丁林， 李萌陽， 王夢宇， 法鴻鴿， 房芯羽， 王建勛

環(huán)狀RNA Lrp6調(diào)控過氧化氫誘導的H9c2心肌細胞凋亡*

丁林， 李萌陽， 王夢宇， 法鴻鴿， 房芯羽， 王建勛△

（青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266021）

探究環(huán)狀RNA Lrp6（circLrp6）對過氧化氫（H2O2）誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響。通過Sanger測序和RNase R酶切驗證circLrp6的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；細胞熒光原位雜交分析circLrp6的亞細胞定位；通過RT-qPCR檢測H2O2處理的H9c2細胞和缺血再灌注損傷的小鼠心臟組織中circLrp6的差異表達水平；采用TUNEL染色檢測circLrp6是否影響H2O2誘導的心肌細胞凋亡水平；通過生物信息學的方法預測與circLrp6相互結(jié)合的下游靶點及其結(jié)合位點。circLrp6具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，定位于細胞核，它在H2O2處理后的H9c2心肌細胞和缺血再灌注的心臟組織中表達水平下調(diào)（<0.05），過表達circLrp6對H2O2處理的心肌細胞具有保護作用，表現(xiàn)為TUNEL染色陽性率下降（<0.05）。另外，circLrp6具有結(jié)合miRNA和蛋白質(zhì)的潛能。circLrp6對H2O2誘導的心肌細胞凋亡具有抑制作用。

環(huán)狀RNA Lrp6；心肌細胞；過氧化氫；細胞凋亡

近年來，以冠心病為代表的缺血性心臟病已成為全球主要的死亡原因之一，嚴重威脅著人類的生命健康。研究表明，由于機體內(nèi)異常的脂質(zhì)代謝而引起的冠狀動脈粥樣硬化是誘發(fā)冠心病的主要原因。血液中的脂質(zhì)附著在動脈壁上會引起血管閉塞，血流受阻，嚴重時會引起心肌缺血，危及生命［1］。盡管臨床上經(jīng)皮冠狀動脈介入聯(lián)合藥物恢復血流灌注的治療方法已逐漸成熟，但急性冠狀動脈綜合征的死亡率仍然很高。這是由于心肌缺血后再灌注會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species， ROS），造成缺血再灌注損傷，最終導致心律失常、心功能障礙和梗死后心臟重構(gòu)［2-3］。細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細胞的死亡方式之一［4］。目前，調(diào)控該過程的分子機制尚未完全闡明。因此，深入研究調(diào)控心肌細胞凋亡的分子機制將對治療缺血再灌注損傷和冠心病具有重要的意義。

環(huán)狀RNA（circular RNAs， circRNAs）是一類由前體mRNA（pre-mRNA）通過反向剪接而形成的共價閉合的單鏈環(huán)狀非編碼RNA，它在真核生物中含量豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、進化保守，通常以組織特異性的方式表達，在心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［5-6］。近年來，研究者利用新一代高通量測序技術(shù)在心臟中鑒定出大量的circRNA，其中一部分在心肌細胞中高表達的circRNA已被證明在極大程度上能決定心肌細胞的命運，調(diào)控心肌細胞的增殖、衰老和死亡等過程［7］。例如心肌梗死的成年小鼠在缺失由超級增強子調(diào)控的circNfix后，可促進心肌細胞增殖和血管生成，抑制心肌細胞凋亡，減輕預后不良［8］。在老年人和老年鼠中高表達的circFoxo3與細胞衰老有關，沉默內(nèi)源性的能抑制細胞衰老，緩解阿霉素誘導的心肌?。?］。抑制小鼠心臟中高表達的circNCX1（又稱circSLC8A1）可減弱缺血性心肌損傷、心肌肥厚和阿霉素誘導的心肌毒性［10-12］。circRNA_001131通過結(jié)合微小RNA-25-3p（microRNA-25-3p， miR-25-3p）抑制心肌成纖維細胞中纖維化相關基因的表達［13］。然而，還有很多高表達于心臟的circRNA，其功能和作用機制尚不清楚，值得我們進一步探索。

根據(jù)Werfel等［14］的測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)一個在人類、小鼠和大鼠心臟中都高度保守且高表達的circRNA，命名為circLrp6。circLrp6可在多種癌癥發(fā)生中發(fā)揮致癌作用，促進細胞增殖和侵襲，抑制細胞凋亡［15-18］，但其在心臟中是否發(fā)揮功能尚不清楚。因此，本研究旨在探討circLrp6對過氧化氫（hydrogen peroxide， H2O2）誘導的心肌細胞凋亡的影響。

材料和方法

1　實驗動物及分組

將8周齡的C57BL/6J雄性小鼠［許可證號為SCXK（魯）2019-0003］隨機分為兩組：實驗組小鼠結(jié)扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending， LAD）30 min，再灌注3 h；假手術(shù)組小鼠只穿線不結(jié)扎。所有動物實驗均得到青島大學醫(yī)學部倫理委員會的批準。

2　細胞、主要試劑和儀器

大鼠心肌細胞系H9c2購于上海生命科學研究院。DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（北京全式金）；0.25%胰蛋白酶（武漢賽維爾）；30% H2O2（國藥）；Trizol試劑（Invitrogen）；反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒（南京諾唯贊）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（Invitrogen）；RNase R（Invitrogen）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海翌圣）；熒光原位雜交（fluorescencehybridization， FISH）試劑盒（上海吉瑪）；引物和熒光探針由深圳華大基因和北京擎科生物公司合成；circLrp6的siRNA和過表達質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。倒置熒光顯微鏡（Olympus）；倒置雙光子激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica）；實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher）。

3　主要方法

3.1細胞培養(yǎng)和處理H9c2細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化再傳代，使用100 μmol/L H2O2對細胞進行處理。

3.2細胞轉(zhuǎn)染委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建circLrp6過表達質(zhì)粒并合成用于特異性沉默的小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）和陰性對照（negative control， NC）序列。siRNA序列為5'-AUCAAGUGGCGGCCCCUUUTT-3'和5'-AAAGGGGCCGCCACUUGAUTT-3'；NC序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。然后，按照Lipofectamine 3000說明書的操作步驟轉(zhuǎn)染質(zhì)粒或siRNA。

3.3RT-qPCR按照Trizol試劑說明書的步驟提取心肌細胞和心臟組織中的總RNA；利用NanoDrop分光光度計測定RNA的濃度與純度；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行qPCR；使用2-ΔΔCt公式計算相對表達量，相應引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

F： forward； R： reverse.

3.4circRNA成環(huán)驗證（1）反向PCR擴增：分別提取H9c2細胞中的基因組DNA（gDNA）和總RNA，并將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設計并合成用于擴增circLrp6的收斂引物和發(fā)散引物，以gDNA和cDNA為模板，用兩種不同的引物進行PCR擴增。收斂引物的正向序列為5'-TGTAGTTGGAGGCTTGGAGGAT-3'，反向序列為5'-CACTTGATGGATCTAAGGCAATAGC-3'；發(fā)散引物的正向序列為5'-GGTCATGGCTTGATATACTGGAGTG-3'，反向序列為5'-CCAACTACAATCGTCGCATTCTCT-3'。對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將反向擴增產(chǎn)物進行Sanger測序。（2）RNase R耐受實驗：每組5 μg總RNA，對照組不加RNase R，實驗組加15 U RNase R，37 ℃金屬浴孵育10～15 min。之后用Trizol試劑按照說明書從反應體系中純化RNA，再進行RT-qPCR。

3.5FISH檢測在24孔板中，將H9c2細胞接種在1 cm×1 cm的玻片上，當細胞密度為70%左右，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，用4%的多聚甲醛固定。然后，按照FISH試劑盒的說明書進行實驗，最后用含DAPI染液的封片劑固定。用倒置雙光子激光共聚焦掃描顯微鏡對染好的玻片進行拍照。熒光探針序列為5'-FAM-AGCAACAAAGGGGCCGCCACTTGATGGATCT-3'。

3.6TUNEL細胞凋亡檢測在24孔板中，將H9c2細胞接種在1 cm×1 cm的玻片上。然后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，用4%的多聚甲醛對已處理的細胞室溫固定15 min。按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行實驗，最后用含DAPI染液的封片劑封片固定。使用倒置熒光顯微鏡對染好的玻片進行觀察拍照，計算TUNEL陽性細胞核占總細胞核的比例，得出細胞凋亡率。

4　統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)都用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用Tukey檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　circLrp6是一個在心肌細胞中高表達的保守circRNA

首先，分析Werfel等［14］的測序結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了一個來源于基因2號外顯子、剪接后成熟序列長度為394 nt的circRNA，它在人類、大鼠和小鼠的心臟中都高表達且保守性高，將其命名為circLrp6（圖1A）。使用circLrp6的收斂引物和發(fā)散引物，以H9c2的cDNA和gDNA為模板進行擴增，收斂引物可將cDNA和gDNA擴增出條帶，而發(fā)散引物只能將cDNA擴增出條帶（圖1B）。Sanger測序結(jié)果顯示，反向擴增產(chǎn)物的序列與公開的circLrp6序列相一致且5'和3'末端相連（圖1C）。結(jié)合PCR結(jié)果可知，circLrp6序列末端相連來源于反向剪切，并非基因組重排。由于circRNA沒有末端，所以circLrp6相比于線性的GAPDH和Lrp6更耐受核酸外切酶RNase R的消化，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定（<0.05），見圖1D。我們還檢測了新生大鼠心肌細胞和成纖維細胞中circLrp6的表達豐度。與成纖維細胞相比，circLrp6在心肌細胞中表達豐度更高（<0.05），見圖1E。FISH檢測結(jié)果證明，circLrp6主要定位于細胞核中（圖1F）。因此，circLrp6是一個在心肌細胞中高表達且進化保守的circRNA。

Figure 1.circLrp6 is a conserved cardiac circRNA. A： sequence analysis of phyloP showed that circLrp6 is conserved. B： circLrp6 was a back-splicing formed loop. It was amplified from the cDNA of H9c2 cells by divergent primers， while it could not be amplified from gDNA. C： circLrp6 was generated from the 2nd exon of the Lrp6 gene， and the back-splice junction of circLrp6 was identified by Sanger sequencing. D： total RNA extracted from H9c2 cells was incubated with or without RNase R. RT-qPCR showed the disappearance of GAPDH and linear Lrp6 by RNase R treatment， whereas circLrp6 was not affected. E： relative expression level of circLrp6 in cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. F： subcellular localization of circLrp6 was identified by fluorescence in situ hybridization （FISH）. Green： circLrp6 probes were labeled with FITC； blue： nuclei were stained with DAPI. Scale bar=20 μm. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs mock； #P<0.05 vs cardiomyocyte.

2　circLrp6在凋亡的心肌細胞中表達水平降低

心臟缺血再灌注后，過度釋放的ROS會造成心肌細胞損傷和死亡。有研究報道，100 μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞可體外模擬缺血再灌注損傷［19］。為了探究circLrp6是否與心肌細胞凋亡相關，我們用100 μmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞0、1、3、6和12 h后，檢測circLrp6的表達量變化，結(jié)果顯示H9c2細胞中circLrp6的表達量在H2O2處理后持續(xù)下降（<0.05），見圖2A。我們進一步檢測了circLrp6在小鼠心肌缺血再灌模型中的表達，與體外處理結(jié)果一致，較于對照組來說，小鼠心肌缺血再灌后circLrp6表達量減少（<0.05），見圖2B。綜上所述，circLrp6在凋亡的心肌細胞和缺血再灌注損傷的心肌中表達水平降低，提示circLrp6可能在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。

Figure 2.The expression level of circLrp6 decreased in apoptotic cardiomyocytes. A： the expression level of circLrp6 in H9c2 cells with 100 μmol/L H2O2 treatment for indicated times； B： RT-qPCR assay of cardiac circLrp6 in the ischemic zone adjacent to the infarction region of rat hearts； C and D： the expression levels of circLrp6 （C） and Lrp6 mRNA （D） in H9c2 cells transfected with circLrp6 siRNA （si-circLrp6） were detected； E and F： the expression levels of circLrp6 （E） and Lrp6 mRNA （F） in H9c2 cells transfected with circLrp6 overexpression vector （OE-circLrp6） were detected. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 h group； #P<0.05 vs sham group； ▲P<0.05 vs negative control （NC） or empty vector （EV）.

3　circLrp6對心肌細胞凋亡具有抑制作用

為了檢測circLrp6在心肌細胞凋亡過程中發(fā)揮的功能，我們合成了針對的特異性siRNA和過表達質(zhì)粒。首先，我們證明了siRNA和過表達載體分別能在H9c2細胞中顯著敲減和過表達（<0.05），見圖2C、D，并對線性Lrp6 mRNA的表達量沒有影響（圖2E、F）。在此基礎上，我們用50 μmol/L H2O2誘導細胞凋亡，通過TUNEL染色檢測心肌細胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，敲減可促進H2O2誘導的心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL染色陽性率升高（<0.05），見圖3A。而過表達可抑制100 μmol/L H2O2誘導的心肌細胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL染色陽性率降低（<0.05），見圖3B。綜上所述，circLrp6可顯著抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡。

Figure 3.circLrp6 inhibited hydrogen peroxide （H2O2）-induced cardiomyocyte apoptosis in vitro. A： H9c2 cells transfected with circLrp6 siRNA （si-circLrp6） were treated with 50 μmol/L H2O2 for 12 h； B： H9c2 cells transfected with circLrp6 overexpression vector （OE-circLrp6） were treated with 100 μmol/L H2O2 for 12 h. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control （NC） or empty vector （EV）.

4　circLrp6具有結(jié)合miRNA和蛋白的潛能

通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-330-5p和miR-326具有與circLrp6相互作用的潛能。CircInteractome數(shù)據(jù)庫［20］預測結(jié)果顯示，miR-330-5p與circLrp6有1個潛在的結(jié)合位點，miR-326與circLrp6有2個潛在的結(jié)合位點（圖4A）。另外，我們在CircInteractome、catRAPID［21］和RBPsuite［22］數(shù)據(jù)庫中分別預測可以與circLrp6相互結(jié)合的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)EIF4A3和LIN28A在3個數(shù)據(jù)庫中都被預測為能與circLrp6結(jié)合的蛋白（圖4B），結(jié)合位點如表2所示。綜上所述，circLrp6具有與miRNA和蛋白結(jié)合的潛力。

Figure 4.The potential miRNAs and proteins interacting with circLrp6. A： the putative binding sites between circLrp6 and miR-330-5p or miR-326； B： Venn diagram revealing the overlap of the potential targeted proteins interacting with circLrp6 from CircInteractome， catRAPID and RBPsuite datasets.

表2　預測的與circLrp6結(jié)合的蛋白質(zhì)及其結(jié)合位點

討論

臨床上，治療冠心病主要采用抗血栓藥物、經(jīng)皮冠狀動脈介入、搭橋手術(shù)等方法對閉塞動脈進行血運重建。然而，這些治療只能降低冠心病的嚴重程度，并不能恢復梗死心臟的收縮能力；同時，缺血后的再灌注導致了嚴重的心功能障礙［2］。所以，尋找抑制心肌細胞死亡或刺激心臟再生的新型治療策略對臨床上治療冠心病具有深遠的意義。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與心血管疾病的調(diào)控，具有作為血清診斷標志物和治療藥物的潛力。例如，一項由642名急性心肌梗死患者參與的研究發(fā)現(xiàn)circRNA MICRA是左心室功能障礙的一個強有力的預測因子，MICRA表達量低的患者發(fā)生左心室功能障礙的風險較高［23］；另一項研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_0124644是一種預測冠心病的潛在生物標志物［24］。線粒體分裂和凋亡相關的circRNA MFACR通過結(jié)合miR-652-3p抑制基因的翻譯，進而抑制線粒體分裂和細胞凋亡，最終抑制心肌梗死［25］。心肌纖維化是心肌肥大的重要病理特征，過表達circYAP可促進TMP4和ACTG相互結(jié)合，抑制微絲聚集，進而抑制纖維化的發(fā)生［26］。也有研究報道circPan3和circITCH參與調(diào)控阿霉素誘導的心肌毒性［27-28］。

本研究發(fā)現(xiàn)的circLrp6是一種來源于基因2號外顯子、長度為394 nt的circRNA，它在心肌細胞中高表達且定位于細胞核。通過構(gòu)建H2O2誘導的心肌細胞凋亡和小鼠心肌缺血再灌模型，發(fā)現(xiàn)circLrp6在凋亡發(fā)生后呈現(xiàn)時間依賴性下降。過表達和敲減H9c2細胞中的會對H2O2誘導的心肌細胞凋亡產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為敲減可促進H2O2誘導的心肌細胞凋亡，而過表達可抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡。

已有研究報道circLrp6在前列腺癌細胞和組織中高表達，通過競爭性結(jié)合miR-330-5p而抑制NRBP1的降解，最終促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲，敲減可促進癌細胞凋亡，抑制癌癥的發(fā)生［18］。另外，miR-330-5p在心血管疾病中也發(fā)揮重要的作用，沉默miR-330-5p可抑制阿霉素誘導的心肌毒性［28］。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-326通過靶向MDK和抑制JAK/STAT和MAPK信號通路抑制心肌肥厚［29］，還可以靶向Wnt1顯著增強內(nèi)皮祖細胞的血管生成能力［30］。除此之外，內(nèi)源性真核起始因子4A-III對維持體內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性［31］和缺氧誘導的H9c2細胞損傷都有影響［32］。LIN28A對糖尿病心肌病、缺血再灌注損傷和心肌肥大等多種心臟疾病具有調(diào)控作用［33-35］。這些預測的下游靶點都已經(jīng)被證明在心血管疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，它們能否作為circLrp6的下游調(diào)控靶點在心肌缺血再灌注過程中影響心肌細胞凋亡將是我們下一步研究的方向。

我們首次研究了circLrp6在心血管疾病中的作用，證明circLrp6具有抑制心肌細胞凋亡的作用，通過生物信息手段預測到circLrp6可能通過與miRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合而影響心肌細胞凋亡。circLrp6定位于細胞核中，這表明circLrp6可能通過調(diào)控DNA復制、基因轉(zhuǎn)錄等發(fā)生于細胞核的生物學過程影響細胞死亡，具體機制我們將在后續(xù)工作中進行探索和驗證，此外，circLrp6是否參與壞死、鐵死亡或焦亡等其他細胞死亡的調(diào)控，是否在心肌肥厚、心肌毒性、心律失常等其他心血管疾病中也發(fā)揮作用都值得進一步研究。

綜上所述，本研究表明circLrp6在H2O2誘導心肌細胞凋亡和小鼠心肌缺血再灌模型中表達明顯下降，過表達circLrp6可抑制心肌細胞凋亡。

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Circular RNA Lrp6 regulates H2O2-induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes

DING Lin， LI Meng-yang， WANG Meng-yu， FA Hong-ge， FANG Xin-yu， WANG Jian-xun△

（，，266021，）

To investigate the effect of circular RNA Lrp6 （circLrp6） on hydrogen peroxide （H2O2）-induced cardiomyocyte apoptosis.The circular structure of circLrp6 was verified by Sanger sequencing and RNase R digestion. The subcellular localization of circLrp6 was detected by fluorescencehybridization （FISH）. RT-qPCR was used to detect whether H2O2and myocardial ischemia-reperfusion influenced the expression of circLrp6 in cardiomyocytes. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes. The downstream targets and binding sites of circLrp6 were predicted by bioinformatic methods.Circularly structural circLrp6 was localized in the nucleus. circLrp6 was down-regulated after treated with H2O2in H9c2 cells （<0.05）. The expression of circLrp6 was also decreased in cardiac tissues of the mice with myocardial ischemia-reperfusion. TUNEL staining showed that overexpression of circLrp6 attenuated the apoptosis of H9c2 cells induced by H2O2. In addition， circLrp6 has the potential to combine with miRNA and protein.circLrp6 inhibits H2O2-induced cardiomyocyte apoptosis.

Circular RNA Lrp6； Cardiomyocytes； Hydrogen peroxide； Apoptosis

R363.2； R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.004

1000-4718（2022）03-0412-08

2021-12-04

2022-01-24

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 81900259）

Tel： 0532-83780070； E-mail： wangjx@qdu.edu.cn

（責任編輯：盧萍，羅森）