張光輝,孟慶華

(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽(yáng) 712046)

山楂又名山里果、山里紅，落葉喬木，薔薇科山楂屬，主要分布在我國(guó)北方如遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山東、陜西、山西、河南等地。山楂營(yíng)養(yǎng)豐富，富含有機(jī)酸、多糖、維生素C、胡蘿卜素、齊墩果酸、山楂素等三萜類烯酸和黃酮類等。多糖是由單糖分子相互締合而成的有機(jī)高分子化合物，其具有提高免疫力、降血脂、降血壓、抗癌、抗氧化等活性。李丹丹[1]等對(duì)山楂多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定提取溫度90℃、液料比25∶1、提取時(shí)間93 min山楂多糖的得率為53.77%；鐘麗霞[2]等對(duì)山楂多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂作用，其對(duì)胰脂肪酶抑制率、α-葡萄糖苷酶的IC50分別為(22.50±0.79)mg/mL、(99.22±0.89)μg/mL;馬蕾[3]等用不同濃度濃度的多糖溶液處理人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)12 h，發(fā)現(xiàn)其可以顯著增加凋亡細(xì)胞的比例;商飛飛[4]等研究了山楂多糖的組成主要為要單糖組成為半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖醛酸，并發(fā)現(xiàn)鹽洗多糖的體外抗氧化和抗糖化活性明顯強(qiáng)于水洗多糖;鄭朋朋[5]等優(yōu)化了大別山山楂提取工藝條件，通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山楂多糖具有清除羥基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水提醇沉法提取山楂多糖，利用響應(yīng)面軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察不同炮制方法對(duì)山楂多糖含量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

KQ-400KDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州瑞科特儀器設(shè)備有限公司)型MS系列電子天平(梅特勒)；UV1780型紫外可見分光光度計(jì)(上海斯邁歐分析儀器有限公司)；SJIA-10N-50A型冷凍干燥箱(寧波雙嘉儀器有限公司)；DHG-9075A烘箱(吳江市永聯(lián)機(jī)械設(shè)備廠)。

D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào) 110833-201509卡邁舒上海生物科技有限公司)；苯酚(AR)；硫酸(AR)；石油醚(AR)；三氯甲烷(AR)；乙醇(AR)；正丁醇(AR)；山楂(購(gòu)于西安市藥材市場(chǎng)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)專家鑒定符合2015《中國(guó)藥典》一部規(guī)定)。

1.2 山楂多糖的提取純化

將山楂去籽烘干粉碎至粗粉，用10倍體積石油醚回流脫脂3次，每次2 h，常溫自然晾干。稱量脫脂山楂粉20.00 g置于燒杯中，按一定料液比超聲水提取3次，過(guò)濾，合并濾液并減壓濃縮，加入10倍無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜醇沉，抽濾，濾渣冷凍干燥，稱重得山楂粗多糖。稱取山楂粗多糖1.00 g加水溶解，加入5 mL正丁醇，20 mL三氯乙烷40℃水浴震蕩20 min離心，上層清液醇沉抽濾冷凍干燥，得精制山楂多糖。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.0100 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水溶解定容至100 mL容量瓶，得到0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用吸量管移取0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.80 mL分別注入10 mL容量瓶，再加入1.00 mL5%的苯酚、5.00 mL濃硫酸水浴顯色30 min，最后加蒸餾水定容至10 mL，得到不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水按上述方法顯色校正儀器，于490 nm處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=51.45x-0.0096，而R2=0.9974>0.99，表明在1～8 μ g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定山楂多糖含量。準(zhǔn)確稱量25.00 mg山楂多糖純品，溶解定容至50 mL容量瓶，搖勻。移取1.00 mL山楂多糖溶液，按照1.3方法顯色測(cè)定吸光度，按照回歸方程結(jié)合公式(1)計(jì)算多糖含量。

(1)

m精制山楂多糖質(zhì)量，單位g；n稀釋倍數(shù)。

1.5 多糖提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗(yàn) 稱取干燥的生山楂粗粉，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察液固比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、超聲時(shí)間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h)、提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)對(duì)山楂多糖的影響。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選，以液固比(A)、超聲時(shí)間(B)和提取溫度(C)為考察因素，生山楂多糖提取率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，各因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 固液比對(duì)提取率的影響

圖1 固液比對(duì)提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)表明，隨著液固比增加，提取率先逐漸增大，后略有減小，主要原因液固比增大，山楂中的多糖可以盡可能的被浸提出來(lái)，之后減小可能是由于在醇沉?xí)r少部分多糖溶解在水中的原因，故選擇液固比50∶1。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響 單因素實(shí)驗(yàn)表明，隨著超聲時(shí)間增長(zhǎng)，提取率在1.5 h達(dá)到最大，之后提取率變化基本不變，說(shuō)明山楂多糖在1.5 h基本被溶出，故選擇超聲提取時(shí)間為1.5 h。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.3 溫度對(duì)提取率的影響

圖3 溫度對(duì)提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)表明，溫度越高提取率越大，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃之后，提取率基本保持不變，故選擇提取溫度為80 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 表2中17組實(shí)驗(yàn)有5組重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，可用于實(shí)驗(yàn)誤差的估算。依據(jù)響應(yīng)面軟件，以多糖提取率為響應(yīng)值，擬合的多元線性回歸方程：Y=7.68+0.31A+0.28B+0.13C-0.16AB+0.050AC-0.058BC-0.30A2-0.26B2-0.079C2。由表3可知，模型P=0.0009 (P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)意義，失擬項(xiàng)P=0.0013(P<0.01)，說(shuō)明誤差小，擬合度良好。比較各項(xiàng)F值知各因素對(duì)山楂多糖提取率的影響大小為：液固比>超聲時(shí)間>提取溫度。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸分析的結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析 通過(guò)響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)多糖最佳提取工藝為：液固比52.3：1、超聲時(shí)間1.62 h、提取溫度81.1 ℃，多糖提取率為7.79%，各因素對(duì)提取率的響應(yīng)結(jié)果見圖4-6。

圖4 液固比與超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖5 液固比與提取溫度對(duì)提取率的影響

圖6 提取溫度與超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為便于實(shí)驗(yàn)操作，將預(yù)測(cè)工藝修正為：液固比52：1、超聲時(shí)間1.5 h、提取溫度81 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，山楂多糖提取率為7.73%，與預(yù)測(cè)值7.79%接近，表明該工藝方法可行。

2.4 炮制工藝對(duì)山楂多糖含量影響

取山楂炭、焦山楂、炒山楂和生山楂烘干去籽粉碎，按照1.1和1.4方法處理計(jì)算多糖含量，結(jié)果見表4。

表4 炮制工藝與山楂多糖含量關(guān)系

由表4可知，炮制方法不同山楂多糖含量亦有所不同，山楂炭多糖含量最低(3.79%)，生山楂多糖含量最高(7.72%)，主要原因推測(cè)可能是溫度過(guò)高，或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得山楂多糖碳化。

2.5 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn): 移取0.5 mg/L生山楂多糖溶液1份顯色，按1.4方法連續(xù)測(cè)定吸光度6次，計(jì)算得多糖提取率分別為7.67%、7.73%、7.69%、7.70%、7.73%、7.71%，平均值7.71%，RSD=2.34%( n =6)，說(shuō)明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn): 移取0.5 mg/L生山楂多糖溶液1份顯色，按1.4方法每間隔5 min測(cè)定吸光度，計(jì)算得多糖提取率分別為7.69%、7.72%、7.75%、7.69%、7.71%、7.68%，平均值7.71%，RSD=2.58%( n =6)，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn): 移取0.5 mg/L生山楂多糖溶液6份，按1.4方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得多糖提取率分別為7.64%、7.73%、7.75%、7.69%、7.73%、7.68%，平均值7.73%，RSD=3.03%( n =6)，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選，利用響應(yīng)面軟件對(duì)山楂多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：液固比52.3∶1(mL∶g)、超聲時(shí)間1.62 h、提取溫度81.1 ℃，多糖提取率為7.79%，在此條件下，不同炮制山楂多糖提取率分別為：生山楂7.72%、炒山楂6.41%、焦山楂4.92%、山楂炭3.79%。該工藝實(shí)現(xiàn)了山楂多糖的快速準(zhǔn)確測(cè)定，可以作為山楂炮制質(zhì)量控制參考依據(jù)之一。