吳一凡，鐘楚夢(mèng)，柳麗娜，陳 勝，魯勇波，謝錦忠*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2.安吉縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 安吉 313300； 3.余姚市紫云閣生態(tài)農(nóng)莊，浙江 余姚 315400)

竹子具有重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛分布在亞太、美洲和非洲地區(qū)，全球面積超過(guò)3 000萬(wàn)hm2。近年來(lái)全球森林面積逐漸減少，但竹林面積卻不降反升[1]，竹材被公認(rèn)為是1種巨大的可再生綠色資源。其富含纖維素且生長(zhǎng)迅速，可作為替代木材、稻草等栽培食用菌的新型碳源。傳統(tǒng)的蘑菇堆肥主要為農(nóng)作物秸稈與各種氮源混合堆制[2]，竹材含較多微生物難分解的硅和蠟質(zhì)，在自然條件下難以被降解，需要經(jīng)粉碎后堆制發(fā)酵才容易被微生物利用。已有研究表明，竹屑發(fā)酵后可被用于栽培竹蓀(Dictyophoraindusiata)、平菇(Pleurotusostreatus)、秀珍菇(P.geesteranus)等食用菌[3-4]，發(fā)酵栽培食用菌是最有效、最經(jīng)濟(jì)利用木質(zhì)纖維材料的生物手段之一。大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)富含蛋白質(zhì)、多糖，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并具有較強(qiáng)的生物學(xué)效率與抗逆性，是聯(lián)合國(guó)向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的10個(gè)食用菌之一[5]，其適宜栽培地區(qū)與全球竹資源的分布高度匹配，因此利用竹屑栽培大球蓋菇具有良好的應(yīng)用前景。

氮素是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸和幾丁質(zhì)(殼多糖)的主要成分，竹屑含氮量偏低，需補(bǔ)充合適的氮源才能適宜食用菌栽培，吳一凡等[6]研究表明竹屑添加8%的麥麩調(diào)節(jié)竹屑初始C/N為100后發(fā)酵栽培大球蓋菇生物學(xué)效率和品質(zhì)最高，過(guò)高的有機(jī)氮添加會(huì)抑制竹屑發(fā)酵與大球蓋菇生長(zhǎng)。孫萌[7]通過(guò)對(duì)大球蓋菇胞外酶活性的測(cè)定，研究得出黃豆粉為最佳氮源；武旭等[8]研究表明母種培養(yǎng)基添加15%～20%麥麩利于大球蓋菇菌絲密度、均勻度、長(zhǎng)勢(shì)、平均生長(zhǎng)速度的提高。施用不同的氮源對(duì)栽培料的堆制發(fā)酵具有顯著影響[9-10]，并能直接影響食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育，選擇合適的氮源能夠直接提高堆體的腐熟程度以及食用菌的生物學(xué)效率和品質(zhì)[11]，但關(guān)于不同氮源對(duì)竹屑發(fā)酵以及大球蓋菇栽培的研究較少，缺乏對(duì)其最佳氮源的篩選與驗(yàn)證。該研究以尿素、麥麩、玉米粉和菜籽餅這4種常見的有機(jī)氮源作為添加，旨在探討不同氮源添加下竹屑好氧堆肥后的理化性質(zhì)及其接種大球蓋菇的菌絲生長(zhǎng)情況，并分析其之間的相關(guān)性，為竹屑的基質(zhì)化利用和大球蓋菇的推廣種植提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

2021年3月15日在杭州市富陽(yáng)區(qū)中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所虎山林區(qū)內(nèi)進(jìn)行不同氮源添加的竹屑堆肥試驗(yàn)。竹屑來(lái)自于杭州市富陽(yáng)區(qū)永昌鎮(zhèn)，為毛竹(Phyllostachysedulis)粗加工下腳料。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理(表1)，以不添加氮源的純竹屑作為對(duì)照(CK)，以尿素、 麥麩、 玉米粉和菜籽餅4種常見食用菌有機(jī)氮源作T1、T2、T3和T4處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將不同基質(zhì)配比的竹屑翻拌均勻，添加水分使其含水量均在65%，置于內(nèi)徑67.5 cm×48.0 cm×41.0 cm的泡沫箱內(nèi)進(jìn)行好氧堆肥。在第10 d和第20 d分別進(jìn)行翻堆補(bǔ)水至含水量65%，使其再次發(fā)酵。第40 d各個(gè)處理溫度趨于環(huán)境溫度，且翻堆補(bǔ)水后溫度不再上升時(shí)結(jié)束發(fā)酵。在發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行取樣，一部分樣品風(fēng)干后粉碎，用于理化性質(zhì)的測(cè)定；另一部分鮮樣用于測(cè)定大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)速度與生長(zhǎng)勢(shì)。

表1 不同氮源添加處理Tab.1 Different nitrogen sources addition treatment

1.2 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 365進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，采用Origin 2019進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，顯著性水平為P<0.05。

1.2.1理化指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)期間，于每天16:00用溫度計(jì)測(cè)定堆體表層下方25 cm深處的竹屑發(fā)酵溫度。將V(樣品)∶V(蒸餾水)=1∶5的體積混合，再經(jīng)振蕩后靜止30 min，用EC計(jì)測(cè)定電導(dǎo)率，用pH計(jì)測(cè)定pH值。竹屑容重、總孔隙度、通氣孔隙度、持水孔隙度均采用環(huán)刀法測(cè)定[12]。全氮采用定氮儀(YLSZJ-SB-007)測(cè)定，總有機(jī)碳采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定?？扇苄蕴遣捎幂焱壬y(cè)定，全磷和全鉀采用等離子發(fā)射光譜法測(cè)定，水解性氮采用堿擴(kuò)散法測(cè)定。

1.2.2菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定 取各處理的等量250 g發(fā)酵竹屑置于內(nèi)徑12 cm高10 cm帶透氣孔的玻璃瓶中，每個(gè)接種2 g大球蓋菇原種后置于24 ℃恒溫培養(yǎng)30 d，每天觀察記錄菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹屑發(fā)酵過(guò)程中的溫度變化

有機(jī)物料在放線菌等微生物的活動(dòng)下會(huì)產(chǎn)生高溫，堆體的溫度可以評(píng)價(jià)堆肥的效果，高溫能殺死堆體中的病原微生物促進(jìn)物料分解。由圖1可知，對(duì)照組CK和添加尿素的處理無(wú)法達(dá)到有效發(fā)酵高溫(>50 ℃)。玉米粉處理在第3 d達(dá)到最高溫(55.4 ℃)，但高溫期持續(xù)時(shí)間較短(3 d)，在第5 d溫度出現(xiàn)明顯下降，且第一次翻堆后無(wú)法再次達(dá)到有效腐熟高溫(>50 ℃)。麥麩處理在第4 d達(dá)到了最高溫度(54.8 ℃)，高溫期共持續(xù)了8 d。菜籽餅在第3 d達(dá)到了最高溫度(58.5 ℃)，總高溫期持續(xù)最長(zhǎng)(14 d)。第一次翻堆后僅麥麩和菜籽餅處理能夠再次達(dá)到50 ℃以上，第二次翻堆后麥麩和菜籽餅處理的溫度最高分別達(dá)到39.3 ℃和48.3 ℃，未能達(dá)到50 ℃以上的發(fā)酵高溫，40 d時(shí)各處理的溫度趨于穩(wěn)定，物料基本分解完畢，發(fā)酵進(jìn)程基本結(jié)束。綜上，純竹屑自身缺乏氮源無(wú)法達(dá)到有效腐熟高溫，添加麥麩和菜籽餅的處理能達(dá)到有效腐熟高溫并持續(xù)8 d以上。

圖1 各處理基質(zhì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度變化Fig.1 Temperature change during fermentation of each treatment

2.2 不同氮源對(duì)竹屑發(fā)酵后物理性質(zhì)的影響

分析不同處理竹屑堆制后的物理性質(zhì)，由表2可知，各處理之間的容重、通氣孔隙度無(wú)顯著差異(P>0.05)，均在0.152～0.167 g·cm-3和49.70%～56.60%之間。對(duì)照組CK的持水孔隙度顯著(P<0.05)低于添加麥麩和菜籽餅的處理，但與添加尿素、玉米粉的處理之間無(wú)顯著差異。添加菜籽餅的處理持水孔隙度最高達(dá)到了27.97%，顯著高于其他處理。CK的總孔隙度顯著低于添加麥麩、玉米粉和菜籽餅的處理，但與添加尿素的處理無(wú)顯著差異。添加麥麩、玉米粉和菜籽餅3個(gè)處理之間的總孔隙度無(wú)顯著差異，均在76.13%～78.20%之間。添加菜籽餅處理的氣水比最低，顯著低于對(duì)照組CK，為1.8。綜上，添加氮源顯著提高了竹屑發(fā)酵后的持水孔隙度，降低氣水比，增加竹屑的持水性，對(duì)容重和通氣孔隙度無(wú)顯著影響，不同氮源的影響效果不同。

表2 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的物理性質(zhì)Tab.2 Physical properties of bamboo sawdust with different nitrogen sources

2.3 不同氮源處理對(duì)竹屑發(fā)酵后pH和EC的影響

pH反映了物料的酸堿性，是影響微生物活動(dòng)的重要因素之一，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制微生物活動(dòng)和有機(jī)物的分解。由表3可知， 各處理pH均在6.21～6.62之間呈弱酸性。添加玉米粉處理的pH顯著高于CK，菜籽餅和麥麩處理的pH顯著低于CK，尿素處理的pH與CK無(wú)顯著差異。EC表示了堆體中可溶性鹽的含量，包括無(wú)機(jī)鹽及有機(jī)酸鹽等。過(guò)高的EC會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生毒害。由表3可知，各處理EC均在212.00～394.00 us·cm-1之間，尿素處理的EC與CK無(wú)顯著差異，均顯著低于其他3個(gè)處理。麥麩處理的EC最高，菜籽餅次之，分別達(dá)到了394.00和301.00 us·cm-1。綜上，添加氮源能顯著降低堆體的pH，提高EC，不同氮源改變的程度存在差異。

表3 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的pH和ECTab.3 pH and EC after bamboo sawdust fermentation with different nitrogen sources

2.4 不同氮源處理對(duì)竹屑發(fā)酵后養(yǎng)分的影響

由表4可知，添加尿素處理的全氮和水解性氮顯著高于CK，碳氮比和全鉀顯著低于CK，其他養(yǎng)分含量與CK無(wú)顯著差異。添加麥麩、玉米粉和菜籽餅發(fā)酵后，能顯著提高培養(yǎng)料的全氮、全磷、全鉀和可溶性糖含量，降低碳氮比。其中添加菜籽餅處理的有機(jī)碳含量和碳氮比最低，分別為43.25%和44.02，顯著低于其他處理；全氮、水解性氮和可溶性糖含量最高，分別為0.99%、733.00 mg·kg-1和0.82%，顯著高于其他處理。添加麥麩處理的全磷含量達(dá)到了12.35%，顯著高于其他處理，添加麥麩和菜籽餅的處理在全鉀含量上無(wú)顯著差異，均為0.25%，顯著高于其他處理。

表4 竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的養(yǎng)分含量Tab.4 Nutrient content after bamboo sawdust fermentation with different nitrogen sources

綜上，添加氮源能夠顯著提高竹屑的全氮、全磷、全鉀、水解性氮和可溶性糖含量，降低有機(jī)碳含量和碳氮比，添加不同有機(jī)氮源所提高的養(yǎng)分含量不同。

2.5 不同氮源處理對(duì)竹屑發(fā)酵后大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)的影響

利用各處理的培養(yǎng)料接種大球蓋菇，由表5可知，無(wú)氮源添加的純竹屑CK處理的菌絲纖細(xì)柔弱，生長(zhǎng)速度最慢，僅為1.84 mm·d-1。添加氮源處理的各處理菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)均顯著高于CK。添加尿素、麥麩和玉米粉3個(gè)處理的菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，均在2.67～2.73 mm·d-1之間。添加菜籽餅處理的菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到了3.24 mm·d-1，顯著高于其他氮源添加處理，且長(zhǎng)勢(shì)最佳，菌絲潔白粗壯且濃密?？梢姡裥继砑拥窗l(fā)酵后能顯著提高大球蓋菇菌絲的生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)，可縮短大球蓋菇栽培種的培養(yǎng)時(shí)間，一般500 g規(guī)格栽培種只需要培養(yǎng)35 d即可用于生產(chǎn)。

表5 不同處理大球蓋菇菌絲的生長(zhǎng)情況Tab.5 Mycelial growth of S. rugosoannulata under different treatments

2.6 菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)與堆體理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

對(duì)菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)與堆體的物理性質(zhì)、養(yǎng)分要素分別進(jìn)行相關(guān)性分析。由圖2可知，在物理性質(zhì)要素中，菌絲生長(zhǎng)速度與持水孔隙度、總孔隙度和氣水比呈極顯著相關(guān)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)與持水孔隙度和氣水比呈極顯著相關(guān)，與pH呈顯著相關(guān)。在養(yǎng)分要素中，菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)均與全氮、水解性氮、可溶性糖、C/N呈極顯著相關(guān)，與其他指標(biāo)弱相關(guān)。

圖2 菌絲生長(zhǎng)指標(biāo)與堆體理化性質(zhì)的相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat map of correlation between mycelial growth index and properties of bamboo sawdust說(shuō)明：**代表相關(guān)性極顯著(P<0.01)，*代表相關(guān)性顯著(P<0.05)。Note: **indicated extremely significant difference (P<0.01), *indicated significant difference (P<0.05).

3 討論與結(jié)果

氮是影響微生物活動(dòng)的關(guān)鍵，竹屑添加氮源調(diào)節(jié)碳氮比能促進(jìn)堆體的發(fā)酵腐熟，改善物料的理化性質(zhì)，適宜大球蓋菇生長(zhǎng)[13]。溫度是判斷發(fā)酵腐熟程度的直觀指標(biāo)，試驗(yàn)中麥麩和菜籽餅的處理均達(dá)到了有效腐熟標(biāo)準(zhǔn)(50 ℃≥7 d)，但麥麩處理到達(dá)高溫后溫度下降較快，菜籽餅溫度下降速度相對(duì)較慢，可能是因?yàn)辂滬熖幚淼奶砑恿枯^大，孔隙度大，熱量易散失。尿素和玉米粉處理無(wú)法達(dá)到有效發(fā)酵高溫，可能是因?yàn)樘砑拥馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，呈粉末狀溶于水后易流失，同時(shí)尿素作為非蛋白氮源會(huì)抑制微生物的活動(dòng)[14]。

孔隙度是判斷發(fā)酵效果和決定菌絲生長(zhǎng)的重要物理指標(biāo)，竹屑的蠟質(zhì)導(dǎo)致其持水性較差，發(fā)酵能夠增大竹屑的持水孔隙度，提升培養(yǎng)料的持水性[13]。菜籽餅添加處理的持水孔隙度最高(27.97%)，氣水比(1.80)顯著低于CK，說(shuō)明發(fā)酵腐熟效果較好，這與用溫度判斷的結(jié)果相一致，但與稻草、農(nóng)作物秸稈、菇渣等基質(zhì)的持水性相比仍然較低[15]。相關(guān)性分析表明，總孔隙度與菌絲生長(zhǎng)速度呈極顯著正相關(guān)，持水孔隙度與菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)均呈極顯著正相關(guān)。這說(shuō)明食用菌菌絲體的生長(zhǎng)需要培養(yǎng)料良好的透氣與持水能力，持水性是制約竹屑用作食用菌基質(zhì)的關(guān)鍵因素，如何提高竹屑的持水性，使其適用于食用菌栽培，有待進(jìn)一步研究。

竹屑發(fā)酵能夠降低堆體的pH，增大EC[16]。大球蓋菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)榇笄蛏w菇適宜在弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，這與閆培生等利用PDA培養(yǎng)基試驗(yàn)得出大球蓋菇最適宜pH為6～7的結(jié)果基本一致[17]。EC與菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)呈弱相關(guān)，說(shuō)明大球蓋菇在試驗(yàn)范圍(212.00～394.00 us·cm-1)內(nèi)均可正常生長(zhǎng)，未產(chǎn)生明顯毒害或抑制現(xiàn)象。

發(fā)酵將大分子有機(jī)物分解，形成腐殖質(zhì)，改善物料的養(yǎng)分條件。大球蓋菇生長(zhǎng)指標(biāo)與堆體的有機(jī)碳、全磷、全鉀含量弱相關(guān)，這說(shuō)明在各處理的全磷(1.48%～12.35%)和全鉀(0.15%～0.25%)范圍內(nèi)對(duì)大球蓋菇生長(zhǎng)不構(gòu)成限制或促進(jìn)作用。菌絲生長(zhǎng)狀況最好的菜籽餅處理后的竹屑可溶性糖含量最高，顯著高于其他處理；同時(shí)可溶性糖與大球蓋菇菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度極顯著正相關(guān)，這可能是因?yàn)榭扇苄蕴亲鳛橐妆焕玫奶?，給予大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)的啟動(dòng)營(yíng)養(yǎng)，從而促進(jìn)大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)。C/N是食用菌培養(yǎng)料關(guān)鍵，同時(shí)也是判斷發(fā)酵腐熟程度的有效值指標(biāo)[10]，不同食用菌對(duì)C/N的適應(yīng)性不同[18-19]。添加菜籽餅處理的有效高溫時(shí)間最長(zhǎng)，微生物活動(dòng)最強(qiáng)烈，終止發(fā)酵時(shí)其C/N最低(44.02)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速度最佳。相關(guān)性分析表明，大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)與C/N呈極顯著負(fù)相關(guān)，與全氮和水解性氮呈極顯著正相關(guān)。這與繆曉丹等[20]利用谷殼、稻草和廢菌糠復(fù)配得出相似的結(jié)論，C/N為48.37的配方擁有最高的生物學(xué)效率和蛋白質(zhì)含量。

該實(shí)驗(yàn)測(cè)定了竹屑添加不同氮源發(fā)酵后的理化性質(zhì)，并接種大球蓋菇進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，吳一凡等[6]研究表明大球蓋菇的菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)與產(chǎn)量品質(zhì)呈顯著正相關(guān)。未來(lái)可進(jìn)行栽培試驗(yàn)，進(jìn)一步研究大球蓋菇的營(yíng)養(yǎng)生理，驗(yàn)證不同氮源與大球蓋菇產(chǎn)量、品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性。

綜上，竹屑作為大球蓋菇基質(zhì)的最佳發(fā)酵添加氮源是菜籽餅，添加4%菜籽餅的竹屑發(fā)酵過(guò)程中有最長(zhǎng)的有效高溫(>50 ℃，14 d)，并建議堆制28 d以上。添加菜籽餅發(fā)酵后的竹屑持水性、全氮、水解性氮和可溶性糖含量顯著高于其他處理，C/N為44.02，接種大球蓋菇后菌絲潔白粗壯長(zhǎng)勢(shì)最佳，生長(zhǎng)速度最快(3.24 mm·d-1)。