zhi-fei3， LI Chong-jin4， WEI Xing2△

（1，，530001，；2，，530200，；3，，530021，；4，，525099，）

To explore the effect of Zhuang medicine Longpan-Zhike formula （LPZKF） on anti-influenza virus pneumonia and its related mechanism.BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， high-dose （10.4 g/kg） LPZKF group， low-dose （5.2 g/kg） LPZKF group， and LPZKF （10.4 g/kg）+Toll-like receptor 3 （TLR3） agonist polyinosinic：polycytidylic acid ［Poly（I：C）， 20 mg/kg］ group， with 20 rats in each group. Influenza A virus （IAV） H1N1 intranasal drip method was used to establish a viral pneumonia model. The general state of the mice was observed， and 10 mice were taken from each group to record the 15-day survival rate and survival time. The lung， spleen and thymus indexes were calculated， and HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect lung viral load， and ELISA was used to measure the levels of interleukin （IL）-6， IL-4， interferon （IFN）-α， IFN-β and IFN-γ in lung homogenates. Western blot was used to detect the expression of TLR3/retinoic acid-inducible gene-I （RIG-I）/nuclear factor-κB （NF-κB） pathway related proteins in lung tissues.All control mice were shown in good mental state and did not die during the experiment. Compared with control group， the mice in model group showed typical flu symptoms after infection， the survival rate， survival time， spleen index and thymus index of the mice were reduced significantly （<0.05）， while the lung index， lung histopathological score， viral load， IL-6， IL-4， IFN-γ， IFN-α and IFN-β levels in lung homogenates， IFN-γ/IL-4 ratio in lung homogenates， and TLR3， nuclear NF-κB p65， RIG-I and interferon-β promoter stimulator 1 （IPS-1） expression in lung tissues were increased significantly （<0.05）. Compared with model group， the symptoms of the mice in high- and low-dose LPZKF groups were attenuated significantly， the survival rate， survival time， spleen index， thymus index， IFN-α and IFN-β levels in lung homogenates， and RIG-I and IPS-1 expression in lung tissues were increased significantly （<0.05）， while the lung index， lung histopathological score， viral load， IL-6， IL-4 and IFN-γ levels in lung homogenates， IFN-γ/IL-4 ratio in lung homogenates， and TLR3 and nuclear NF-κB p65 expression in lung tissues were reduced significantly （<0.05）. Moreover， Poly（I：C） significantly blocked the protective effect of LPZKF on the lung of IAV H1N1-infected mice.Zhuang medicine Longpan-Zhike formula reduces lung injury in mice infected with IAV H1N1， and the mechanism may be related to TLR3/RIG-I/NF-κB signaling pathway and inhibiting excessive innate inflammatory response.

Zhuang medicine Longpan-Zhike formula； Influenza A virus H1N1； Pneumonia； Toll-like receptor 3； Retinoic acid-inducible gene I； Nuclear factor-κB

R285.5； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.018

1000-4718（2022）03-0526-09

2021-10-26

2022-01-04

［基金項目］廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（No. 2018KY0302）；2021年廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院院級課題（No. GZ2021012）

Tel： 13877196656； E-mail： 614486902@qq.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）