趙斌， 王美玲， 馬文彬， 張青青

圣草酚通過激活Nrf2/HO-1通路減輕大鼠缺氧缺血性腦損傷*

趙斌， 王美玲， 馬文彬， 張青青△

（濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，山東 濱州 256603）

探討圣草酚（eriodictyol）在大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）中的作用及機制。50只幼齡Wistar大鼠分為健康對照組、模型（HIBD）組、HIBD+eriodictyol 1 mg/kg組和HIBD+eriodictyol 2 mg/kg組和HIBD+eriodictyol 4 mg/kg組，每組10只。采用Rice-Vannucci法建立缺氧缺血性腦損傷大鼠模型，造模成功后，治療組大鼠分別口服1、2和4 mg/kg的圣草酚，對照組和模型組大鼠則口服生理鹽水；Y迷宮實驗檢測新異臂進入次數(shù)；根據TTC法計算各組大鼠腦組織含水率及腦指數(shù)；HE染色法觀察腦組織損傷程度并行病理學評分；TUNEL染色法觀察腦組織中細胞凋亡水平；Western blot檢測cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1， Keap1）、核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）的蛋白表達水平；ELISA測定外周血中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）的含量。與對照組相比，HIBD組大鼠腦組織損傷程度、細胞凋亡水平及TNF-α、 IL-6和iNOS表達水平均顯著升高（<0.05），p-Nrf2和HO-1蛋白表達顯著降低（<0.05）。與HIBD組相比，經2和4 mg/kg圣草酚給藥治療后，腦組織損傷程度顯著減輕（<0.05），腦組織細胞凋亡率及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表達水平顯著降低（<0.05），促炎因子TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量顯著降低（<0.05），Keap1、p-Nrf2和HO-1蛋白表達顯著上調（<0.05）。圣草酚可減輕大鼠缺氧缺血性腦損傷，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關。

圣草酚；缺氧缺血性腦損傷；Nrf2/HO-1信號通路；細胞凋亡

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage， HIBD）是由各種圍生期因素引起的腦缺氧或缺血而形成的腦損傷，是導致兒童發(fā)育遲緩、智力低下、癲癇甚至腦癱等后遺癥的主要病因［1-2］。研究表明，缺氧缺血性腦損傷的嚴重程度與氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應有關［3-4］。在缺氧缺血性腦損傷發(fā)病過程中，炎癥因子和凋亡蛋白的異常表達會加劇腦組織缺氧缺血，產生嚴重的腦組織損傷等疾病。圣草酚是一種存在于大多數(shù)植物中的天然二氫類黃酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經保護等多種藥理活性，常被用于治療氣管炎、風濕和過敏性鼻炎等疾?。?］。隨著國內外對圣草酚的深入研究表明，圣草酚的藥理作用與核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）信號通路密切相關［6-8］，因此，本項工作應用缺氧缺血性腦損傷大鼠模型探索圣草酚對HIBD大鼠腦組織中凋亡蛋白和炎癥因子表達水平的影響，并初步了解其作用機制。

材料和方法

1　動物

50只清潔級雄性Wsitar大鼠（1～2周齡，體重12～18 g），購自山東大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（魯） 2019-0001。實驗動物嚴格遵守3R原則，并通過醫(yī)院倫理委員會批準。實驗動物飼養(yǎng)于漯河醫(yī)學高等?？茖W校重點實驗室，每只大鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴格、規(guī)范的卡片登記管理，24℃條件下封閉群養(yǎng)。

2　主要試劑

圣草酚（純度≥98％，購自上海源葉生物科技有限公司）；2，3，5-三甲基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒購自Sigma；末端轉移酶介導的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyltransferasemediated 2'-deoxyuridine 5'-triphosphate nick-end labeling， TUNEL）染色試劑盒購自Roche；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1， Keap1）、Nrf2和HO-1兔單克隆抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標記的對應Ⅱ抗均購自Abcam。

3　主要方法

3.1動物分組、建模及給藥將50只Wsitar大鼠分為健康對照（healthy control）組、模型組（HIBD組）、HIBD+eriodictyol 1 mg/kg組、HIBD+eriodictyol 2 mg/kg組和HIBD+eriodictyol 4 mg/kg組共5組，每組10只；參照文獻［9-10］，采用Rice-Vannucci法建立缺氧缺血性腦損傷大鼠模型，新生幼齡大鼠行左側頸總動脈結扎，其中在8% O2、35 ℃條件下缺氧40 min，幼鼠死亡率為5%，成模率為90%；造模成功2 h后，治療組分別口服圣草酚（1，2和4 mg/kg）給藥治療［11］，對照組和模型組口服生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。

3.2新異臂進入次數(shù)、腦含水率及腦指數(shù)檢測自發(fā)性交替反應、空間識別、主動回避三步驟法檢測大鼠新異臂進入次數(shù)，評估大鼠學習和記憶能力。斷頭法處死大鼠，取出大腦，剝去腦膜、小腦和腦干，用磷酸鹽緩沖清洗，濾紙吸干稱取體質量；將大腦切成小片并放入1％ TTC溶液中，37℃溫箱中孵育20 min染色，待孵育完成后，將腦片置于10％甲醛中固定24 h 后稱取濕質量，隨后將其放入烘箱（105 ℃）中12 h至恒質量后，取出并稱取干質量，計算腦含水率、腦指數(shù)。腦含水率（％）=（腦片濕質量-腦片干質量）/腦片濕質量×100％；腦指數(shù)（％）=大腦質量/體質量×100％。

3.3HE染色斷頭法處死大鼠，取出大腦，4％多聚甲醛固定腦組織，石蠟包埋切片；經脫蠟、水化后，行HE染色；光鏡下下拍照并觀察記錄組織形態(tài)學變化。并參照陳惠金等［12］的文獻行腦組織病理損傷評分。

3.4TUNEL染色斷頭法處死大鼠并迅速取出大腦皮質于4％多聚甲醛溶液中充分固定，48 h后脫水、浸蠟、石蠟包埋；按照TUNEL染色試劑盒說明書進行染色；凋亡細胞即陽性細胞在光鏡下呈棕黃色或棕褐色，非凋亡細胞即陰性細胞呈藍色。

3.5ELISA檢測收集外周血，并在4℃、1 509 ×條件下離心25 min，離心完成后，提取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6和iNOS含量。

3.6Western blot檢測取大腦組織組織研磨均勻，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取腦組織總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定腦組織蛋白濃度，每孔上樣20 μg樣品蛋白，經SDS-PAGE分離、轉模、脫脂奶粉封閉，加入Ⅰ抗（1∶1 000），4 ℃孵育搖床上過夜?；厥闸窨?，加入按比例稀釋HRP標記的對應Ⅱ抗（1∶4 000），室溫孵育120 min。采用ECL化學發(fā)光法于暗室下進行曝光顯影（β-actin作內參照）。將膠片進行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件分析吸光度值，結果以目的蛋白和內參照蛋白條帶灰度值比值表示，實驗重復3次，取平均值。

4　統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0軟件分析。正態(tài)分布的計量資料表示為均數(shù)±標準差（mean±SD）。多組數(shù)據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　圣草酚對HIBD大鼠腦功能的影響

各組大鼠新異臂進入次數(shù)分別為5.7±0.6、3.7±0.5、3.8±0.4、4.5±0.5和5.3±0.3，腦指數(shù)分別為0.32±0.08、0.68±0.09、0.65±0.05、0.47±0.07和0.36±0.06，腦含水率分別為（71±4）%、（88±6）%、（86±4）%、（80±5）%和（73±3）%。與健康對照組相比，模型組大鼠新異臂進入次數(shù)顯著降低（<0.05），腦指數(shù)和腦含水率顯著升高（<0.05），證明造模成功。與模型組相比，1 mg/kg圣草酚給藥治療后，新異臂進入次數(shù)、腦指數(shù)和腦含水率無顯著改變（0.05），經2和4 mg/kg圣草酚治療后，新異臂進入次數(shù)顯著升高，腦指數(shù)和腦含水率顯著下調（<0.05）。見圖1。

Figure 1.Effects of eriodictyol on the number of new arm entry （A）， brain index （B） and brain moisture content （C） of young rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs healthy control group； #P<0.05 vs HIBD group.

2　圣草酚對HIBD大鼠腦組織病理學的影響

健康對照組大鼠腦組織形態(tài)正常，無組織損傷，與健康對照組相比，模型組大鼠腦組織結構紊亂，組織損傷嚴重，可見大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，經圣草酚給藥治療后，HIBD大鼠腦組織損傷程度有顯著改善。與健康對照組相比，模型組大鼠腦組織病理評分顯著升高（<0.05）。與模型組相比，1 mg/kg圣草酚給藥治療后無顯著改變，經2和4 mg/kg圣草酚治療后，大鼠腦組織病理評分顯著降低（<0.05）。見圖2。

Figure 2.HE staining images of young rat brain tissues in each group （scale bar=50 μm）. A： healthy control group； B： HIBD group； C： HIBD+eriodictyol 1 mg/kg group； D： HIBD+eriodictyol 2 mg/kg group； E： HIBD+eriodictyol 4 mg/kg group.

3　圣草酚對HIBD大鼠腦組織細胞凋亡的影響

TUNEL染色檢測圣草酚對大鼠腦組織細胞凋亡的影響，如圖3A所示，陽性細胞的細胞核（凋亡細胞）被染成棕黃色或褐色，胞質不著色，正常細胞核呈淡藍色。與健康對照組相比，模型組大鼠腦組織結構紊亂，可見大量凋亡小體（棕黃色/褐色），細胞凋亡率顯著升高（<0.05）；與模型組相比，2和4 mg/kg圣草酚給藥治療后，大鼠腦組織凋亡小體數(shù)顯著減少（<0.05），見圖3B。各組大鼠腦組織中cleaved caspase-9/caspase-9表達水平分別為0.0±0.0、0.54±0.05、0.52±0.06、0.09±0.02和0.02±0.01，cleaved caspase-3/caspase-3表達水平分別為0.01±0.01、0.38±0.04、0.35±0.07、0.05±0.03和0.01±0.01。與健康對照組相比，模型組大鼠腦組織中cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9蛋白表達水平顯著升高（<0.05）；與模型組相比，經1 mg/kg圣草酚治療后，凋亡蛋白表達水平無顯著改變，2和4 mg/kg圣草酚治療則顯著抑制cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9的蛋白表達（<0.05），見圖3C。

Figure 3.Effect of eriodictyol on apoptosis of brain tissue in rats with hypoxic-ischemic brain damage （HIBD）. A： TUNEL staining images of young rat brain tissues in each group （scale bar=50 μm）； B： the apoptosis rate of brain tissues in each group was semi-quantitatively analyzed； C： Western blot was used to detect the expression levels of apoptotic proteins in brain tissues of young rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs healthy control group； #P<0.05 vs HIBD group.

4　圣草酚對HIBD大鼠促炎因子表達水平的影響

與健康對照組相比，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量顯著升高（<0.05）；與模型組相比，經1 mg/kg圣草酚給藥治療后，促炎因子表達水平無顯著差異（>0.05），2和4 mg/kg圣草酚治療組TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量顯著降低（<0.05）。見圖4。

Figure 4.ELISA determination of TNF-α （A）， IL-6 （B） and iNOS （C） levels in peripheral blood of young rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs healthy control group； #P<0.05 vs HIBD group.

5　圣草酚對HIBD大鼠Nrf2磷酸化及Keap1和HO-1蛋白表達的影響

與健康對照組相比，模型組大鼠Keap1、p-Nrf2/Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著下降<0.05）；與模型組相比，1 mg/kg圣草酚給藥治療后，Keap1、p-Nrf2/Nrf2和HO-1蛋白表達水平無顯著差異（>0.05），經2和4 mg/kg圣草酚治療后，Keap1、p-Nrf2/Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著上調（<0.05）。見圖5。

Figure 5.Western blot detection of Keap1， p-Nrf2 and HO-1 protein expression levels in the brain tissue of young rats in each group. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs healthy control group； #P<0.05 vs HIBD group.

討論

缺氧缺血性腦損傷常見于新生兒，其他年齡段也有發(fā)生，雖然發(fā)病率不高，但是會誘發(fā)一系列后遺癥。缺氧缺血性腦損傷會導致水腫、炎癥反應、自由基產生、小膠質細胞活化等病理生理過程，大量炎癥因子的釋放會加重腦組織損傷［13］。本研究結果顯示，缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織功能下降，新異臂進入次數(shù)減少，腦含水率和腦指數(shù)升高，組織損傷嚴重，大量腦組織細胞凋亡，炎癥因子異常表達加劇缺氧缺血性腦損傷。經2和4 mg/kg圣草酚給藥治療后，新異臂進入次數(shù)增加，腦含水率和腦指數(shù)下降，組織損傷程度好轉，結果提示，圣草酚能夠改善缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織功能，緩解腦組織損傷。

研究表明，細胞凋亡也參與缺氧缺血性腦損傷發(fā)生過程，缺氧缺血性腦損傷發(fā)生時，上游細胞凋亡起始蛋白caspase-9誘導并活化下游細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，凋亡蛋白caspase-3和caspase-9被異常激活，使得大腦組織產生大量的cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，并進一步執(zhí)行DNA裂解及細胞凋亡過程，加重腦組織損傷［3，14］。本研究通過TUNEL和Western blot檢測腦組織中細胞凋亡程度、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達水平，結果顯示，模型組大鼠腦組織中細胞凋亡程度顯著升高，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達增加；經2和4 mg/kg圣草酚治療后，cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達顯著降低，細胞凋亡數(shù)顯著減少。結果提示，圣草酚抑制缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織中凋亡蛋白的表達，緩解腦組織細胞凋亡引起的腦組織損傷。

缺氧缺血腦損傷引起腦組織主要的生理病理改變是能量代謝紊亂，促使氧自由基積累和細胞內鈣超載，機體內部氧化與抗氧化作用失去平衡，導致細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量的炎癥因子和氧化中間產物。研究表明，缺氧缺血性腦損傷與氧化應激和炎癥反應密切相關［15］。TNF-α、IL-6和iNOS是重要的炎癥調節(jié)因子，參與多種生理和細胞免疫過程，誘導機體發(fā)生炎癥反應，在缺氧缺血性腦損傷中起負調控作用。本實驗結果顯示，模型組大鼠外周血中TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量升高，經圣草酚治療后，TNF-α、IL-6和iNOS蛋白含量降低。結合HE染色結果可知，圣草酚抑制缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織炎癥因子蛋白表達，減少炎癥細胞浸潤，緩解炎癥因子高表達引起的腦組織損傷。

為進一步明確圣草酚緩解缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織功能的作用機制，本實驗利用Western blot檢測Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平。Nrf2是抗氧化劑的關鍵轉錄調節(jié)因子，當細胞處于氧化應激狀態(tài)時，Nrf2與其負性調節(jié)因子Keap1發(fā)生解離轉入細胞核內與小Maf蛋白結合形成異二聚體，異二聚體與抗氧化反應元件結合，促使基因的表達，從而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用［16-18］。Nrf2磷酸化（p-Nrf2）可促進Nrf2核蓄積和抗氧化反應元件受體轉基因的激活，增強Nrf2與核內相關蛋白的結合，上調抗氧化酶基因表達，研究顯示，Nrf2/HO-1信號通路負調控TNF-α、IL-6、IL-1β和cleaved caspase-3表達，從而減輕氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡對機體的損傷［19-20］。本研究結果顯示，模型組大鼠高表達TNF-α、IL-6和iNOS，低表達Keap1、p-Nrf2/Nrf2和HO-1，經2和4 mg/kg圣草酚治療后，TNF-α、IL-6和iNOS蛋白表達量降低，Keap1、p-Nrf2/Nrf2和HO-1蛋白表達升高，結果提示，圣草酚通過激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制凋亡蛋白和促炎因子表達，緩解缺氧缺血性腦損傷大鼠因凋亡蛋白和炎癥因子高表達引起的腦組織損傷。

綜上所述，圣草酚可抑制缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織凋亡蛋白和炎癥因子表達，減輕大鼠腦組織損傷，作用機制與Nrf2/HO-1信號通路有關。本實驗通過動物模型初步探討了圣草酚在缺氧缺血性腦損傷中的作用及機制，為圣草酚在缺氧缺血性腦損傷中的臨床應用提供了實驗基礎。

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Eriodictyol attenuates hypoxic-ischemic brain damage in rats by activating Nrf2/HO-1 signaling pathway

ZHAO Bin， WANG Mei-Ling， Ma Wen-bing， ZHANG Qing-qing△

（，，256603，）

To investigate the effect and mechanism of eriodictyol on hypoxic-ischemic brain damage （HIBD） in rats.Fifty young Wistar rats were divided into healthy control group， model group （HIBD group）， HIBD+eriodictyol 1 mg/kg group， HIBD+eriodictyol 2 mg/kg group and HIBD+eriodictyol 4 mg/kg group， with 10 rats in each group. Rice-Vannucci method was used to establish the rat model of hypoxic-ischemic brain injury. Eriodictyolat the does of 1， 2 and 4 mg/kg was orally administered in rats， normal saline was serve as control. The number of new heteroarm entry was tested by Y maze test. Brain water content and brain index were calculated by 2，3， 5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） method. Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe the degree of brain tissue damage and pathological score. TUNEL staining was used to observe the apoptotic rate of brain cells. Cleaved caspase-3， cleaved caspase-9， Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1 （Keap1）， nuclear factor E2-related factor 2 （p-Nrf2/Nrf2）， and heme oxygenase-1 （HO-1） protein expression levels were detected by Western blot. The protein levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and inducible nitric oxide synthase （iNOS） in peripheral blood were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.Compared with healthy control group， the level of brain injury， apoptosis and expression of inflammatory factors （TNF-α， IL-6 and iNOS） in model group were significantly increased （<0.05）， while the expression of p-Nrf2 and HO-1 protein was significantly decreased （<0.05）. Compared with model group， 2 and 4 mg/kg eriodictyol significantly improved the degree of brain injury （<0.05）， it is also significantly reduced the apoptotic rate of brain cells and cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 protein expression levels （<0.05）. The protein levels of pro-inflammatory factors such as TNF-α， IL-6 and iNOS were significantly decreased （<0.05）， and the protein expressions of Keap1， p-Nrf2 and HO-1 were significantly up-regulated after treated with eriodictyol （<0.05）.Eriodictyol alleviates hypoxic-ischemicbrain injury in rats through Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Eriodictyol； Hypoxic-ischemic brain damage； Nrf2/HO-1 signaling pathway； Apoptosis

R722； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.014

1000-4718（2022）03-0495-07

2021-11-17

2022-02-22

［基金項目］山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目（No. 2018WS539）

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（責任編輯：林白霜，余小慧）