馬 坤， 蘆光新*， 鄧 曄， 顏琿璘， 王英成， 趙陽安， 張海娟， 周學麗， 竇聲云

(1.青海大學農(nóng)牧學院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心， 北京 100080；3.青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000)

作為地球的“第三極”，青藏高原具有高海拔、低氣溫、半干旱等特點，特殊的環(huán)境和氣候條件導致該地區(qū)以高寒草原和高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)為主[1]。近年來，由于氣候變化和人為干預導致該區(qū)域草地生態(tài)系統(tǒng)嚴重退化[2]，主要表現(xiàn)為草地土壤退化和植被退化[3-4]。因此，提高牧草產(chǎn)量，緩解牧草資源壓力應成為相關研究者主要關心的問題。

其中，施肥是迅速提高草地生產(chǎn)力和改善群落組成，調(diào)節(jié)牧草營養(yǎng)物質含量的措施之一，但是化學肥料的大規(guī)模施用，造成了一系列的環(huán)境問題[5]。有研究指出，有機肥的施用有利于促進土壤有機質含量增加、細菌生長及其調(diào)節(jié)土壤微生物群落的組成和多樣性，對進一步增加土壤養(yǎng)分的有效性、提高土壤肥力和提高土壤生產(chǎn)力具有重要意義[6-7]。

土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程的主導作用影響植物多樣性和土壤結構的穩(wěn)定[8-9]。根際微生物作為土壤微生物重要的組成部分之一，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要功能，是陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤質量、生產(chǎn)力和可持續(xù)性的敏感指標，對植物養(yǎng)分吸收、抵御逆境等方面具有重要作用[10]。近年來，分子生物學研究方法的進步使得我們能夠在更加精細的分子水平上確定土壤微生物群落多樣性和組成的變化，越來越多的國內(nèi)外學者對青藏高原地區(qū)氮磷肥的添加對土壤生態(tài)產(chǎn)生的影響做了大量研究，Shi等[11]人通過對燕麥(AvenasativaL.)根際微生物多樣性的研究表明，與非根際微生物多樣性相比，根際微生物α多樣性較低。仁增旺姆等發(fā)現(xiàn)氮添加對垂穗披堿草地上生物量變化無顯著影響，而磷添加不僅提高披堿草人工草地的地上生物量而且可以防止土壤有機碳的損失[12]。然而有機肥對青藏高原地區(qū)植物微生物群落結構影響的研究報告相對較少，因此，本試驗采用高通量測序技術來檢測施用有機肥對高寒地區(qū)牧草土壤根際微生物群落多樣性和組成的變化，以期闡釋施用不同濃度梯度有機肥對牧草土壤理化和土壤根際微生物多樣性的影響，為今后青藏高原地區(qū)人工增施有機肥提供理論依據(jù)，也為‘阿壩’垂穗披堿草在高寒地區(qū)的推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

禾本科牧草：來自四川省川草生態(tài)科技有限責任公司提供的‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’);有機肥(有機質含量≥45%，N+P2O5+K2O≥5%，pH值 5.5～8.5)：由四川農(nóng)業(yè)大學資源學院提供技術配方，主要以富含有機質的農(nóng)作物秸稈和家禽糞便為原料，添加生物發(fā)酵劑加工而成。

1.2 試驗地點

青海省鐵卜加草原改良試驗站位于青海湖西岸，位于東經(jīng)99°35′，北緯37°05′，海拔3 270 m。該地區(qū)屬高山高原氣候，具有光照充足、日照強烈、冬寒夏涼、降雨集中、干旱少雨、風大等氣候特征，在青藏高原具有高寒草地生態(tài)環(huán)境的典型性、代表性。年平均氣溫-0.7℃，最熱月(7月)平均氣溫17.5℃，最冷月(1月)平均氣溫-22.6℃，極端溫度-34.3℃。無霜期平均為78.7 d，無絕對無霜期。日照時數(shù)2 670 h，≥0℃年積溫1 331.3℃，年降水量368.11 mm，年蒸發(fā)量1 495.3 mm，相對濕度58%。

1.3 試驗設計

試驗于2020年5月份進行，試驗共設3個處理，3次重復，每個小區(qū)面積15 m2(3 m×5 m)，CK為不施有機肥，50%梯度即每個小區(qū)施有機肥量為5.25 kg，75%梯度即每個小區(qū)施有機肥量為7.88 kg，具體處理如表1所示。

表1 試驗處理信息Table 1 Test processing information

1.4 測定方法及指標

1.4.1樣品采集 采樣時間為2020年9月12日至13日，進行土壤樣品的采集，在每個樣地隨機選取3個采樣點用土鉆鉆取表層土壤(0～15 cm)，去除可見植物殘體及土壤動物后封裝于樣品袋中帶回試驗室，一部分保存于4℃冰箱用于理化性質測定，另一部分保存于-80℃冰箱，用于DNA提取。

1.4.2土壤理化性質測定 用于土壤理化性質測定的樣品風干、粉碎后，過0.25 mm孔徑網(wǎng)篩進行土壤養(yǎng)分測定。土壤pH值使用pH計(pHS-3C)測定，土壤有機碳(Soil organic carbon,SOC)用重鉻酸鉀硫酸外加熱法；土壤全氮(Total nitrogen,TN)用半微量凱氏定氮法。

1.4.3土壤微生物群落多樣性和組成測定測定 從-80℃的冰箱中取出裝有樣品的無菌管，在超凈工作臺中取無菌管中的土壤10 g，去除植物殘留物和石礫后裝于5 mL的無菌管中，放于附有冰袋的泡沫箱中寄到中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，采用16S/ITS擴增子測序分析技術測定土壤微生物的多樣性及群落結構。為了研究土壤微生物群落的β-多樣性差異，采用PCA法對不同施肥梯度下的土壤微生物群落的差異進行研究分析，且基于Bray-curtis距離矩陣的NMDS方法對不同濃度梯度有機肥的土壤微生物群落β-多樣性的差異分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2010整理數(shù)據(jù)，運用SPSS 26.0進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。采用SigmaPlot 12.5和Origin 2018作圖，圖中數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。所有測序的原始數(shù)據(jù)均于中科院生態(tài)環(huán)境研究中心鄧曄研究員課題組的Galaxy分析平臺(http://mem.rcees.ac.cn:8080)完成。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

通過對‘阿壩’垂穗披堿草增施不同梯度有機肥的試驗，結果表明，與CK相比，施肥梯度為50%時顯著增加土壤總氮含量(P<0.05)，明顯降低土壤pH值(P<0.05)；施肥梯度為75%時，和對照相比，土壤有機質含量顯著增加0.77%(P<0.05)，土壤pH顯著降低(P<0.05)。而不同施肥梯度對氨態(tài)氮、硝態(tài)氮影響不顯著。這一結果說明短期施加有機肥僅對土壤總氮、土壤pH值和土壤有機質含量有顯著的影響(表2)。

表2 土壤的基本化學性質Table 2 Basic chemical properties of soils

2.2 土壤微生物多樣性分析

在鐵卜加試驗地‘阿壩’垂穗披堿草的9個樣本中，檢測到土壤細菌2 152 310條序列(圖1a)，真菌檢測到2 032 477條序列(圖1b)，在97%的相似性水平下，所有12個樣本得到10 648種細菌分類操作單元(Operational taxonomic unit,OTU)，1945種真菌OTU。對土壤微生物α多樣性進行分析，結果表明，與不施肥相比，增施有機肥之后土壤細菌辛普森指數(shù)(Simpson evenness)顯著增加(P<0.05)，而細菌豐富度指數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(圖2a，2b)。土壤真菌辛普森指數(shù)(Simpson evenness)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在有機肥梯度為75%時辛普森指數(shù)最大。真菌豐富度指數(shù)因有機肥的添加呈下降趨勢。

圖1 土壤樣品微生物OTU稀釋性曲線Fig.1 Soil samples OTU dilution curve of microorganism注：不同顏色代表不同的樣品Note：Different colors represent different samples

圖2 土壤微生物α多樣性Fig.2 Diversity of soil microorganism α.

2.3 土壤微生物群落組成成分

細菌群落中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)為主要優(yōu)勢菌門，相對豐度超過1%。與不施肥相比，在不同施肥處理下土壤中相對豐度最高的細菌菌門存在差異，其中施有機肥為50%時放線菌門(Actinobacteria)相對豐度最高。在土壤真菌門群落中子囊菌門(Ascomycota)為主要優(yōu)勢菌門，平均相對豐度超過90%。增施有機肥后子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度低于CK(87%vs 96%)，施肥量為50%時擔子菌門(Basidiomycota)平均相對豐度最高為3.25%(CK1.49%)。

對土壤細菌和真菌進一步在屬水平進行群落組成成分比較(圖3c,3d)，土壤細菌屬的研究結果表明，節(jié)桿菌(Arthrobacter)、微小桿菌(Exiguobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌(Rhizobium)增施有機肥前后相對豐度無明顯變化，不動桿菌(Acinetobacter)平均相對豐度增施有機肥后明顯降低，施有機肥量50%時，其平均相對豐度為0%。對土壤真菌屬水平的分析表明，土壤真菌不同屬在不同處理下的分布存在較大的差異(圖4 d)，不同處理下的優(yōu)勢屬也各不相同。赤霉菌屬(Gibberella)、亞隔孢殼屬(Didymella)、裂殖壺菌(Schizothecium)屬為主要優(yōu)勢屬，相對豐度在 8.0%～16.5%之間；Kotlabase，Preussia，F(xiàn)usarium屬為次要優(yōu)勢屬，相對豐度在 3.02%～6.5%之間。與CK相比，增施有機肥后Didymella,Schizothecium(裂殖壺菌)、Katabases屬的相對豐度下降，而赤霉菌屬(Gibberella)、內(nèi)生真菌(Preussia)、鐮刀菌(Fusarium)屬在施肥量為75%時其相對豐度最高，分別為17.6%，7.5%，4.4%。

圖3 土壤微生物群落組成Fig.3 Composition of soil microbial community

圖4 土壤微生物群落主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial community

2.4 土壤微生物群落結構

對于土壤細菌來說PCA分析中主成分軸PCA1可以解釋 73.8%的差異，PCA2軸可以解釋 15.8%的群落差異。對于土壤真菌則是第一主成分軸PCA1解釋了40.1%的群落差異，第二主成分軸PCA2解釋了23.6%的群落變化。這一結果表明，細菌群落和真菌群落在不同濃度有機肥處理下的微生物群落均存在差異，其中有機肥對細菌微生物群落結構的影響比真菌更為明顯。

基于非度量多維尺度(Non-metric multidimensional scaling,NMDS)結果如圖5所示，NMDS指數(shù)結果顯示對照和各處理間細菌群落結構明顯不同，顯著性檢驗分析進一步表明細菌群落和真菌群落在對照和各處理之間存在顯著的差異(表3)。施肥明顯改變了細菌群落結構，真菌群落結構受有機肥影響較小。

表3 有機質添加對土壤微生物群落結構作用的顯著性檢驗Table 3 Significance test of the effect of organic matter addition on soil microbial community structure

圖5 基于Bray-curtis距離矩陣的NMDS分析Fig.5 NMDS analysis based on Bray-Curtis distance matrix

3 討論

3.1 施肥對土壤理化性質的影響

施肥是增加土壤肥力的有力措施，其最直接的作用是通過改變土壤養(yǎng)分含量而間接影響牧草生產(chǎn)力和有機質含量。有研究發(fā)現(xiàn)短期施加無機肥可以顯著影響退化羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.)草原土壤速效氮、速效鉀等速效養(yǎng)分的含量，但對土壤全氮、有機質等指標沒有明顯的改變[14]。劉杏蘭等[15]發(fā)現(xiàn)單施有機肥可以顯著增加土壤全氮含量。本研究表明，在50%，75%有機肥施加處理下有助于土壤養(yǎng)分和有機質的積累，且有助于緩解土壤鹽堿化程度，從而對進一步改善土壤養(yǎng)分缺乏、土壤健康狀況和提高牧草產(chǎn)量起促進作用。土壤pH值通過影響土壤溶液中有效離子的濃度來影響植被生長[16]，有機肥可為植被生長提供養(yǎng)分。大量研究證明，長期施加無機肥會導致土壤pH值降低，引起土壤酸化，有機肥替代無機肥可以提高深層土壤的肥效和耐酸性，減緩因單獨施加無機肥產(chǎn)生的土壤酸化趨勢[15,17]。本試驗結果顯示，添加有機肥梯度在50%，75%時可有效緩解土壤鹽堿化程度，使土壤pH值趨于中性，進而提高土壤健康狀況。

3.2 施肥對土壤微生物群落結構與多樣性的影響

3.2.1施肥對土壤微生物豐度和多樣性的影響 土壤中的細菌和真菌通常占土壤微生物總量的90%以上，它們是土壤有機質的分解者和養(yǎng)分動態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑[18]。土壤微生物對于維持土壤肥力和土壤生態(tài)系統(tǒng)功能至關重要，且對肥料敏感[19]。本試驗檢測到細菌OTU數(shù)高于真菌，與楊希智等[20]對高寒地區(qū)土壤微生物的研究結果相一致。有機肥的添加可以顯著改變土壤微生物群落多樣性和豐富度，大量研究結果表明，增施有機肥可以增加土壤中細菌和真菌的多樣性和豐富度[21]。長期施用有機肥會降低土壤真菌多樣性組成，使其向擔子菌門等方向演替進化[22]。這說明隨著不同梯度有機肥的添加，土壤中細菌與真菌的群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)有著不同的變化趨勢，其中細菌的群落多樣性指數(shù)在施有機肥梯度為50%時最大，真菌的群落多樣性在75%梯度下最大。有機肥的添加降低了細菌的豐富度指數(shù)，可能原因是高寒地區(qū)微生物對短期施加有機肥的響應是一個錯綜復雜的動態(tài)響應過程。

3.2.2施肥對土壤微生物群落結構的影響 ‘阿壩’垂穗披堿草根際微生物群落結構在門和屬水平上研究結果表明，在門水平，細菌群落中變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為主要的優(yōu)勢菌門，與學者對草地微生物相關研究結果一致[22-23]。施肥梯度為50%時，明顯增加了放線菌門的數(shù)量。放線菌門作為細菌中占比較大的一類，在相關有機物的分解等重要過程中起著關鍵作用，有研究證明，放線菌可以合成多種與抗病原菌有關的抗生素，保護土壤與根系免受病原菌的侵害[24]。試驗結果顯示，放線菌門對有機肥的敏感性較強，大量的有機肥可能導致放線菌門數(shù)量的減少，而變形菌門和厚壁菌門對有機肥的敏感性弱于放線菌門，在不同施肥梯度下沒有顯著差異。真菌門水平的平均相對豐度明顯低于細菌，子囊菌門為主要優(yōu)勢菌。稀有菌群有擔子菌門、毛霉菌門等。研究已經(jīng)證實，擔子菌門是真菌中最高等的一門，分布極為廣泛，它與植物能形成共生菌根，幫助植物更好的生長[25-26]。增施有機肥后，子囊菌門的相對豐度出現(xiàn)下降，子囊菌門大多為腐生菌，其最適pH值為弱堿性，可能原因是由于施肥導致pH值下降，進而引起子囊菌門減小，可能是由于高寒地區(qū)牧草根際土壤微生物與菜田中微生物對外界環(huán)境變化所作出的應答機制不一樣[27]。而擔子菌門平均相對豐度隨著有機肥的添加，其數(shù)量明顯上升，在施有機肥梯度為50%時，數(shù)量達到最大。當時有機肥為75%時又出現(xiàn)下降趨勢，表明有機肥的添加對擔子菌門的影響較大，一定量的有機肥可以明顯提高擔子菌門的數(shù)量，當有機肥大量投入后引起毛霉菌門等一些有害真菌的滋生，不利于土壤保持健康狀況。

為更深層次明確有機肥肥對高寒地區(qū)土壤微生物群落的影響，本研究進一步對細菌和真菌在屬水平進行群落組成成分比較，土壤中細菌和真菌在屬水平均具有較高的平均相對豐度。在細菌屬水平上，增施有機肥后，不動桿菌屬相對豐度顯著下降，在施有機肥梯度為50%時，不動桿菌為零。大量試驗已經(jīng)證實不動桿菌為病原菌，可能對植株及人體造成不同程度的傷害[28]，一定量的有機肥可以抑制不動桿菌的發(fā)生，改善土壤中微生物生態(tài)。對真菌屬的豐度分析表明，赤霉菌屬、亞隔孢殼屬、裂殖壺菌屬為主要優(yōu)勢菌，赤霉菌可以分泌赤霉素，促進植物莖的生長；亞隔孢殼屬屬于子囊菌綱，是一類腐生菌[29]；裂殖壺菌中二十二碳六烯酸含量高，是一類極具工業(yè)化前景的微生物資源[30]。增施有機肥后，主要優(yōu)勢菌發(fā)生明顯變化，當施肥梯度達到75%時，赤霉菌屬含量明顯上升。亞隔孢殼屬和裂殖壺菌數(shù)隨著不同梯度有機肥的添加，呈現(xiàn)出下降趨勢。Kotlabase，preussia(內(nèi)生真菌屬)和Fusarium(鐮刀菌屬)為次要優(yōu)勢菌，其中內(nèi)生真菌作為一類重要的微生物資源可以在植物體內(nèi)生存又不會傷害植物，大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌可以顯著提高植物抵御鹽脅迫的能力[31]。本試驗得出不同梯度的有機肥處理可以顯著影響內(nèi)生真菌屬相對豐度的變化，當施肥梯度為75%時，內(nèi)生真菌屬平均相對豐度達到最大，這可能是由于有機肥的添加可以為內(nèi)生真菌的繁衍提供適宜的生存環(huán)境，從而促進了內(nèi)生真菌的繁衍。

有機肥劑量不同的土壤中，微生物群落結構也相應出現(xiàn)區(qū)別[32]，β多樣性結果顯示細菌群落結構對不同劑量有機肥的響應比真菌更為敏感，武發(fā)思等[33]研究發(fā)現(xiàn)有機肥對根際土壤細菌群落結構的改變作用明顯，本試驗結果同時發(fā)現(xiàn)細菌群落組成受有機肥劑量的影響較大，其具體的演變進化趨勢是后續(xù)試驗研究的重點。

4 結論

高寒地區(qū)增施有機肥對‘阿壩’垂穗披堿草土壤理化性質和土壤微生物養(yǎng)分有明顯的改善。使用50%有機肥，不僅提高了土壤全氮的含量，降低土壤pH值，還可以顯著增加土壤優(yōu)勢菌放線菌、擔子菌門的相對豐度，明顯抑制了病原菌不動桿菌的相對豐度。添加75%有機肥，可以顯著增加土壤有機質含量，降低pH值，明顯提高真菌屬水平一些促進植物生長發(fā)育的相關菌群赤霉菌屬、內(nèi)生真菌屬等。此研究結果為青藏高原地區(qū)有機肥的推廣提供了理論支撐。