梁明宇， 馮洋， 劉婭榮， 李淑彤， 歐陽潔琳， 陳芳，祝益民， 鄒聯(lián)洪，△， 蔣宇△

家兔心臟停搏自主循環(huán)恢復后血清代謝組學特征分析*

梁明宇1， 馮洋1， 劉婭榮1， 李淑彤1， 歐陽潔琳1， 陳芳2，祝益民2， 鄒聯(lián)洪1，2△， 蔣宇2△

［1湖南師范大學，分子流行病學湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410013；2湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學附屬第一醫(yī)院）湖南省急救醫(yī)學研究所，湖南 長沙 410005］

探討分析家兔心臟停搏（CA）自主循環(huán)恢復（ROSC）后血清代謝組學特征變化。10只雄性新西蘭家兔，采用窒息法制備CA家兔模型，于CA前、ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h各收集2 mL血液樣品，通過氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）測定各時間點血清代謝產物，采用Simca P軟件對血清代謝輪廓特征進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），通過MetaboAnalyst 5.0軟件進行檢驗、火山圖、聚類熱圖分析差異代謝產物，并對差異代謝物進行KEGG代謝通路分析。與CA前相比，ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h家兔的血清代謝輪廓特征發(fā)生明顯改變，分別有50、44、58和78個差異代謝物，其中山梨糖、賴氨酸、乙醇胺、2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸和腐胺含量在ROSC后均減少（<0.05），莽草酸、磷酸絲氨酸、-甲基-L-谷氨酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇（香草醇）、塔格糖、氨基丙二酸、乳果糖、吲哚-3-乙酸、景天庚酮糖和肌酸含量在ROSC后均增加（<0.05）。?；撬岷吭赗OSC后15 min、6 h和24 h減少（<0.05），在ROSC后3 h含量差異無統(tǒng)計學意義。與CA前相比，ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h分別有8、8、12和15條差異代謝通路，其中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成在ROSC后均下調，精氨酸和脯氨酸代謝在15 min和3 h時下調，而在6和24 h時上調。磷酸戊糖途徑在ROSC后15 min時受到抑制，但是在其他時點無差異。CA家兔ROSC后的血清代謝組學存在顯著動態(tài)差異。磷酸戊糖途徑受限和牛磺酸水平下調可能與ROSC后的損傷有關，而肌酸水平上調提示心肌細胞損傷。

心臟停搏；自主循環(huán)恢復；代謝組學

心臟停搏（cardiac arrest， CA）是指各種原因導致的心臟射血功能突然停止，隨即出現(xiàn)脈搏消失、意識喪失、呼吸循環(huán)中斷的現(xiàn)象，致死率極高，是一個嚴重威脅生命安全的世界性公共健康問題［1］。隨著急診急救技術的不斷進步和應用，越來越多患者經搶救后能達到自主循環(huán)恢復［2］。但目前對CA和CA自主循環(huán)恢復（return of spontaneous circulation， ROSC）后的研究大部分是基于臨床治療效果的觀察，缺乏動態(tài)的、多路徑的CA和ROSC后的發(fā)病進程研究。

新陳代謝是機體生命活動的基本特征，代謝變化在疾病病情判斷、早期診斷、預后及療效評估等方面逐漸受到重視，而代謝組學能對生物體內代謝物進行識別和定量分析，并尋找代謝物與疾病的病理生理變化關聯(lián)［3］。CA后缺氧缺血所致的器官損傷是幸存者后期死亡和長期神經功能障礙的主要原因［4］，而缺血缺氧后機體會出現(xiàn)特征性的代謝變化。運用代謝組學分析ROSC后的動態(tài)代謝變化，可為發(fā)掘CA復蘇后器官損傷可能的機理提供數(shù)據(jù)支持，為新治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供有效幫助。因此，本研究通過制備新西蘭家兔窒息性CA模型并進行復蘇，從代謝組學層面探索家兔CAROSC后血清代謝物的動態(tài)變化，為CA研究提供理論依據(jù)和參考。

材料與方法

1　實驗動物

雄性新西蘭家兔10只，平均體重為（2.50±0.18） kg，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2013-0004。動物實驗符合倫理學標準。

2　CA家兔模型制作及樣本收集

新西蘭家兔禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后固定于兔臺，耳緣動脈置動脈留置針用于血壓監(jiān)測，生物機能實驗儀實時監(jiān)測體溫、心率、血壓，記錄正常（normal）狀態(tài)的數(shù)值。氣管插管后，采用窒息方式誘導室顫致CA，致顫時長為3～4 min，以心電顯示無脈搏心電活動或無電活動，血壓小于10 mmHg作為CA標志，7 min后用動物呼吸機給予機械通氣，注射腎上腺素并行胸外按壓術至自主循環(huán)恢復，復蘇至ROSC時長為2～3 min，分別于CA造模前（即正常狀態(tài)）、ROSC后15 min、3 h、6 h、24 h從耳緣動脈抽血2 mL，收集血清樣本于-80 ℃中保存?zhèn)溆?，研究流程圖如圖1所示。

Figure 1.Flow chart of cardiac arrest （CA） rabbit model. ROSC： return of spontaneous circulation.

3　樣品處理及質量控制

將存于-80 ℃的血清樣本取出置于冰上自然解凍，取每份待測血清樣品5 μL混合于進樣瓶中制作成質量控制（quality control，QC）樣品。每個樣本取100 μL，加入內標10 μL（L-2-氯-苯丙氨0.3 g/L，甲醇配置）、100 μL蛋白沉淀劑甲醇-乙腈（2∶1），渦旋混勻10 s，冰水浴中超聲提取10 min，4 ℃、12 000 r/min、10 min，揮干，加入50 μL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 g/L），渦旋混勻，70 ℃肟化1 h，冷卻15 min，加入50 μL雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［BSTFA，含1%三甲基氯硅烷（TMCS）］衍生試劑和正乙烷，渦旋震蕩，70 ℃ 60 min。室溫放置30 min，取上清液移入進樣瓶。7890A-5975C型GC-MS氣質聯(lián)用儀進行代謝組學檢測。

4　統(tǒng)計學處理

通過ChromaTOF軟件處理GC-MS數(shù)據(jù)，初步篩選得到314個代謝物。將代謝物數(shù)據(jù)矩陣導入SIMCA-P14.1軟件，采用主成分分析（principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis， OPLS-DA）評估各樣本的總體分布以及ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h分別與normal相比的代謝組學總體差異，并進行置換檢驗來判斷模型的擬合程度；以差異倍數(shù)（fold change， FC）>2或FC<0.66，<0.05，變量投影重要性值（variable importance in the projection， VIP）>1的標準篩選差異代謝物，將代謝數(shù)據(jù)導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行檢驗、火山圖、熱圖分析，并利用KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫分析相關代謝通路。計量資料采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。以<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　一般資料比較

連續(xù)監(jiān)測各時間點家兔的體溫、心率和平均動脈壓（mean arterial blood pressure， MAP），與normal組相比，ROSC后15 min、3 h和6 h家兔體溫無明顯變化（>0.05），而ROSC后24 h體溫略有升高（<0.05），CA后7 min心率和MAP均為0，與normal組相比，ROSC后15 min心率無明顯變化（>0.05），3、6和24 h后心率加快（<0.05）；ROSC后15 min、3 h和6 h時血壓呈下降趨勢（<0.05），ROSC后24 h血壓與normal組相比無明顯差異（>0.05），見表1。

表1　心臟停搏家兔模型各時間點體溫、心率、平均動脈壓情況

ROSC： return of spontaneous circulation.*<0.05normal group.

2　ROSC后CA家兔血清代謝輪廓的動態(tài)變化

首先對各個時點的家兔血清代謝物數(shù)據(jù)進行PCA，結果如圖2A所示：與normal組相比，CA家兔ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h樣本的代謝輪廓改變明顯，且呈時間相關的動態(tài)變化趨勢。OPLS-DA也得到同樣結果，見圖2B。對模型有效性進行200次置換檢驗，R2=0.453，Q2=-0.413，說明OPLS-DA模型可靠，不存在過擬合現(xiàn)象，見圖2C。

CA家兔ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h分別與normal組進行兩兩比較分析，PCA結果顯示，與normal組相比，ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h樣本的輪廓差異顯著（圖2D），OPLS-DA進一步證明ROSC后各個時點樣本的代謝輪廓發(fā)生明顯變化（圖2E），且OPLS-DA分析模型不存在過擬合（圖2F）。

Figure 2.Analysis of serum metabolite profiles after return of spontaneous circulation （ROSC） in cardiac arrest rabbits. A， B and C： PCA （A）， OPLS-DA （B） and permutation analysis （C） of serum metabolic characteristics at different time points； D and E： PCA （D）， OPLS-DA （E） and permutation analysis （F） of serum metabolic characteristics between normal， and 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after ROSC.

3　CA家兔血清差異代謝產物的動態(tài)改變

采用MetaboAnalyst 5.0軟件平臺，按照FC>2且<0.05的標準，篩選ROSC后不同時點血清差異代謝物。結果如圖3、表2所示：與normal組相比，ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h的差異代謝物分別有50、44、58和78個；有15種代謝物同時存在于ROSC后各時點組，其中山梨糖、賴氨酸、乙醇胺、2'-脫氧胞苷-5'-三磷酸和腐胺含量在4個時點均減少（<0.05），莽草酸、磷酸絲氨酸、N-甲基-L-谷氨酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇（香草醇）、塔格糖、氨基丙二酸、乳果糖、吲哚-3-乙酸、景天庚酮糖和肌酸含量在4個時點均增加（<0.05）；牛磺酸含量在ROSC后15 min、6 h和24 h減少（<0.05），但在ROSC后3 h含量與normal組差異無統(tǒng)計學意義（>0.05）。

Figure 3.Volcano analysis of serum metabolic characteristics in cardiac arrest rabbtis at 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after return of spontaneous circulation （ROSC） compared with normal.

表2　心臟停搏家兔ROSC后血清中主要差異代謝產物

“/”：>0.05.

4　差異代謝物聚類熱圖分析

為了更加直觀體現(xiàn)出不同時間點家兔血清代謝物的差異性和聚類程度，根據(jù)各對比組前50位VIP值的代謝物進行聚類熱圖分析。由圖4可知各組樣本均呈現(xiàn)出較為明顯的聚類。

Figure 4.Heatmap analysis of serum metabolic characteristics between each time point， or at 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after return of spontaneous circulation （ROSC） compared with normal.

5　代謝通路途徑分析

將不同時點的血清差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0軟件中進行KEGG代謝通路分析。根據(jù)Impact>0.1篩選出改變顯著的代謝通路，結果如圖5所示。與normal組相比，ROSC后15 min、3 h、6 h和24 h分別有8、8、12和15條差異代謝通路，其中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成均下調，精氨酸和脯氨酸代謝在15 min和3 h時下調，而在6 h和24 h時上調。磷酸戊糖途徑在ROSC后15 min時受到抑制，但是在其他時點卻無差異。?；撬岷痛闻；撬岽x在ROSC后15 min、6 h和24 h均被抑制，且影響權重較大。

Figure 5.The KEGG pathway analysis of serum metabolic characteristics in cardiac arrest rabbits at 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after return of spontaneous circulation （ROSC） compared with normal.

討論

CA是急危重癥時較常見的嚴重不良事件。在我國，每年發(fā)生心源性猝死的患者高達41.8/10萬［5］。CA患者ROSC后出現(xiàn)的病理損害過程主要包括全身缺血再灌注損傷、腦組織損傷、心肌功能障礙和持續(xù)致病性病因與誘因等四個方面，被稱為CA后綜合征［6］。炎癥反應、氧化應激和代謝紊亂是CA致多器官功能障礙的重要原因，也是影響CA患者預后的關鍵因素。代謝組學是對被干擾或刺激的生物系統(tǒng)的觀察，是對生物體代謝物變化的研究，能系統(tǒng)全面地反映生物體的代謝特征，從整體層面探討生命活動的代謝特征和規(guī)律［7］。通過對CA家兔血清代謝組學的研究發(fā)現(xiàn)，與心臟聚停前相比，CA家兔ROSC后各個時點的血清代謝輪廓特征存在差異，經KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、?；撬岷痛闻；撬岽x等途徑發(fā)生明顯改變。

CA和ROSC后的患者經歷了嚴重的全身缺血再灌注損傷，氧化應激始終貫穿于這一病理生理進程中，被認為是導致CA患者死亡的重要原因。活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產生和清除失衡，引發(fā)級聯(lián)放大的氧化應激反應，對組織細胞造成損傷，最終出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征甚至死亡［8］。磷酸戊糖途徑是在生物界中普遍存在的糖分解代謝途徑之一，參與NADPH的產生［9］，葡萄糖6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的限速酶。有研究顯示葡萄糖6-磷酸脫氫酶對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能是通過增強磷酸戊糖途徑，提高NADPH水平，使其抑制ROS，從而抑制神經細胞死亡［10］。本研究結果顯示磷酸戊糖途徑在ROSC后15 min時變化較大，受到抑制，提示CA患者ROSC過程的早期嚴重的氧化應激損傷。

牛磺酸是一種游離的含硫β-氨基酸亞磺酸類似物，在細胞內含量較高且非常穩(wěn)定，參與滲透平衡的調控［11］。Ca2+過度累積對心臟有細胞毒性，有研究證實牛磺酸可通過其抗氧化活性和調控細胞內Ca2+水平減輕缺血再灌注損傷［12-13］。?；撬嵩谌毖俟嘧⑵陂g通過調節(jié)細胞內Ca2＋移動、清除自由基、調節(jié)滲透壓保持膜穩(wěn)定性來發(fā)揮其巨大的抗氧化活性［14-15］。在離體大鼠心臟再灌注損傷的研究中，?；撬峥蓽p輕氧化損傷、改善心室功能和減少梗死面積［16］。此外，?；撬徇€可以促進胚胎大腦的神經發(fā)育，被證實對大腦灰質和白質、對局灶性腦缺血-再灌注損傷具有保護作用［17］，其在腦缺血損傷中的作用越來越受到重視。本研究中，與normal組相比，在ROSC后24 h內的家兔血清中，?；撬岷匡@著降低，提示增加?；撬釘z入有望減輕CA致心肌細胞損傷。

心肌是高能量需求的器官。CA患者ROSC過程中缺血缺氧再灌注造成的能量代謝紊亂，致使心肌功能障礙。肌酸主要以磷酸肌酸（creatine phosphate， PCr）形式存在，負責能量的緩沖和運輸，在肌酸激酶控制下與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）可相互轉換Cr+ATP?PCr+ADP+H+［18，19］。在心肌缺血時，氧不足以支持通過氧化磷酸化產生ATP，PCr和ATP水平會在幾分鐘內迅速耗盡，出現(xiàn)能量危機致心肌細胞受損［20-21］。本研究中，與normal組相比，血清中肌酸水平在CA家兔ROSC后不同時點顯著上調，尤其是在ROSC后15min上調10.61倍，提示在CA家兔ROSC過程中，ATP耗竭和能量代謝障礙。在CA導致缺血再灌注過程中，氧供應的先中斷后恢復不僅通過電子傳遞鏈（electron transport chain， ETC）削弱ATP的產生，而且它還促進電子從ETC泄漏，導致高度破壞性的ROS形成，ROS可引起嚴重氧化應激損傷，從而導致氧化還原穩(wěn)態(tài)喪失和心肌細胞死亡［22］，提示CA所致的能量代謝障礙，誘發(fā)氧化應激反應，致使心肌組織功能障礙。一項缺血性心肌研究中發(fā)現(xiàn)，外源性PCr可減少細胞內溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺的積累，具有穩(wěn)定心肌細胞膜和保護心肌細胞功能的作用［23］，增加PCr可以減少缺血/再灌注損傷大鼠心肌組織的炎癥反應，從而改善心肌功能［24］，提示PCr可能是改善CA患者預后的有效治療靶點。

綜上所述，CA家兔ROSC后的血清代謝組學存在顯著動態(tài)差異，磷酸戊糖途徑和血清代謝物?；撬嵬ㄟ^調控氧化應激反應介導CA家兔ROSC后心臟功能的保護作用；肌酸水平上調提示心肌細胞損傷。

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Serum metabolomic characteristics of rabbits with return of spontaneous circulation after cardiac arrest

LIANG Ming-yu1， FENG Yang1， LIU Ya-rong1， LI Shu-tong1， OUYANG Jie-lin1， CHEN Fang2， ZHU Yi-min2， ZOU Lian-hong1，2△， JIANG Yu2△

（1，，410013，；2，，410005，）

To investigate and analyze the dynamic changes of serum metabolomic characteristics in cardiac arrest （CA） rabbit model with return of spontaneous circulation （ROSC）.The rabbit model of CA was induced by asphyxiation. Blood samples were collected at different time points including before CA， or 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after ROSC. The metabolites in serum were determined by gas chromatography-mass spectrometer （GC-MS）. Simca P software was used to analyze the serum metabolic profile characteristics by principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discrimination analysis （OPLS-DA）. T-test， volcano plot， cluster heat map analysis and KEGG of MetaboAnalyst 5.0 software were used to analyze the differential metabolites and metabolic pathways.Compared with normal group， the characteristics of serum metabolic profiles at 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after ROSC were significantly changed. There were 50， 44， 58 and 78 differential metabolites at these four time points. Concentrations of sorbose， lysine， ethanolamine， 2'-deoxycytidine 5'-triphosphate and putrescine were down-regulated （<0.05）， while shikimic acid，-phosphoserine，-methyl-L-glutamic acid， 4-hydroxy-3-methoxybenzyl alcohol， tagatose， aminomalonic acid， lactulose， indole-3-acetic acid， sedoheptulose and creatine were up-regulated （<0.05）. Taurine was decreased at 15 min， 6 h and 24 h after ROSC （<0.05）， and was recovered at 3 h after ROSC. Compared with normal group， 8， 8， 12 and 15 differential metabolic pathways were captured at 15 min， 3 h， 6 h and 24 h after ROSC， respectively. The biosynthesis of phenylalanine， tyrosine and tryptophan was down-regulated after ROSC. The metabolism of arginine and proline was down-regulated at 15 min and 3 h after ROSC， while it was up-regulated at 6 and 24 h after ROSC. Pentose phosphate pathway was inhibited at 15 min after ROSC， but there was no difference at other time points.Significant dynamic differences in serum metabolomics were observed after ROSC in CA rabbit model. Restricted pentose phosphate pathway and decreased taurine may be caused by the injury after ROSC. Increased creatine indicates myocardial cell injury.

Cardiac arrest； Return of spontaneous circulation； Metabonomics

R363； R446

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.007

1000-4718（2022）03-0434-08

2022-01-06

2022-02-22

［基金項目］湖南省重大專項（No. 2020SK1010）

Tel： 0731-83929129； E-mail： zoulh1986@hunnu.edu.cn（鄒聯(lián)洪）； jiangyu@hunnu.edu.cn（蔣宇）

（責任編輯：盧萍，余小慧）