陳亞霜?肖秀清?王施思?莫泳欣?孫曉渤?鐘肖芬?彭立勝

【摘要】 目的 通過建立髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白抗體相關疾?。∕OGAD）體外脫髓鞘模型探討MOGAD的發(fā)病機制并篩選疾病治療藥物。方法 采用基于轉染細胞的親和層析方法純化患者來源的髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白自身抗體（MOG-IgG）?；诖笫笮∧X切片和神經(jīng)元-少突膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的髓鞘模型，通過MOG-IgG和補體共同作用建立MOGAD體外脫髓鞘模型，將髓鞘堿性蛋白（MBP）的表達量及與神經(jīng)微絲蛋白（NF）共定位情況作為評估髓鞘形成和損傷的指標。分析多發(fā)性硬化促髓鞘再生藥物在該模型中的髓鞘修復作用。結果 應用轉染細胞的親和層析方法可獲得高特異MOG-IgG。經(jīng)抗體補體作用后，MOG-IgG組MBP表達水平降低（P = 0.003），MBP-NF共定位程度降低（P < 0.001）。經(jīng)藥物作用后，氯馬斯汀組和多潘立酮組MBP表達水平上升（P = 0.030，P = 0.001），MBP-NF共定位程度增加（P均< 0.001）。結論 應用該法獲得患者來源的高特異MOG-IgG在補體的參與下直接介導髓鞘損傷。氯馬斯汀和多潘立酮在MOGAD體外脫髓鞘模型中能促進髓鞘再生。

【關鍵詞】 髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白自身抗體;髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白抗體相關疾病;

髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白抗體相關疾病體外脫髓鞘模型;脫髓鞘;髓鞘再生

The establishment and application of MOG-IgG-mediated complement-dependent in vitro demyelination model Chen Yashuang， Xiao Xiuqing， Wang Shisi， Mo Yongxin， Sun Xiaobo， Zhong Xiaofen， Peng Lisheng. Department of Neurology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Lisheng， E-mail： penglsh@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To explore the pathogenic mechanism of myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG（MOG-IgG）associated disorders （MOGAD） and screen the treatment drugs by establishing the MOGAD in vitro demyelination model. Methods The patient-derived MOG-IgG was purified by using the affinity chromatography based on transfected cells. The MOGAD in vitro demyelination model was constructed by the interaction between MOG-IgG and complement based on rat organotypic cerebellar slice and neuron-oligodendrocyte co-culture model. The expression level of myelin basic protein （MBP） and its colocalization with neurofilament protein （NF） were used as indicators to evaluate the myelin formation and injury. The myelin repair effect of drugs that promote the remyelination for multiple sclerosis was evaluated in this demyelination model. Results Highly-specific MOG-IgG was purified by the affinity chromatography based on transfected cells. After the treatment of antibodies and complement， the expression level of MBP and the colocalization degree of MBP-NF were significantly decreased in the MOG-IgG group （P = 0.003， P < 0.001）. After drug treatment， the expression levels of MBP were significantly up-regulated in the clemastine and domperidone groups （P = 0.030， P = 0.001）， and the colocalization degree of MBP-NF was significantly increased in the clemastine and domperidone groups

（both P < 0.001）. Conclusions Highly-specific patient-derived MOG-IgG obtained by this method directly mediates myelin damage with the participation of complement. Clemastine and domperidone can promote the remyelination in this MOGAD in vitro demyelination model.

【Key words】 MOG-IgG; MOGAD; MOGAD in vitro demyelination model; Demyelination; Remyelination

近年來髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（MOG）自身抗體（MOG-IgG）相關中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病成為神經(jīng)免疫疾病領域關注的熱點，髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白抗體相關疾?。∕OGAD）的概念被提出[1-2]。MOGAD 在兒童中的發(fā)病率高于成人，男女比例約為1∶2至1∶1，主要臨床表現(xiàn)包括視神經(jīng)炎、脊髓炎、腦膜炎和腦干腦炎等[3]。目前推測MOG-IgG介導的髓鞘脫失是MOGAD發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素，但因缺乏患者來源的MOG單克隆抗體，MOG-IgG的致病性仍未明確。

本課題組采用基于轉染細胞的親和層析方法純化患者來源的高特異MOG-IgG，在此基礎上建立MOGAD體外脫髓鞘模型，探討目前用于多發(fā)性硬化（MS）促髓鞘再生的臨床實驗藥物在該模型中的髓鞘修復作用，為研究MOGAD治療藥物提供新思路。

材料與方法

一、主要實驗材料

1.實驗動物

出生0～2 d和7 d的SD大鼠，孕15 d的SD大鼠。實驗動物均購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

2.主要試劑及其配制

腦片培養(yǎng)基：50%MEM培養(yǎng)基、25%熱滅活馬血清、25%Hanks平衡鹽溶液（HBSS）、

6.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、1%青鏈霉素。 神經(jīng)元培養(yǎng)基（NBM培養(yǎng)基）：Neurobasal、2% B27、0.25%谷氨酰胺、0.5%青鏈霉素。神經(jīng)元-少突膠質(zhì)細胞（OL）共培養(yǎng)培養(yǎng)基（BME培養(yǎng)基）：BME、1% ITS、0.5%胎牛血清、4.5 mg/mL D-葡萄糖、1%谷氨酰胺、0.5%青鏈霉素。Control-IgG （健康人血清總IgG，10 mg/mL），MOG-IgG（基于轉染細胞的親和層析方法獲得的患者來源特異結合大鼠MOG的抗體，2.7 mg/mL），患者血清總IgG （識別大鼠MOG的患者血清總IgG，10 mg/mL），人源化8-18-C5單抗（100 μg/mL，該抗體的可變區(qū)序列由Markus Reindl教授饋贈），人補體。MBP抗體（Proteintech），β-actin抗體（Boster），NF抗體

（Aves Lab），山羊抗兔HRP二抗、山羊抗鼠HRP二抗（Proteintech），山羊抗兔-488熒光二抗、山羊抗雞-546熒光二抗（Invitrogen）。喹硫平、奧利索西、氯馬斯汀、多潘立酮均購自MCE公司。

二、實驗方法

純化患者來源的MOG-IgG，通過MOG-IgG和補體共同作用建立MOGAD體外脫髓鞘模型，應用該模型進行MOGAD促髓鞘再生藥物研究。本研究已獲中山大學動物倫理委員會審批（批件號：SYsu-iacuc-f3-21-0301）。

1.患者來源特異性結合大鼠MOG抗原的抗體制備

從MOG-IgG陽性患者血清中篩選出識別大鼠MOG的血清，經(jīng)20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）稀釋后與轉染并表達大鼠MOG的細胞于培養(yǎng)皿孵育1 h，后加入0.1 mol/L Glycine-HCl洗脫液（pH 2.7）洗脫下結合的抗體，再用1 mol/L Tris-HCl中和液（pH 9.0）中和。進一步采用Protein A親和層析方法分離純化抗體，脫鹽，濃縮。

2.大鼠小腦切片髓鞘模型的建立

參考文獻[4]的方法，選用出生7 d的SD大鼠，于無菌環(huán)境下剝離出小腦并撕去腦膜，使用振動切片機沿矢狀面切割小腦，將小腦切片種到Transwell小室中，記為第0日。

3.大鼠皮層神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)的細胞髓鞘模型的建立

參考文獻[5]的方法，取孕15 d的SD大鼠用于神經(jīng)元培養(yǎng)，于無菌環(huán)境下剝離并消化胚胎大腦皮層，將細胞接種至24孔板（8×104個細胞/孔），記為第0日。取出生0～2 d SD大鼠用于培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）。神經(jīng)元培養(yǎng)至第21日時，將OPC添加至24孔板里（6×104個細胞/孔），記為共培養(yǎng)的第0日。

4.脫髓鞘模型的建立及藥物篩選

小腦切片培養(yǎng)至第7日時更換損傷培養(yǎng)基（健康對照組、患者總IgG組、MOG-IgG組、8-18-C5組：10%相應抗體+10%補體+80%腦片培養(yǎng)基）作用24 h，第8日收集組織樣本。篩選4種目前用于MS促髓鞘再生的臨床試驗藥物：喹硫平、奧利索西、氯馬斯汀、多潘立酮[6-7]。為檢測上述藥物在該模型狀態(tài)下的髓鞘修復作用，Control-IgG或MOG-IgG與補體損傷作用24 h后更換修復培養(yǎng)基[健康組：腦片培養(yǎng)基;對照組：腦片培養(yǎng)基（損傷后不給藥）;實驗組：含不同濃度藥物的腦片培養(yǎng)基]，第11日收集組織樣本。

神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)的第14日更換損傷培養(yǎng)基（健康對照組、MOG-IgG組：10%相應抗體+10%補體+ 80% BME培養(yǎng)基）作用24 h，共培養(yǎng)第15日固定細胞爬片。為檢測經(jīng)小腦切片模型驗證有效的髓鞘再生藥物對神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)的脫髓鞘模型的髓鞘修復作用，Control-IgG或MOG-IgG與補體損傷作用24 h后更換修復培養(yǎng)基[健康組：BME培養(yǎng)基;對照組：BME培養(yǎng)基（損傷后不給藥）;實驗組：含不同濃度藥物的BME培養(yǎng)基]，共培養(yǎng)第30日固定細胞爬片。

5.蛋白免疫印跡法

小腦切片組織裂解后，行SDS-PAGE凝膠電泳、半干法轉膜，用3%脫脂牛奶封閉，分別作用于相應的一抗（MBP：1∶1000;β-actin：1∶2000）和二抗（1∶2000）。用化學發(fā)光成像儀成像。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，對MBP的相對表達量進行統(tǒng)計分析。

6.免疫熒光法

小腦切片經(jīng)4%多聚甲醛固定1 h，1% TritonX-100通透20 min，10%山羊血清+0.25% TritionX-100封閉1 h，分別作用于相應的一抗（MBP抗體：1∶400;NF抗體：1∶800）和熒光二抗（1∶500）。細胞經(jīng)3%多聚甲醛固定20 min，0.3% TritonX-100通透20 min，10%山羊血清+ 0.1% TritionX-100封閉1 h，分別作用于相應的一抗（MBP抗體：1∶400;NF抗體：1∶800）和熒光二抗（1∶500）。用共聚焦顯微鏡拍照。用ImageJ軟件進行共定位分析。

三、統(tǒng)計學處理

用GraphPad Prism 9.0軟件分析數(shù)據(jù)并繪圖，數(shù)據(jù)以? 表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較用Dunnett法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者來源特異性結合大鼠MOG的抗體制備結果

本研究基于大鼠小腦切片和神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)的髓鞘模型，為避免抗體識別抗原可能的種屬特異性，將人和大鼠MOG進行氨基酸序列比對，結果顯示，人和大鼠MOG同源性為88.99%。進一步分析110例MOG-IgG陽性患者血清，其中僅20例可識別大鼠MOG。為精確反應MOG-IgG的致病性，建立基于轉染細胞的親和層析方法純化抗體（圖1A），構建綠色熒光蛋白（GFP）表達質(zhì)粒和大鼠MOG表達質(zhì)粒，將識別大鼠MOG的血清（10 mL，25 mg/mL，滴度1∶100）與共轉染上述2種質(zhì)粒的細胞孵育結合并洗脫得到識別大鼠MOG的IgG（rMOG-IgG），再用Protein A親和層析方法進一步純化，進而濃縮得到高特異識別大鼠MOG的IgG （1 mL，2.7 mg/mL，滴度1∶320），經(jīng)本方法純化后的MOG-IgG相對滴度提高約30倍（圖1B）。

二、MOG-IgG在補體參與下直接介導髓鞘損傷

采用小腦切片髓鞘模型研究MOG-IgG的致病性，小腦切片各組MBP表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F = 27.600，P < 0.001），與健康對照組相比，患者總IgG組、MOG-IgG組、8-18-C5組MBP表達水平均降低（P = 0.009，P < 0.001，P < 0.001），提示患者總IgG、MOG-IgG和人源化8-18-C5單抗在補體協(xié)同作用下均可造成髓鞘損傷（圖2A～C）。小腦切片免疫熒光結果顯示，與健康對照組相比，MOG-IgG組MBP-NF共定位區(qū)域減少（t = 9.496，P < 0.001）（圖2E、F），表明MOG-IgG在補體參與下直接介導髓鞘損傷。進一步應用神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)的細胞髓鞘模型驗證該結果，與健康對照組相比，MOG-IgG組MBP-NF共定位區(qū)域減少（t = 12.090，P < 0.001）（圖2D、G、H）。上述結果均表明MOG-IgG在補體參與下直接介導髓鞘損傷。

三、氯馬斯汀和多潘立酮在MOGAD體外脫髓鞘模型中顯著促進髓鞘再生

小腦切片損傷后給藥，與對照組相比，氯馬斯汀和多潘立酮組中MBP表達水平升高（圖3A）。經(jīng)不同濃度氯馬斯汀、多潘立酮作用，小腦切片各組MBP表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F = 9.009，P = 0.002;F = 8.675，P = 0.001）。與對照組相比，100 nmol/L氯馬斯汀組MBP表達水平升高（P = 0.030），500 nmol/L、1 μmol/L氯馬斯汀組差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.212，P = 0.697）（圖3B）;100 nmol/L多潘立酮組MBP表達水平升高（P = 0.001），20 nmol/L、500 nmol/L、2.5 μmol/L

多潘立酮組比較差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.574、0.230、0.997）（圖3C）。上述結果表明，100 nmol/L氯馬斯汀和100 nmol/L多潘立酮在小腦切片MOGAD體外脫髓鞘模型中促進髓鞘再生，故后續(xù)實驗均選用100 nmol/L作為氯馬斯汀和多潘立酮的給藥濃度。

小腦切片脫髓鞘模型、神經(jīng)元-OL共培養(yǎng)脫髓鞘模型給藥后的免疫熒光結果顯示，各組髓鞘形成指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（F = 24.320，P < 0.001;F = 23.73，P < 0.001），與對照組相比，分別給予100 nmol/L氯馬斯汀和100 nmol/L多潘立酮后，MBP-NF共定位區(qū)域均增多（P均< 0.001）（圖4）。上述結果均表明，在MOGAD體外脫髓鞘模型中，100 nmol/L氯馬斯汀、100 nmol/L多潘立酮均促進髓鞘再生。

討 論

人MOG特異表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)OL胞膜上，參與髓鞘黏附、細胞表面的相互作用。MOG-IgG只結合定位在細胞膜上具有天然構象的MOG抗原，具有不同表位和高度的免疫原性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病中重要的自身免疫抗體和細胞免疫反應的靶點[8-9]。2011年Mader等[10]報道MOG-IgG陽性患者的IgG在體外過表達MOG的HEK293細胞中產(chǎn)生補體依賴的細胞毒。2017年Peschl等[11]證實MOG-IgG陽性患者的IgG在體外培養(yǎng)的小腦切片中產(chǎn)生補體依賴的細胞毒并導致髓鞘損傷。這些研究多采用患者來源的總IgG，MOG-IgG僅是其中的一部分，且患者來源的總IgG可能還伴有其他自身免疫抗體，因此獲得高特異的MOG-IgG對研究其致病性至關重要。

MOGAD是近年來提出的一種免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，已受到廣泛關注，建立MOGAD體外脫髓鞘模型對研究該疾病發(fā)病機制具有重要意義。髓鞘再生一直是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的熱點和難點，髓鞘再生受阻主要原因是脫髓鞘區(qū)域的OPC不能分化為成熟的OL[12-13]。因此，越來越多的研究者致力于尋找能夠促進OPC分化與髓鞘再生的小分子化合物，或者是能夠干預上述過程的信號通路[14-15]。Mei等[14]發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀顯著促進OPC分化和髓鞘形成，也有臨床研究表明氯馬斯汀可改善由MS引起的慢性脫髓鞘癥狀，提示該藥物在脫髓鞘疾病中有廣闊的應用前景[16]。多潘立酮是D2/D3多巴胺受體拮抗劑，可促進催乳素的分泌，催乳素在髓鞘修復過程中發(fā)揮重要作用，因此多潘立酮被認為是髓鞘再生治療的潛在藥物[17]。

本研究采用基于轉染細胞的親和層析方法，純化患者來源高特異的MOG-IgG，并證實MOG-IgG在補體協(xié)同參與下直接介導髓鞘損傷，由此建立MOGAD體外脫髓鞘模型，發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀和多潘立酮在該模型中顯著促進髓鞘再生。然而本研究也有一定局限性，缺少動物體內(nèi)實驗，MOG-IgG結合補體介導脫髓鞘損傷作用機制、氯馬斯汀和多潘立酮促進MOGAD體外脫髓鞘模型髓鞘再生的具體機制尚需進一步深入研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-10-08）

（本文編輯：洪悅民）