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        機械力敏感離子通道Piezo1參與高血壓誘導(dǎo)心房纖維化的機制研究*

        2022-03-28 02:21:20劉慧意饒芳葉興東金書羽付路鄧春玉楊慧鄺素娟吳書林薛玉梅
        中國病理生理雜志 2022年3期
        關(guān)鍵詞:靜水壓離子通道纖維細(xì)胞

        劉慧意, 饒芳, 葉興東, 金書羽,2, 付路, 鄧春玉,楊慧, 鄺素娟, 吳書林, 薛玉梅△

        機械力敏感離子通道Piezo1參與高血壓誘導(dǎo)心房纖維化的機制研究*

        劉慧意1, 饒芳1, 葉興東1, 金書羽1,2, 付路1, 鄧春玉1,楊慧1, 鄺素娟1, 吳書林1, 薛玉梅1△

        (1廣東省心血管病研究所心內(nèi)科,廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣東 廣州 510080;2南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510515)

        利用小鼠心房成纖維細(xì)胞探討機械敏感離子通道Piezo1在調(diào)控高血壓所致心房纖維化,進而導(dǎo)致房顫中的作用及可能機制。采用酶消化法分離培養(yǎng)6~8周齡雄性C57BL/6小鼠的原代心房成纖維細(xì)胞,并采用課題組自制的加壓裝置(專利號201420109263.1)建立高血壓模型,Western blot比較不同靜水壓(0、20和40 mmHg)干預(yù)下細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)I/III型膠原蛋白α1鏈(Col1A1/3A1)和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP-2/9)蛋白表達水平。高靜水壓(40 mmHg)干預(yù)下的心房成纖維細(xì)胞,分別給予不同濃度(1、3和 10 μmol/L)的Piezo1抑制劑GsMTx4,或轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒降低Piezo1的表達,以及不同濃度(5和10 μmol/L)的Src抑制劑PP1,觀察細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。常壓下給予不同濃度(1、3和10 μmol/L)的Piezo1特異性激動劑Yoda1,觀察心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。隨著壓力升高,小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白表達水平顯著升高(<0.05);GsMTx4/siRNA或PP1處理后,可使高靜水壓導(dǎo)致的Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平下降(<0.05)。而細(xì)胞給予Piezo1特異性激動劑Yoda1可模擬出高靜水壓干預(yù)的結(jié)果(<0.05)。在小鼠心房成纖維細(xì)胞中,機械敏感通道蛋白Piezo1可能通過調(diào)控Src/p-Src參與高血壓所致的心房纖維化。

        Piezo1蛋白;高血壓;心房成纖維細(xì)胞;心房顫動

        心房顫動(房顫)是臨床中常見的心律失常之一,我國總體發(fā)病率高達1.14%[1]。房顫危害嚴(yán)重,可引起腦卒中、充血性心力衰竭,甚至危及生命。高血壓是心房顫動最常見的危險因素。高血壓合并房顫時可顯著增加不良事件風(fēng)險,包括腦卒中、心血管事件、全因死亡風(fēng)險等[2]。然而,高血壓促進房顫形成機制仍不明確。

        長期高血壓狀態(tài)使左心室后負(fù)荷增加,左心房長期被動牽拉導(dǎo)致其內(nèi)徑增大、順應(yīng)性增加及收縮力下降,且這種生物力學(xué)牽拉能直接誘導(dǎo)心房纖維化的產(chǎn)生以及引起離子通道電流改變,成為房顫發(fā)生的基礎(chǔ)[3]。但目前關(guān)于高血壓導(dǎo)致心房纖維化,進而導(dǎo)致房顫的具體分子機制仍不明確。

        新型離子通道Piezo1是近年來鑒定出的哺乳動物的機械門控離子通道,主要在暴露于流體壓力的非感覺組織中表達,廣泛參與血管發(fā)育、動脈重塑和血壓調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和紅細(xì)胞體積調(diào)節(jié)等病理生理過程[4-5]。研究表明,Piezo1在小動脈平滑肌細(xì)胞中表達并可被拉伸力激活,通過上調(diào)細(xì)胞中Ca2+濃度,升高交聯(lián)酶活性,調(diào)節(jié)高血壓時小動脈的直徑和壁厚,影響小動脈血管結(jié)構(gòu)重塑[6]。此外,Piezo1在心肌梗死心衰大鼠心臟中表達增加,并可被血管緊張素受體阻滯劑氯沙坦所抑制;體外予以血管緊張素II刺激新生大鼠心室肌細(xì)胞可通過AT1受體依賴性途徑上調(diào)Piezo1表達[7]。但高血壓導(dǎo)致心房壓力增加時,Piezo1是否參與心房纖維化尚未見報道。

        此外,編碼膜相關(guān)的酪氨酸激酶,參與細(xì)胞生長和分化。近年來的研究表明,在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型和氯化鈷處理的L929細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞)中,新型肽類Src抑制劑KX-01顯著抑制p-Src,降低α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和膠原的表達[8]。我們的前期研究提示Src參與了高靜水壓下心房肌細(xì)胞的Ca,L以及L型鈣通道α1c亞單位(L-type calcium channel α1C,Cav1.2)的表達,促進房顫發(fā)生[9]。然而,在高血壓患者中,心房組織中的Src是否通過調(diào)節(jié)心房纖維化參與房顫的發(fā)病,心房組織中的Piezo1是否通過Src調(diào)節(jié)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)尚不清楚。因此,本研究中,我們擬證實小鼠心房成纖維細(xì)胞膜上的新型離子通道Piezo1,在機械應(yīng)力的作用下激活,激活Src激酶,促進心房纖維化,參與房顫的發(fā)生和維持。

        材料和方法

        1 動物

        6~8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠由廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,20~25 g,共30只,許可證號為SCXK(粵)2013-0034。SPF級Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)各3只,30~35周齡,購自北京維通利華,生產(chǎn)許可證號為SCXKD(京)2016-0006。所有的動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)動物實驗倫理審查(No. 201904010451)。

        2 主要試劑

        Opti-MEM培養(yǎng)液、特級澳洲胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco);成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Lonza);蛋白Marker(Fermentas);4×蛋白上樣緩沖液(Bio-Rad);RIPA裂解液(強)和BCA試劑盒(Beyotime);抗Piezo1抗體(Alomone);抗I型膠原蛋白α1鏈(collagen type I α1 chain, Col1A1)抗體、抗III型膠原蛋白α1鏈(collagen type III α1 chain, Col3A1)抗體和抗基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase-2/9, MMP-2/9)抗體(Abcam);抗GAPDH抗體、抗Src抗體和抗p-Src抗體(Cell Signaling Technology);GsMTx4和Yoda1(MedChemExpress);PP1(Selleck);siRNA和陰性對照(RiboBio);Lipofactamine 3000脂質(zhì)體(Thermo Fisher Scientific)。

        3 主要方法

        3.1原代心房成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6~8周齡的雄性C57BL/6J小鼠,頸椎脫臼處死,75%乙醇消毒小鼠,高壓滅菌后的眼科剪剪開胸腔,取出心臟,剪下左右心耳及心房組織,洗清殘血,剪碎組織至1 mm×1 mm×1 mm大小。無菌巴氏管吸取5 mL 0.25%胰酶至離心管中,輕輕吹打消化約3 min,靜置1 min,將上清轉(zhuǎn)移至含胎牛血清的終止液中,終止消化,如此反復(fù)至組織塊基本消失。將消化所得的混懸液經(jīng)100目過濾網(wǎng)過濾后,410×離心15 min,棄上清,用5 mL 10%培養(yǎng)液重懸后接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后換液。第2~4代細(xì)胞用于實驗。細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞密度達70%~80%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋5 μg質(zhì)粒,輕輕混勻;250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋6 μL Lipofectamine 3000試劑,分別震蕩混勻。然后將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的稀釋液充分混勻,室溫孵育15 min后,加入細(xì)胞中,6 h后換液,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

        3.2Western blot實驗細(xì)胞長至90%時,吸去培養(yǎng)液,PBS洗3次后加入100 μL含蛋白酶抑制劑RIPA裂解液(強),冰上裂解20 min后收集細(xì)胞。4 ℃、13 200×離心15 min,取上清,BCA試劑盒測定蛋白濃度。在20 μg蛋白質(zhì)樣品中加入4×蛋白上樣緩沖液,55 ℃變性10 min。配制10% SDS-PAGE分離蛋白樣品,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST配制5%脫脂牛奶,室溫封閉1 h。TBST洗3次,每次5 min。對應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,每次5 min。Ⅱ抗室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min。配制ECL發(fā)光液,PVDF膜蛋白面朝上均勻滴加ECL發(fā)光液,放入化學(xué)發(fā)光成像儀中自動曝光。

        3.3細(xì)胞免疫熒光染色待細(xì)胞密度長到80%~90%時,棄去培養(yǎng)液,PBS洗3次,每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min后棄去,PBS浸洗3次,每次5 min。0.5% Triton X-100通透15 min后棄去,PBS洗3次,每次5 min。4%牛血清白蛋白封閉30 min,去除封閉液直接滴加稀釋好的Ⅰ抗放入裝有濕棉球的避光盒,4 ℃孵育過夜。第2天取出共聚焦皿,PBS浸洗3次,每次5 min。加入相應(yīng)的熒光Ⅱ抗室溫孵育1 h。PBS浸洗3次,每次5 min。避光滴加DAPI封片劑后在共聚焦顯微鏡下觀察。

        3.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力將小鼠心房成纖維細(xì)胞培養(yǎng)并傳至p2代,分別轉(zhuǎn)染negative control RNA及siRNA,6 h后換液并消化,將細(xì)胞定量至2×107L-1,接種于96孔板中,每組設(shè)5個副孔,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液,空白組加入100 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液,放入高靜水壓培養(yǎng)箱培育。0、12、24、48和72 h時取出細(xì)胞,每孔加入10 μL CCK-8工作液,孵育2 h后在450 nm波長處測定吸光度()。

        4 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較用檢驗;多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-檢驗或SNK-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié)果

        1 原代心房成纖維細(xì)胞的分離與鑒定

        將原代分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞傳代至第2代,接種于共聚焦皿上,免疫熒光法檢測成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA。結(jié)果顯示,第2代細(xì)胞中α-SMA染色呈陽性(圖1),說明從小鼠心房組織分離的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。

        Figure 1.Immunofluorescence image of primary mouse atrial fibroblasts. Blue is the nucleus, and red is α-SMA. The scale bar=100 μm.

        2 Wistar大鼠及SHR左心房組織中Piezo1蛋白表達水平檢測

        基線資料顯示,SHR組收縮壓、平均血壓、舒張壓及心率均顯著高于Wistar組(<0.05),見表1。

        表1 Wistar大鼠和SHR的血壓和心率

        SBP: systolic blood pressure; MBP: mean blood pressure; DBP: diastolic blood pressure.**<0.01Wistar rats.

        Western blot結(jié)果顯示,SHR組左心房組織中的Piezo1表達水平顯著高于Wistar組(<0.01),見圖2。這表明高血壓促進心臟組織Piezo1蛋白表達。

        Figure 2.The protein expression of Piezo1 in left atrial tissue of Wistar and SHR. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs Wistar.

        3 高靜水壓處理對小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1及纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

        借助課題組自行研制的自加壓裝置,將小鼠心房成纖維細(xì)胞置于不同壓力(0、20及40 mmHg)下培養(yǎng)48 h[9],Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達。結(jié)果顯示,隨著壓力升高,機械門控離子通道Piezo1表達水平顯著升高(<0.05);Src表達量稍有升高,但無顯著差異,p-Src蛋白水平在20 mmHg及40 mmHg下均有升高,以20 mmHg組最顯著(<0.01);纖維化相關(guān)蛋白Col1A1/3A1水平隨壓力梯度逐漸升高(<0.05),MMP-2表達量也顯著升高,以20 mmHg升高最為顯著(<0.05),MMP-9表達量在40 mmHg升高最顯著(<0.01),見圖3。

        Figure 3.The protein expression of Piezo1, Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts cultured with different pressure. A and B: representative immunoblots of Piezo1, Src/p-Src, and fibrosis-related factors; C: the level of Piezo1; D: the level of p-Src; E: the level of Src; F: the level of Col1A1; G: the level of Col3A1; H: the level of MMP-2; I: the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05,** P<0.01 vs 0 mmHg group.

        4 GsMTx4對高靜水壓所致的小鼠心房成纖維細(xì)胞Src激活及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達增加的影響

        為了確定Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用,我們在40 mmHg壓力下,以不同濃度(1、3和10 μmol/L)Piezo1抑制劑GsMTx4[9]處理心房成纖維細(xì)胞48 h,Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子表達。結(jié)果顯示,與對照組相比,GsMTx4處理組細(xì)胞中Piezo1和Src/p-Src表達量呈濃度依賴性下降,以高濃度顯著(<0.05),p-Src蛋白水平在3和10μmol/L組均顯著下降(<0.01);GsMTx4亦可明顯逆轉(zhuǎn)高靜水壓所致纖維化指標(biāo)Col1A1、Col3A1及MMP-2/9表達增加(<0.05),見圖4。

        Figure 4.Effects of GsMTx4 on the expression of Piezo1, Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B: representative immunoblots of Piezo1, Src/p-Src, and fibrosis-related factors; C: the level of Piezo1; D: the level of p-Src; E: the level of Src; F: the level of Col1A1; G: the level of Col3A1; H: the level of MMP-2; I: the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group.

        5 敲減Piezo1對高靜水壓下小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化蛋白表達及細(xì)胞活力的影響

        為了進一步探索Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中的作用,我們在40 mmHg壓力下,對小鼠心房成纖維細(xì)胞行siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降低Piezo1的表達,觀察Src/p-Src和纖維化因子表達及細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Piezo1表達量顯著下降(<0.05),提示敲減成功;p-Src蛋白水平也顯著降低(<0.05),Src蛋白水平輕微降低,無顯著差異;與negative control組相比,敲減后,纖維化指標(biāo)Col1A1和MMP-2/9亦顯著降低(<0.05);CCK-8結(jié)果顯示,在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染初期(0、12和24 h),兩組值無顯著差異,培養(yǎng)至48及72 h后,siRNA組值顯著低于negative control組(<0.01),見圖5。

        Figure 5.Effects of Piezo1 siRNA on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors, and cell viability in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B: representative immunoblots of Piezo1, Src/p-Src, and fibrosis-related factors; C: the level of Piezo1; D: the level of p-Src; E: the level of Src; F: the level of Col1A1; G: the level of Col3A1; H: the level of MMP-2; I: the level of MMP-9; J: A value (at 450 nm) changes of the cells transfected with negative control or Piezo1 siRNA under high hydrostatic pressure. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control group.

        6 PP1干預(yù)對高靜水壓所致小鼠心房成纖維細(xì)胞纖維化的影響

        為了探索Src在高血壓與心房纖維化中的作用,我們在40 mmHg下,以不同濃度(5和10 μmol/L)的Src抑制劑PP1處理心房成纖維細(xì)胞48 h,Western blot檢測細(xì)胞中Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達。與0 mmHg組相比,高靜水壓(40 mmHg)組p-Src表達量顯著上升(<0.05),加入PP1后p-Src表達量顯著下降,以10 μmol/L組明顯(<0.05);Src蛋白水平有下降趨勢,但無顯著差異;纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白水平在40 mmHg組顯著上升(<0.05),PP1處理后纖維化因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達量呈濃度依賴性遞減,以10 μmol/L組下降最顯著(<0.01),見圖6。

        Figure 6.Effects of PP1 on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 0 mmHg or 40 mmHg. A and B: representative immunoblots of Src/p-Src and fibrosis-related factors; C: the level of p-Src; D: the level of Src; E: the level of Col1A1; F: the level of Col3A1; G: the level of MMP-2; H: the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 mmHg group; *P<0.05, **P<0.01 vs DMSO group.

        7 Yoda1對小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化蛋白表達的影響

        以不同濃度(1、3和10 μmol/L)的特異性Piezo1激動劑Yoda1[10]處理心房成纖維細(xì)胞48 h,Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達。結(jié)果顯示,與DMSO組相比,Yoda1干預(yù)組的小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1表達量呈濃度依賴性升高,以10 μmol/L蛋白水平達到最高(<0.05);p-Src在10 μmol/L時表達量達到最高(<0.05),而Src無顯著差異;纖維化蛋白Col1A1和MMP-2在高濃度Yoda1(10 μmol/L)處理組表達量顯著升高(<0.01),而MMP-9在3 μmol/L濃度下蛋白水平升高最顯著(<0.05),Col3A1雖有升高趨勢,但無顯著差異,見圖7。

        Figure 7.Effects of Yoda1 on the expression of Piezo1, Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts. A and B: representative immunoblots of Piezo1, Src/p-Src, and fibrosis-related factors; C: the level of Piezo1; D: the level of p-Src; E: the level of Src; F: the level of Col1A1; G: the level of Col3A1; H: the level of MMP-2; I: the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs DMSO group.

        討論

        以上研究表明,高靜水壓激活心房成纖維細(xì)胞中的機械敏感通道Piezo1,Src蛋白表達水平及磷酸化增加,最后導(dǎo)致細(xì)胞中的纖維化相關(guān)因子水平升高。抑制Piezo1功能可顯著降低Src和p-Src的表達,減少纖維化相關(guān)蛋白的分泌;敲減可以顯著抑制小鼠心房成纖維細(xì)胞的增殖。Src特異性抑制劑PP1可顯著抑制心房成纖維細(xì)胞中的纖維化相關(guān)蛋白分泌。應(yīng)用Piezo1特異性激動劑Yoda1可使細(xì)胞內(nèi)Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平升高。說明小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1/Src在高靜水壓所致的心房纖維化中起重要作用。

        高血壓患者左心房壓力增加,心房壁緊張度增加,其主要的機械應(yīng)力變化為靜水壓和牽張力的增加。且高血壓可導(dǎo)致心房纖維化,房性心律失常易感性增加[11]。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有蛋白,在組織和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起著基礎(chǔ)性的作用,參與器官擴張和結(jié)構(gòu)重塑。活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位,在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中起重要作用。在體研究表明,機械負(fù)荷的變化與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān),機械力的增加有助于細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達和沉積或纖維化的增強,病理性纖維化可導(dǎo)致許多器官系統(tǒng)功能障礙[12]。但高靜水壓如何轉(zhuǎn)變成生物信號,導(dǎo)致纖維化相關(guān)因子的分泌增加,參與房顫的病理過程,尚未見報道。

        機械門控通道蛋白Piezo1通過直接的膜張力進行門控,任何改變膜張力的生理作用力都可激活通道,如戳刺、拉伸、流體剪切力等。人造液滴脂質(zhì)雙分子層實驗表明,Piezo1的機械敏感性是固有的,不需要其他蛋白質(zhì)或第二信使信號激活[13]。Piezo1也可借助附屬蛋白調(diào)節(jié)通道的敏感性,如在觸覺敏感細(xì)胞中,Piezo1與氣孔素樣蛋白3(stomatin-like protein 3, STOML3)相互作用,從而調(diào)節(jié)Piezo1通道,極大地提高了Piezo1的敏感性[14]。Piezo1在心血管系統(tǒng)中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),動脈血流激活血管壁的Piezo1通道,內(nèi)皮細(xì)胞釋放ATP,同時激活P2Y2/Gq/G11通路,調(diào)控NO生成,調(diào)節(jié)血管收縮反應(yīng)[15]。本研究表明,高靜水壓激活小鼠心房成纖維細(xì)胞的Piezo1通道,繼而調(diào)控纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。由此證實Piezo1在高血壓所致纖維化中起著重要作用。

        此外,本研究還探索了Src激酶在連接Piezo1和纖維化中的作用。Src是細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸激酶成員之一,是具有代表性的一種非受體膜結(jié)合酪氨酸激酶,在各種細(xì)胞信號通路中發(fā)揮重要作用,是許多基本生命活動所需級聯(lián)反應(yīng)的重要節(jié)點。Src也參與細(xì)胞纖維化的過程。有研究顯示,Src激酶介導(dǎo)單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎間質(zhì)纖維化,機制研究Src激酶通過激活ERK和Akt促進腎肌成纖維細(xì)胞聚集、促纖維化因子分泌和炎癥反應(yīng)[16]。在Graves眼病中,Src通過TGF-β/Smad、NF-κB及PI3K/Akt等信號通路誘導(dǎo)眶成纖維化細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞,繼而分泌促纖維化因子,引起眼外肌纖維化[17]。本研究首次發(fā)現(xiàn),高靜水壓下的小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src和p-Src表達量升高,并促進纖維化蛋白分泌,細(xì)胞外基質(zhì)重塑。但高靜水壓下Piezo1如何激活Src,仍需進一步探索。

        綜上所述,本研究初步證實機械力敏感通道蛋白Piezo1可能通過激活Src參與小鼠心房成纖維細(xì)胞高靜水壓相關(guān)纖維化,最終導(dǎo)致AF的發(fā)生和發(fā)展。

        (致謝:本研究在廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部心血管藥理實驗室進行,在此非常感謝各位實驗室成員對本實驗研究所付出的艱辛和努力?。?/p>

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        Involvement of mechanically activated Piezo1 channels in atrial fibrosis induced by elevated hydrostatic pressure

        LIU Hui-yi1, RAO Fang1, YE Xing-dong1, JIN Shu-yu1,2, FU Lu1, DENG Chun-yu1, YANG Hui1, KUANG Su-juan1, WU Shu-lin1, XUE Yu-mei1△

        (1,,,,510080,;2,,510515,)

        To investigate the role and possible mechanism of mechanosensitive ion channel Piezo1 in hypertension-induced atrial fibrosis and even atrial fibrillation.Primary atrial fibroblasts from 6-to-8-week-old male C57BL/6 mice were isolated and cultured by enzyme digestion, and the cell hypertension model was established using self-made pressure device. Western blot analysis was conducted to compare the expression levels of Piezo1, Src/p-Src, and fibrosis indicators collagen type I/III α1 chain (Col1A1/3A1) and matrix metalloproteinase-2/9 (MMP-2/9) in the cells under different pressure interventions (0, 20 and 40 mmHg). At 40 mmHg, the cells were given different concentrations (1, 3 and 10 μmol/L) of ion channel inhibitor GsMTx4 orsiRNA, or Src inhibitor PP1 (5 and 10 μmol/L), and the changes of Src/p-src and fibrosis-related factor protein levels were observed. The changes of Src/p-Src and fibrosis-related factor protein levels were also observed when the cells were given different concentrations of Piezo1-specific agonist Yoda1 (1, 3 and 10 μmol/L).Higher hydrostatic pressure (20 and 40 mmHg) increased the expression of Piezo1 and Src in mouse atrial fibroblasts (<0.05), accompanied by increases in Src/p-Src, and fibrosis indicators Col1A1/3A1 and MMP-2/9. GsMTx4,siRNA or PP1 significantly reversed the above changes (<0.05). In addition, Piezo1 agonist Yoda1 simulated the changes of electrical remodeling and related signal molecules in atrial myocytes induced by high hydrostatic pressure (<0.05).Mechanosensitive ion channel Piezo1/Src kinase signaling pathway is activated during hypertension, leading to the decreases in Col1A1/3A1 and MMP-2/9 and the electrical remodeling of atrial myocytes.

        Piezo1 protein; Hypertension; Atrial fibroblasts; Atrial fibrillation

        R541.7+5; R363.2

        A

        10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.002

        1000-4718(2022)03-0394-09

        2021-09-24

        2021-12-06

        [基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81870254)

        Tel: 020-83827812; E-mail: xymgdci@163.com

        (責(zé)任編輯:盧萍,羅森)

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