劉慧意， 饒芳， 葉興東， 金書羽，2， 付路， 鄧春玉，楊慧， 鄺素娟， 吳書林， 薛玉梅△

機(jī)械力敏感離子通道Piezo1參與高血壓誘導(dǎo)心房纖維化的機(jī)制研究*

劉慧意1， 饒芳1， 葉興東1， 金書羽1，2， 付路1， 鄧春玉1，楊慧1， 鄺素娟1， 吳書林1， 薛玉梅1△

（1廣東省心血管病研究所心內(nèi)科，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；2南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

利用小鼠心房成纖維細(xì)胞探討機(jī)械敏感離子通道Piezo1在調(diào)控高血壓所致心房纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致房顫中的作用及可能機(jī)制。采用酶消化法分離培養(yǎng)6～8周齡雄性C57BL/6小鼠的原代心房成纖維細(xì)胞，并采用課題組自制的加壓裝置（專利號201420109263.1）建立高血壓模型，Western blot比較不同靜水壓（0、20和40 mmHg）干預(yù)下細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)I/III型膠原蛋白α1鏈（Col1A1/3A1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）蛋白表達(dá)水平。高靜水壓（40 mmHg）干預(yù)下的心房成纖維細(xì)胞，分別給予不同濃度（1、3和 10 μmol/L）的Piezo1抑制劑GsMTx4，或轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒降低Piezo1的表達(dá)，以及不同濃度（5和10 μmol/L）的Src抑制劑PP1，觀察細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。常壓下給予不同濃度（1、3和10 μmol/L）的Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1，觀察心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。隨著壓力升高，小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05）；GsMTx4/siRNA或PP1處理后，可使高靜水壓導(dǎo)致的Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平下降（<0.05）。而細(xì)胞給予Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1可模擬出高靜水壓干預(yù)的結(jié)果（<0.05）。在小鼠心房成纖維細(xì)胞中，機(jī)械敏感通道蛋白Piezo1可能通過調(diào)控Src/p-Src參與高血壓所致的心房纖維化。

Piezo1蛋白；高血壓；心房成纖維細(xì)胞；心房顫動(dòng)

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床中常見的心律失常之一，我國總體發(fā)病率高達(dá)1.14%［1］。房顫危害嚴(yán)重，可引起腦卒中、充血性心力衰竭，甚至危及生命。高血壓是心房顫動(dòng)最常見的危險(xiǎn)因素。高血壓合并房顫時(shí)可顯著增加不良事件風(fēng)險(xiǎn)，包括腦卒中、心血管事件、全因死亡風(fēng)險(xiǎn)等［2］。然而，高血壓促進(jìn)房顫形成機(jī)制仍不明確。

長期高血壓狀態(tài)使左心室后負(fù)荷增加，左心房長期被動(dòng)牽拉導(dǎo)致其內(nèi)徑增大、順應(yīng)性增加及收縮力下降，且這種生物力學(xué)牽拉能直接誘導(dǎo)心房纖維化的產(chǎn)生以及引起離子通道電流改變，成為房顫發(fā)生的基礎(chǔ)［3］。但目前關(guān)于高血壓導(dǎo)致心房纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致房顫的具體分子機(jī)制仍不明確。

新型離子通道Piezo1是近年來鑒定出的哺乳動(dòng)物的機(jī)械門控離子通道，主要在暴露于流體壓力的非感覺組織中表達(dá)，廣泛參與血管發(fā)育、動(dòng)脈重塑和血壓調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和紅細(xì)胞體積調(diào)節(jié)等病理生理過程［4-5］。研究表明，Piezo1在小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)并可被拉伸力激活，通過上調(diào)細(xì)胞中Ca2+濃度，升高交聯(lián)酶活性，調(diào)節(jié)高血壓時(shí)小動(dòng)脈的直徑和壁厚，影響小動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)重塑［6］。此外，Piezo1在心肌梗死心衰大鼠心臟中表達(dá)增加，并可被血管緊張素受體阻滯劑氯沙坦所抑制；體外予以血管緊張素II刺激新生大鼠心室肌細(xì)胞可通過AT1受體依賴性途徑上調(diào)Piezo1表達(dá)［7］。但高血壓導(dǎo)致心房壓力增加時(shí)，Piezo1是否參與心房纖維化尚未見報(bào)道。

此外，編碼膜相關(guān)的酪氨酸激酶，參與細(xì)胞生長和分化。近年來的研究表明，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型和氯化鈷處理的L929細(xì)胞（小鼠成纖維細(xì)胞）中，新型肽類Src抑制劑KX-01顯著抑制p-Src，降低α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）和膠原的表達(dá)［8］。我們的前期研究提示Src參與了高靜水壓下心房肌細(xì)胞的Ca，L以及L型鈣通道α1c亞單位（L-type calcium channel α1C，Cav1.2）的表達(dá)，促進(jìn)房顫發(fā)生［9］。然而，在高血壓患者中，心房組織中的Src是否通過調(diào)節(jié)心房纖維化參與房顫的發(fā)病，心房組織中的Piezo1是否通過Src調(diào)節(jié)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)尚不清楚。因此，本研究中，我們擬證實(shí)小鼠心房成纖維細(xì)胞膜上的新型離子通道Piezo1，在機(jī)械應(yīng)力的作用下激活，激活Src激酶，促進(jìn)心房纖維化，參與房顫的發(fā)生和維持。

材料和方法

1　動(dòng)物

6～8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠由廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，20～25 g，共30只，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。SPF級Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）各3只，30～35周齡，購自北京維通利華，生產(chǎn)許可證號為SCXKD（京）2016-0006。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（No. 201904010451）。

2　主要試劑

Opti-MEM培養(yǎng)液、特級澳洲胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Lonza）；蛋白Marker（Fermentas）；4×蛋白上樣緩沖液（Bio-Rad）；RIPA裂解液（強(qiáng)）和BCA試劑盒（Beyotime）；抗Piezo1抗體（Alomone）；抗I型膠原蛋白α1鏈（collagen type I α1 chain， Col1A1）抗體、抗III型膠原蛋白α1鏈（collagen type III α1 chain， Col3A1）抗體和抗基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（matrix metalloproteinase-2/9， MMP-2/9）抗體（Abcam）；抗GAPDH抗體、抗Src抗體和抗p-Src抗體（Cell Signaling Technology）；GsMTx4和Yoda1（MedChemExpress）；PP1（Selleck）；siRNA和陰性對照（RiboBio）；Lipofactamine 3000脂質(zhì)體（Thermo Fisher Scientific）。

3　主要方法

3.1原代心房成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒小鼠，高壓滅菌后的眼科剪剪開胸腔，取出心臟，剪下左右心耳及心房組織，洗清殘血，剪碎組織至1 mm×1 mm×1 mm大小。無菌巴氏管吸取5 mL 0.25%胰酶至離心管中，輕輕吹打消化約3 min，靜置1 min，將上清轉(zhuǎn)移至含胎牛血清的終止液中，終止消化，如此反復(fù)至組織塊基本消失。將消化所得的混懸液經(jīng)100目過濾網(wǎng)過濾后，410×離心15 min，棄上清，用5 mL 10%培養(yǎng)液重懸后接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后換液。第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋5 μg質(zhì)粒，輕輕混勻；250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋6 μL Lipofectamine 3000試劑，分別震蕩混勻。然后將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的稀釋液充分混勻，室溫孵育15 min后，加入細(xì)胞中，6 h后換液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

3.2Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞長至90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗3次后加入100 μL含蛋白酶抑制劑RIPA裂解液（強(qiáng)），冰上裂解20 min后收集細(xì)胞。4 ℃、13 200×離心15 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。在20 μg蛋白質(zhì)樣品中加入4×蛋白上樣緩沖液，55 ℃變性10 min。配制10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST配制5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。對應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min。Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。配制ECL發(fā)光液，PVDF膜蛋白面朝上均勻滴加ECL發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中自動(dòng)曝光。

3.3細(xì)胞免疫熒光染色待細(xì)胞密度長到80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min后棄去，PBS浸洗3次，每次5 min。0.5% Triton X-100通透15 min后棄去，PBS洗3次，每次5 min。4%牛血清白蛋白封閉30 min，去除封閉液直接滴加稀釋好的Ⅰ抗放入裝有濕棉球的避光盒，4 ℃孵育過夜。第2天取出共聚焦皿，PBS浸洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)的熒光Ⅱ抗室溫孵育1 h。PBS浸洗3次，每次5 min。避光滴加DAPI封片劑后在共聚焦顯微鏡下觀察。

3.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力將小鼠心房成纖維細(xì)胞培養(yǎng)并傳至p2代，分別轉(zhuǎn)染negative control RNA及siRNA，6 h后換液并消化，將細(xì)胞定量至2×107L-1，接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)副孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，空白組加入100 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液，放入高靜水壓培養(yǎng)箱培育。0、12、24、48和72 h時(shí)取出細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8工作液，孵育2 h后在450 nm波長處測定吸光度（）。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較用檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)或SNK-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　原代心房成纖維細(xì)胞的分離與鑒定

將原代分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞傳代至第2代，接種于共聚焦皿上，免疫熒光法檢測成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA。結(jié)果顯示，第2代細(xì)胞中α-SMA染色呈陽性（圖1），說明從小鼠心房組織分離的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。

Figure 1.Immunofluorescence image of primary mouse atrial fibroblasts. Blue is the nucleus， and red is α-SMA. The scale bar=100 μm.

2　Wistar大鼠及SHR左心房組織中Piezo1蛋白表達(dá)水平檢測

基線資料顯示，SHR組收縮壓、平均血壓、舒張壓及心率均顯著高于Wistar組（<0.05），見表1。

表1　Wistar大鼠和SHR的血壓和心率

SBP： systolic blood pressure； MBP： mean blood pressure； DBP： diastolic blood pressure.**<0.01Wistar rats.

Western blot結(jié)果顯示，SHR組左心房組織中的Piezo1表達(dá)水平顯著高于Wistar組（<0.01），見圖2。這表明高血壓促進(jìn)心臟組織Piezo1蛋白表達(dá)。

Figure 2.The protein expression of Piezo1 in left atrial tissue of Wistar and SHR. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs Wistar.

3　高靜水壓處理對小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

借助課題組自行研制的自加壓裝置，將小鼠心房成纖維細(xì)胞置于不同壓力（0、20及40 mmHg）下培養(yǎng)48 h［9］，Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著壓力升高，機(jī)械門控離子通道Piezo1表達(dá)水平顯著升高（<0.05）；Src表達(dá)量稍有升高，但無顯著差異，p-Src蛋白水平在20 mmHg及40 mmHg下均有升高，以20 mmHg組最顯著（<0.01）；纖維化相關(guān)蛋白Col1A1/3A1水平隨壓力梯度逐漸升高（<0.05），MMP-2表達(dá)量也顯著升高，以20 mmHg升高最為顯著（<0.05），MMP-9表達(dá)量在40 mmHg升高最顯著（<0.01），見圖3。

Figure 3.The protein expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts cultured with different pressure. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05，** P<0.01 vs 0 mmHg group.

4　GsMTx4對高靜水壓所致的小鼠心房成纖維細(xì)胞Src激活及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)增加的影響

為了確定Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，我們在40 mmHg壓力下，以不同濃度（1、3和10 μmol/L）Piezo1抑制劑GsMTx4［9］處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，GsMTx4處理組細(xì)胞中Piezo1和Src/p-Src表達(dá)量呈濃度依賴性下降，以高濃度顯著（<0.05），p-Src蛋白水平在3和10μmol/L組均顯著下降（<0.01）；GsMTx4亦可明顯逆轉(zhuǎn)高靜水壓所致纖維化指標(biāo)Col1A1、Col3A1及MMP-2/9表達(dá)增加（<0.05），見圖4。

Figure 4.Effects of GsMTx4 on the expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 μmol/L group.

5　敲減Piezo1對高靜水壓下小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力的影響

為了進(jìn)一步探索Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中的作用，我們在40 mmHg壓力下，對小鼠心房成纖維細(xì)胞行siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降低Piezo1的表達(dá)，觀察Src/p-Src和纖維化因子表達(dá)及細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Piezo1表達(dá)量顯著下降（<0.05），提示敲減成功；p-Src蛋白水平也顯著降低（<0.05），Src蛋白水平輕微降低，無顯著差異；與negative control組相比，敲減后，纖維化指標(biāo)Col1A1和MMP-2/9亦顯著降低（<0.05）；CCK-8結(jié)果顯示，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染初期（0、12和24 h），兩組值無顯著差異，培養(yǎng)至48及72 h后，siRNA組值顯著低于negative control組（<0.01），見圖5。

Figure 5.Effects of Piezo1 siRNA on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors， and cell viability in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9； J： A value （at 450 nm） changes of the cells transfected with negative control or Piezo1 siRNA under high hydrostatic pressure. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control group.

6　PP1干預(yù)對高靜水壓所致小鼠心房成纖維細(xì)胞纖維化的影響

為了探索Src在高血壓與心房纖維化中的作用，我們在40 mmHg下，以不同濃度（5和10 μmol/L）的Src抑制劑PP1處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測細(xì)胞中Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。與0 mmHg組相比，高靜水壓（40 mmHg）組p-Src表達(dá)量顯著上升（<0.05），加入PP1后p-Src表達(dá)量顯著下降，以10 μmol/L組明顯（<0.05）；Src蛋白水平有下降趨勢，但無顯著差異；纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白水平在40 mmHg組顯著上升（<0.05），PP1處理后纖維化因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達(dá)量呈濃度依賴性遞減，以10 μmol/L組下降最顯著（<0.01），見圖6。

Figure 6.Effects of PP1 on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 0 mmHg or 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Src/p-Src and fibrosis-related factors； C： the level of p-Src； D： the level of Src； E： the level of Col1A1； F： the level of Col3A1； G： the level of MMP-2； H： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. #P<0.05， ##P<0.01 vs 0 mmHg group； *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.

7　Yoda1對小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化蛋白表達(dá)的影響

以不同濃度（1、3和10 μmol/L）的特異性Piezo1激動(dòng)劑Yoda1［10］處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與DMSO組相比，Yoda1干預(yù)組的小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1表達(dá)量呈濃度依賴性升高，以10 μmol/L蛋白水平達(dá)到最高（<0.05）；p-Src在10 μmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（<0.05），而Src無顯著差異；纖維化蛋白Col1A1和MMP-2在高濃度Yoda1（10 μmol/L）處理組表達(dá)量顯著升高（<0.01），而MMP-9在3 μmol/L濃度下蛋白水平升高最顯著（<0.05），Col3A1雖有升高趨勢，但無顯著差異，見圖7。

Figure 7.Effects of Yoda1 on the expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.

討論

以上研究表明，高靜水壓激活心房成纖維細(xì)胞中的機(jī)械敏感通道Piezo1，Src蛋白表達(dá)水平及磷酸化增加，最后導(dǎo)致細(xì)胞中的纖維化相關(guān)因子水平升高。抑制Piezo1功能可顯著降低Src和p-Src的表達(dá)，減少纖維化相關(guān)蛋白的分泌；敲減可以顯著抑制小鼠心房成纖維細(xì)胞的增殖。Src特異性抑制劑PP1可顯著抑制心房成纖維細(xì)胞中的纖維化相關(guān)蛋白分泌。應(yīng)用Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1可使細(xì)胞內(nèi)Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平升高。說明小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1/Src在高靜水壓所致的心房纖維化中起重要作用。

高血壓患者左心房壓力增加，心房壁緊張度增加，其主要的機(jī)械應(yīng)力變化為靜水壓和牽張力的增加。且高血壓可導(dǎo)致心房纖維化，房性心律失常易感性增加［11］。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有蛋白，在組織和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起著基礎(chǔ)性的作用，參與器官擴(kuò)張和結(jié)構(gòu)重塑?；罨腗MP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中起重要作用。在體研究表明，機(jī)械負(fù)荷的變化與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)，機(jī)械力的增加有助于細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)和沉積或纖維化的增強(qiáng)，病理性纖維化可導(dǎo)致許多器官系統(tǒng)功能障礙［12］。但高靜水壓如何轉(zhuǎn)變成生物信號，導(dǎo)致纖維化相關(guān)因子的分泌增加，參與房顫的病理過程，尚未見報(bào)道。

機(jī)械門控通道蛋白Piezo1通過直接的膜張力進(jìn)行門控，任何改變膜張力的生理作用力都可激活通道，如戳刺、拉伸、流體剪切力等。人造液滴脂質(zhì)雙分子層實(shí)驗(yàn)表明，Piezo1的機(jī)械敏感性是固有的，不需要其他蛋白質(zhì)或第二信使信號激活［13］。Piezo1也可借助附屬蛋白調(diào)節(jié)通道的敏感性，如在觸覺敏感細(xì)胞中，Piezo1與氣孔素樣蛋白3（stomatin-like protein 3， STOML3）相互作用，從而調(diào)節(jié)Piezo1通道，極大地提高了Piezo1的敏感性［14］。Piezo1在心血管系統(tǒng)中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈血流激活血管壁的Piezo1通道，內(nèi)皮細(xì)胞釋放ATP，同時(shí)激活P2Y2/Gq/G11通路，調(diào)控NO生成，調(diào)節(jié)血管收縮反應(yīng)［15］。本研究表明，高靜水壓激活小鼠心房成纖維細(xì)胞的Piezo1通道，繼而調(diào)控纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。由此證實(shí)Piezo1在高血壓所致纖維化中起著重要作用。

此外，本研究還探索了Src激酶在連接Piezo1和纖維化中的作用。Src是細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸激酶成員之一，是具有代表性的一種非受體膜結(jié)合酪氨酸激酶，在各種細(xì)胞信號通路中發(fā)揮重要作用，是許多基本生命活動(dòng)所需級聯(lián)反應(yīng)的重要節(jié)點(diǎn)。Src也參與細(xì)胞纖維化的過程。有研究顯示，Src激酶介導(dǎo)單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎間質(zhì)纖維化，機(jī)制研究Src激酶通過激活ERK和Akt促進(jìn)腎肌成纖維細(xì)胞聚集、促纖維化因子分泌和炎癥反應(yīng)［16］。在Graves眼病中，Src通過TGF-β/Smad、NF-κB及PI3K/Akt等信號通路誘導(dǎo)眶成纖維化細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，繼而分泌促纖維化因子，引起眼外肌纖維化［17］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，高靜水壓下的小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src和p-Src表達(dá)量升高，并促進(jìn)纖維化蛋白分泌，細(xì)胞外基質(zhì)重塑。但高靜水壓下Piezo1如何激活Src，仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究初步證實(shí)機(jī)械力敏感通道蛋白Piezo1可能通過激活Src參與小鼠心房成纖維細(xì)胞高靜水壓相關(guān)纖維化，最終導(dǎo)致AF的發(fā)生和發(fā)展。

（致謝：本研究在廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部心血管藥理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在此非常感謝各位實(shí)驗(yàn)室成員對本實(shí)驗(yàn)研究所付出的艱辛和努力?。?/p>

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Involvement of mechanically activated Piezo1 channels in atrial fibrosis induced by elevated hydrostatic pressure

LIU Hui-yi1， RAO Fang1， YE Xing-dong1， JIN Shu-yu1，2， FU Lu1， DENG Chun-yu1， YANG Hui1， KUANG Su-juan1， WU Shu-lin1， XUE Yu-mei1△

（1，，，，510080，；2，，510515，）

To investigate the role and possible mechanism of mechanosensitive ion channel Piezo1 in hypertension-induced atrial fibrosis and even atrial fibrillation.Primary atrial fibroblasts from 6-to-8-week-old male C57BL/6 mice were isolated and cultured by enzyme digestion， and the cell hypertension model was established using self-made pressure device. Western blot analysis was conducted to compare the expression levels of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis indicators collagen type I/III α1 chain （Col1A1/3A1） and matrix metalloproteinase-2/9 （MMP-2/9） in the cells under different pressure interventions （0， 20 and 40 mmHg）. At 40 mmHg， the cells were given different concentrations （1， 3 and 10 μmol/L） of ion channel inhibitor GsMTx4 orsiRNA， or Src inhibitor PP1 （5 and 10 μmol/L）， and the changes of Src/p-src and fibrosis-related factor protein levels were observed. The changes of Src/p-Src and fibrosis-related factor protein levels were also observed when the cells were given different concentrations of Piezo1-specific agonist Yoda1 （1， 3 and 10 μmol/L）.Higher hydrostatic pressure （20 and 40 mmHg） increased the expression of Piezo1 and Src in mouse atrial fibroblasts （<0.05）， accompanied by increases in Src/p-Src， and fibrosis indicators Col1A1/3A1 and MMP-2/9. GsMTx4，siRNA or PP1 significantly reversed the above changes （<0.05）. In addition， Piezo1 agonist Yoda1 simulated the changes of electrical remodeling and related signal molecules in atrial myocytes induced by high hydrostatic pressure （<0.05）.Mechanosensitive ion channel Piezo1/Src kinase signaling pathway is activated during hypertension， leading to the decreases in Col1A1/3A1 and MMP-2/9 and the electrical remodeling of atrial myocytes.

Piezo1 protein； Hypertension； Atrial fibroblasts； Atrial fibrillation

R541.7+5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.002

1000-4718（2022）03-0394-09

2021-09-24

2021-12-06

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81870254）

Tel： 020-83827812； E-mail： xymgdci@163.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）