蘆偉 談家金

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

松材線(xiàn)蟲(chóng)病是一種由松材線(xiàn)蟲(chóng)引起的林業(yè)病害，屬?lài)?guó)際重要檢疫對(duì)象，對(duì)世界各國(guó)松樹(shù)健康造成巨大威脅，目前松材線(xiàn)蟲(chóng)病的致病機(jī)理尚不明確，病害的防治也一直是個(gè)世界難題[1-2]。松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌在松樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育、抗病性以及抗逆性等方面起著重要的作用[3-4]。研究表明，松材線(xiàn)蟲(chóng)所處環(huán)境中的松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌可能參與病害的發(fā)病過(guò)程。談家金等[5]在馬尾松內(nèi)生細(xì)菌與松材線(xiàn)蟲(chóng)病關(guān)系的初步研究中發(fā)現(xiàn)松樹(shù)莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌與松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生有著非常密切的關(guān)系。歐陽(yáng)革成等[6]通過(guò)對(duì)植物內(nèi)生菌與松材線(xiàn)蟲(chóng)病關(guān)系的研究，提出植物內(nèi)生菌是導(dǎo)致松材線(xiàn)蟲(chóng)病的內(nèi)因，而松材線(xiàn)蟲(chóng)是激發(fā)因子之一。曾凡勇等[7]通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后的松樹(shù)內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)的侵染會(huì)引起內(nèi)生真菌的響應(yīng)。Hallmann et al.[8]研究表明植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)能提高內(nèi)生菌的進(jìn)入位點(diǎn)，最終導(dǎo)致內(nèi)生菌的總量增加。謝利群等[9]利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法研究松材線(xiàn)蟲(chóng)病病程中樹(shù)體內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)和細(xì)菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明黑松(Pinusthunbergii)在接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，隨著病情的發(fā)展，細(xì)菌不但數(shù)量迅速增加,而且種類(lèi)也增多。Proen?a et al.[10]的研究表明海岸松(Pinuspinaster)感染松材線(xiàn)蟲(chóng)后，隨著病情的發(fā)展，松樹(shù)莖干內(nèi)生細(xì)菌的多樣性增加，內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，這可能會(huì)導(dǎo)致樹(shù)木健康狀況的進(jìn)一步下降。馬陽(yáng)等[11]在研究松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染對(duì)寄主松樹(shù)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響中發(fā)現(xiàn)，松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后的病死樹(shù)針葉、根部與土壤中細(xì)菌群落多樣性、豐富度和均勻性指數(shù)均高于健康樹(shù)，但感病樹(shù)和健康樹(shù)所有研究部位細(xì)菌群落的任一指數(shù)均未呈現(xiàn)出顯著性差異。

植物體內(nèi)菌群作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組成部分，能與植物體長(zhǎng)期共存，對(duì)病蟲(chóng)害的響應(yīng)具有快速、靈敏和專(zhuān)一性等特點(diǎn)。體內(nèi)菌群在松樹(shù)中廣泛存在，且對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)病等外界環(huán)境刺激能夠做出相應(yīng)響應(yīng)[12]。為了進(jìn)一步深入了解受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后，松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化以及松材線(xiàn)蟲(chóng)—松樹(shù)—松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌之間的關(guān)系，本文采用16S rRNA基因的V5～V7區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序研究受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后馬尾松內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步研究松材線(xiàn)蟲(chóng)病與松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)接種體的制備

將灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)接種到PDA培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)箱內(nèi)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基，然后將松材線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)株AMA3接種到灰葡萄孢菌上，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的松材線(xiàn)蟲(chóng)采用貝爾曼漏斗法分離，將線(xiàn)蟲(chóng)液收集于15 mL離心管中，無(wú)菌水洗滌1次，調(diào)整線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液至所需濃度。

1.2 馬尾松樣品的采集及預(yù)處理

2年生的健康馬尾松苗定植后，采用人工皮接法接種松材線(xiàn)蟲(chóng)。用無(wú)菌解剖刀在松苗的莖干上割開(kāi)樹(shù)皮，深及木質(zhì)部，掀開(kāi)樹(shù)皮塞入大小合適的棉球，用微量進(jìn)液器注入線(xiàn)蟲(chóng)懸浮液，并用封口膜將其包裹好。處理組線(xiàn)蟲(chóng)接種量為5 000條/株，對(duì)照組接等量無(wú)菌水。接種后每天定時(shí)觀(guān)察樹(shù)苗的生長(zhǎng)狀況，松苗發(fā)病程度采取以下病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，正常；1級(jí)，1/2以下葉褪綠、1/4以下葉發(fā)黃；2級(jí)，1/2以上葉褪綠、1/4～3/4葉發(fā)黃；3級(jí)，3/4以上葉發(fā)黃、1/2以下葉變紅；4級(jí)，1/2以上葉變紅、植株瀕死或死亡[13]。

處理組在接種松材線(xiàn)蟲(chóng)前和接種后1、3、7 d和剛開(kāi)始表現(xiàn)發(fā)病癥狀時(shí)進(jìn)行取樣，取樣部位為莖干且包括接種點(diǎn)，質(zhì)量大約1 g。對(duì)照組接無(wú)菌水，與上重復(fù)。樣品的采集用無(wú)菌剪刀處理，一共9組樣品，每組樣品包含3個(gè)重復(fù)。采集后的樣品置于冰上，帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌水洗滌樣本30 s，接著在體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇中浸泡2 min，再用體積分?jǐn)?shù)2.5% NaClO(含0.1% Tween80)浸泡5 min后轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡30 s，最后使用無(wú)菌水洗滌植物組織3次即視為對(duì)植物組織表面進(jìn)行無(wú)菌化處理，表面無(wú)菌化的植物組織進(jìn)行液氮速凍，然后保存于冰箱-80 ℃?zhèn)溆肹14-16]。

1.3 樣品DNA提取與PCR擴(kuò)增

根據(jù)FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。用799F(5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)和1392R(5’-ACGGGCGGTGTGTRC-3’)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一輪擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min。用799F(5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)和1193R(5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’)引物對(duì)V5～V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，二輪擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，13個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL Forward Primer(5 μmol/L)，0.8 μL Reverse Primer(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng Template DNA，補(bǔ)ddH2O至20 μL。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序與序列數(shù)據(jù)處理

PCR結(jié)束后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，F(xiàn)LASH軟件拼接，通過(guò)以上步驟最終得到有效數(shù)據(jù)。獲得有效數(shù)據(jù)之后，使用UPARSE軟件(version7.1http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，并在聚類(lèi)的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)silva138/16s_bacterial數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，去除葉綠體與線(xiàn)粒體序列，最后按最小樣本序列數(shù)抽平。測(cè)序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，生信分析在美吉生物云平臺(tái)cloud.majorbio.com中運(yùn)行，原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，項(xiàng)目登錄號(hào)為PRJNA673085。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌序列數(shù)

對(duì)接種前后的馬尾松進(jìn)行取樣共得到27個(gè)樣本，所有樣本共得到472 356條優(yōu)化序列，優(yōu)化序列的平均長(zhǎng)度為387 bp，所有優(yōu)化序列被分配到30個(gè)門(mén)、75個(gè)綱、171個(gè)目、290個(gè)科、513個(gè)屬、723個(gè)種、956個(gè)OTUs。通過(guò)在OTU水平作稀釋曲線(xiàn)，可得出樣本的測(cè)序深度情況。由圖1可知隨著測(cè)序量的不斷増加，所有樣本曲線(xiàn)趨于水平，說(shuō)明各個(gè)樣品的測(cè)序基本達(dá)到飽和狀態(tài)，具有令人滿(mǎn)意的置信水平。

2.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌豐富度與多樣性

從表1的豐富度指數(shù)得出，接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后第1、3、7天，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌豐富度為處理組低于對(duì)照組，但差異不顯著，而第18天即馬尾松剛表現(xiàn)發(fā)病癥狀時(shí)，處理組顯著高于對(duì)照組。處理組馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，內(nèi)生細(xì)菌的豐富度出現(xiàn)波動(dòng)，在第18天顯著升高。從表1的多樣性指數(shù)得出，接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后第1、3、18天，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌多樣性為處理組高于對(duì)照組，但差異不顯著，而第7天處理組低于對(duì)照組，同樣無(wú)顯著性差異。處理組馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，內(nèi)生細(xì)菌多樣性升高，但無(wú)顯著性差異。

2.3 松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落門(mén)屬水平結(jié)構(gòu)

在門(mén)水平上將所有樣本中豐度占比均小于1%的物種合并為其他，屬水平上將所有樣本中豐度占比均小于5%的物種合并為其他，對(duì)組內(nèi)重復(fù)樣本求均值計(jì)算生成群落相對(duì)豐度表[17-19]。如表2所示，從門(mén)分類(lèi)水平看，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)主要包括變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。處理組馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后與接種前馬尾松相比內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)沒(méi)有發(fā)生變化。豐度方面，變形菌門(mén)變化趨勢(shì)為先升高再降低，在第3天豐度達(dá)到最高值95%。放線(xiàn)菌門(mén)變化趨勢(shì)為先降低再升高，在第3天豐度降到最低。厚壁菌門(mén)豐度呈升高趨勢(shì)，但變化幅度不大。擬桿菌門(mén)豐度基本沒(méi)有變化。對(duì)照組馬尾松接無(wú)菌水后與接種前馬尾松相比內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)同樣沒(méi)有發(fā)生變化，變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)豐度在較小范圍內(nèi)波動(dòng)。厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)豐度基本沒(méi)有變化。

如表3所示，從屬分類(lèi)水平看，處理組馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)及豐度變化較大，接種前馬尾松中的優(yōu)勢(shì)屬羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、紅球菌屬(Rhodococcus)在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后豐度大幅度降低，腸桿菌科未分類(lèi)屬(unclassified_f_Enterobacteriaceae)在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后豐度升高，第3天豐度達(dá)到最高29%，科薩克氏菌屬(Kosakonia)在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后豐度升高，但呈波動(dòng)性變化，伯克氏菌屬(Burkholderia)第18天豐度達(dá)到最高28%，其它菌屬的豐度變化沒(méi)有明顯規(guī)律。對(duì)照組馬尾松接無(wú)菌水后內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)及豐度無(wú)規(guī)律性變化。

Heatmap圖可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映多個(gè)樣本在各分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性[20-21]。圖2為馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落屬水平Heatmap圖和樣本聚類(lèi)樹(shù)分析，選取了豐度前50的菌屬進(jìn)行研究。紅球菌屬、羅爾斯通氏菌屬的豐度在處理組中降低，對(duì)照組中基本沒(méi)有變化?？扑_克氏菌屬、伯克氏菌屬、固氮螺菌屬(Azospirillum)的豐度在處理組中升高，對(duì)照組中基本沒(méi)有變化。草螺菌屬(Herbaspirillum)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)的豐度在處理組中先升高再降低，對(duì)照組中升高。克氏桿菌屬(Klebsiella)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)的豐度在兩組中均先升高再降低。樣本聚類(lèi)分析表明EG0、EG1、CK1的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成更為相似，CK3、CK7、CK18的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成更為相似，并且與EG3、EG7、EG18的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成存在差異。

圖2 馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌屬水平群落

2.4 松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落OTU水平結(jié)構(gòu)

PCoA分析是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來(lái)研究樣本群落組成的相似性或差異性[22]。圖3為OTU水平的PCoA分析，距離算法采用Abund_jaccard，PERMANOVA分析用于組間差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，處理組EG1、EG3、EG7、EG18、EG0之間形成了不同的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，PERMANOVA分析進(jìn)一步證明了它們之間的顯著性(P=0.006)，而對(duì)照組中除了CK7，其余分組樣本均沒(méi)有與EG0形成不同的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明馬尾松受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后，莖干內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化(表4)。

不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同分組的樣本。

表4 樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與討論

許多研究已經(jīng)表明植物被病原菌感染后會(huì)影響寄主的微生物群落[23-24]，所以松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染亦可能對(duì)寄主的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。松樹(shù)發(fā)生松材線(xiàn)蟲(chóng)病一般經(jīng)過(guò)侵染期、潛育期、發(fā)病期和死亡期。劉軍民等用水培法試驗(yàn)表明，接種24 h后，松材線(xiàn)蟲(chóng)立即自接種點(diǎn)向接種枝深處移動(dòng)，2～3 d后，觀(guān)察到侵入的松材線(xiàn)蟲(chóng)逐漸向主枝擴(kuò)散[25]。陳玉惠等用離體枝接種松材線(xiàn)蟲(chóng)，2 d后，觀(guān)察到線(xiàn)蟲(chóng)自接種點(diǎn)向上下擴(kuò)散，并有少量線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)入主枝，8～10 d后，移入主枝的線(xiàn)蟲(chóng)量增加，并見(jiàn)少量線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)入非接種側(cè)枝[26]。病原線(xiàn)蟲(chóng)群體的增長(zhǎng)是在病樹(shù)停止分泌松脂和出現(xiàn)外部癥狀后開(kāi)始，當(dāng)松樹(shù)外部出現(xiàn)癥狀，在病樹(shù)中能分離到大量線(xiàn)蟲(chóng)[27]。本研究在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后的第1、3、7、18天進(jìn)行取樣，對(duì)人工接種松材線(xiàn)蟲(chóng)的2年生馬尾松的莖干內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。

本文通過(guò)Alpha多樣性分析研究松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后的馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌豐富度與多樣性。豐富度指數(shù)表明，處理組馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌豐富度上下波動(dòng)，第18天顯著升高。多樣性指數(shù)表明，處理組馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌多樣性升高，但接種松材線(xiàn)蟲(chóng)前后無(wú)顯著性差異。Proen?a et al.[10]的研究將海岸松感染松材線(xiàn)蟲(chóng)后按感病癥狀劃分成6個(gè)階段，松樹(shù)莖部?jī)?nèi)生菌的豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)在不同癥狀階段的樹(shù)木呈現(xiàn)出不同的指數(shù)，在病害的早期階段多樣性較低，后期階段多樣性更高。本研究雖然沒(méi)有按感病癥狀劃分階段進(jìn)行取樣，但與Proen?a et al.[10]的研究結(jié)果基本吻合。內(nèi)生細(xì)菌多樣性的增加，這可能是由于病害導(dǎo)致植物抵御微生物入侵的能力喪失，或失去對(duì)內(nèi)生菌生長(zhǎng)的控制能力[28]。

群落結(jié)構(gòu)組成分析中，所有樣本主要檢測(cè)出4個(gè)菌門(mén)，變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，莖干內(nèi)生細(xì)菌組成種類(lèi)沒(méi)有發(fā)生變化，但變形菌門(mén)豐度升高。有研究表明，變形菌門(mén)是植物組織中常見(jiàn)的植物病原菌和寄生生物，能夠引起多種植物病害[29]，該菌門(mén)在松材線(xiàn)蟲(chóng)病的作用還需關(guān)注。另外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)豐度亦升高，但幅度不大，有文獻(xiàn)指出厭氧環(huán)境是厚壁菌門(mén)偏好的生長(zhǎng)環(huán)境[30]，這可能與松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染導(dǎo)致莖干內(nèi)部環(huán)境的改變有關(guān)。

屬水平，馬尾松接種松材線(xiàn)蟲(chóng)后，科薩克氏菌屬、伯克氏菌屬、固氮螺菌屬、草螺菌屬、假單胞菌屬、新鞘脂菌屬等豐度升高。其中伯克氏菌屬、假單胞菌屬在水體、土壤和植物中廣泛存在,它們豐度的升高可能會(huì)引起某些植物病害[31-32]，還有研究指出，熒光假單胞菌是松材線(xiàn)蟲(chóng)體表攜帶的一種致病菌，其和線(xiàn)蟲(chóng)共同導(dǎo)致松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生[9，33]。腸桿菌科未分類(lèi)屬豐度在第3、7天升高，可能與松材線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量增加有關(guān)，Proen?a et al.[34]認(rèn)為由于線(xiàn)蟲(chóng)的數(shù)量增加，在此階段被線(xiàn)蟲(chóng)攜帶或能夠粘附到線(xiàn)蟲(chóng)上的細(xì)菌大量存在，這些細(xì)菌主要包括腸桿菌科與黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)。植物被病原體侵染后，植物抗病性降低，大量外部細(xì)菌菌群更易侵染植物，導(dǎo)致其內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)增多，這可能是其它菌屬豐度升高的原因。另外，羅爾斯通氏菌屬、紅球菌屬豐度降低，可能與細(xì)菌之間的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)，李陽(yáng)在松樹(shù)體內(nèi)菌群對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染響應(yīng)的研究中推測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的侵入打破馬尾松體內(nèi)細(xì)菌菌群的平衡，致病菌與馬尾松體內(nèi)菌經(jīng)過(guò)復(fù)雜的拮抗與反拮抗作用，最終致病菌占優(yōu)勢(shì)大量繁殖，而有益菌減少或消失[12]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)亦發(fā)生變化，這可能因?yàn)轳R尾松在接無(wú)菌水時(shí)會(huì)造成傷口，使大量外部細(xì)菌進(jìn)入，從而導(dǎo)致內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

Heatmap圖與群落結(jié)構(gòu)組成分析的結(jié)果相一致，通過(guò)樣本聚類(lèi)樹(shù)分析可知，樣本EG0、EG1、CK1聚類(lèi)到一起，表明健康馬尾松在接種松材線(xiàn)蟲(chóng)或無(wú)菌水后1 d，莖干內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成變化不大，可能因?yàn)樗刹木€(xiàn)蟲(chóng)剛進(jìn)入到馬尾松體內(nèi)，松材線(xiàn)蟲(chóng)在接種點(diǎn)初期幾乎不移動(dòng)或移動(dòng)較慢[35]，所以?xún)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成沒(méi)有發(fā)生明顯變化。樣本CK3、CK7、CK18聚類(lèi)到一起，表明接無(wú)菌水后的第3、7、18天，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成變化不大。樣本EG3、EG7、EG18分別單獨(dú)聚類(lèi)，表明受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬組成會(huì)發(fā)生明顯改變，而且這種變化與接無(wú)菌水后導(dǎo)致的變化不同。OTU水平的PCoA分析結(jié)果進(jìn)一步表明，受松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染后，馬尾松莖干內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著性變化。Proen?a et al.[34]的研究同樣表明，海岸松感染松材線(xiàn)蟲(chóng)后，內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著性變化。本次研究的試驗(yàn)材料為2年生盆栽馬尾松，處理組樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣本數(shù)量可能較少，導(dǎo)致試驗(yàn)誤差的產(chǎn)生，所以有必要進(jìn)一步以野生馬尾松為試驗(yàn)材料，并增加生物學(xué)重復(fù)，開(kāi)展更深入的研究。