馮建海，李麗萍，李勝英

（河池學院 化學與生物工程學院，廣西 宜州 546300）

碳量子點是一種新型的熒光碳納米材料，一般情況下粒徑小于10 nm，因其較低的制備成本、良好的光學性能、易修飾的表面、良好的生物相容性以及較低的細胞毒性等優(yōu)點，在生物成像、熒光探針和藥物分析等領域得到了廣泛的應用[1-6]。目前研究者建立了多種制備碳量子點的方法[7-13]，如電弧放電法、電化學法、化學氧化法、超聲處理和微波輻射法、激光刻蝕法和水熱法。其中水熱法被認為是操作較簡單又高效的制備方法，具有可控性和調變性。因此本試驗選用水熱法制備碳量子點。

鏈霉素是氨基糖苷類抗生素，具有廣譜抗菌性，目前已經廣泛應用于畜牧獸醫(yī)農業(yè)領域[14-15]。同時鏈霉素具有耳毒性和腎毒性，因此它在動植物性食品中的殘留已經引起了國內外的廣泛關注。鏈霉素的檢測方法有液相色譜法[16-17]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[18]和色譜-質譜串聯(lián)法[19-20]，這些儀器分析法準確度高，但是這些檢測方法操作較復雜，測定樣品前要進行預處理，而同時這些方法耗費相對太高，操作過于繁瑣，不能快速進行檢測，所以不適于大量樣品的快速檢測。目前以碳量子點為熒光探針測定鏈霉素殘留的研究較少，但近年來以碳量子點作為熒光探針對藥物進行檢測與分析的試驗結果都充分體現了碳量子點在此領域的應用前景以及熒光分析方法的可靠性。元曉云等[21]基于鏈霉素使CdTe量子點的熒光發(fā)生變化的特性，建立測定鏈霉素含量的分析方法，并成功用于黃瓜中鏈霉素殘留量的檢測。

本試驗在相關研究的基礎上，以水為溶劑，葡萄糖與半胱氨酸為原料，用水熱法制備有良好熒光效果的碳點，利用鏈霉素與碳量子點的配位結合，改變量子點的熒光強度。根據熒光強度變化與鏈霉素濃度的關系，建立測定鏈霉素含量的熒光分析法，并對測定條件進行優(yōu)化，對提高測定藥品，動植物等食品中鏈霉素含量的結果準確性、可靠性具有較強的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-半胱氨酸（生化試劑）、葡萄糖（分析純）、Fe（NO3）3·9H2O（分析純）、鏈霉素（生化試劑）：天津市光復精細化工研究所；NaH2PO4·2H2O（分析純）、Na2HPO4·12H2O（分析純）：西隴科學股份有限公司；Mg（NO3）2·6H2O（分析純）：天津市化學試劑三廠；淀粉（藥典級）：九鼎化學科技有限公司；糊精（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；鏈霉素（標準品）：阿達瑪斯試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

熒光分光光度計（LS-45/55）：鉑金埃爾默科技有限公司；紫外可見分光光度計（Agilent8453）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機（KQ-2200B）：鞏義市予華儀器有限責任公司；干燥箱（DZF-6050）：上海齊欣科學儀器有限公司；超純水機（DISCV-I-18）：成都艾柯水處理設備有限公司；三用紫外分析儀（ZF-1）：杭州齊威儀器有限公司；低速離心機（KA-1000C）：上海安亭科學儀器；電子天平（FA1004B）：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 碳量子點的制備與篩選

將0.5 g葡萄糖和一定量L-半胱氨酸溶于20 mL蒸餾水中，30℃超聲（1 800 W）10 min，溶解分散后轉至反應釜在烘箱中180℃反應12 h，反應完后溶液冷卻，用0.22 μm的過濾頭過濾，除去大顆粒物，沉淀離心后，取出上清液，放入透析袋透析24 h，透析期間不斷換蒸餾水。透析后碳點溶液通過分子熒光光譜測定碳量子點溶液的熒光強度。

改變 L-半胱氨酸添加量（0、0.1、0.2、0.3 g）研究其對碳量子點溶液熒光強度的影響。

1.3.2 激發(fā)波長的選擇

在25℃下，將碳量子點溶液倒入四面透光石英比色皿中，改變激發(fā)波長（360 nm～500 nm），激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，測定量子點的熒光強度，確定最優(yōu)激發(fā)波長。

1.3.3 碳點用量的選擇

移取一定量的碳量子點（0.5、1.0、1.5 mL）溶液至5 mL容量瓶中，再加入1 mL 1×10-6mol/L的鏈霉素標準溶液，用超純水定容至刻度，搖勻，靜置25 min后，測定其熒光強度，使稀釋后的碳點溶液熒光強度在儀器量程（≤1 000）的三分之二左右。

1.3.4 溶劑pH值及反應時間

配制NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液，配制不同pH值的緩沖液，取1 mL碳量子點和1 mL 1×10-6mol/L的鏈霉素，用緩沖溶液定容到5 mL容量瓶中，搖勻，測定用不同pH值緩沖溶液定容條件下的熒光強度（F），同時配制空白對比溶液（即其他條件一樣，只是不加入鏈霉素）測其熒光強度（F0），以 ΔF（ΔF=F/F0）和反應時間繪制曲線，選出熒光強度較穩(wěn)定的pH值并確定最佳反應時間。

1.3.5 標準曲線的繪制

分別移取1mL的碳量子點至5mL容量瓶中，再分別加入1mL不同濃度的鏈霉素標準溶液（1×10-5mol/L～1×10-8mol/L），用最佳 pH 值的 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液定容至刻度線。另取一個5 mL容量瓶，不加鏈霉素溶液，只加1 mL碳量子點，定容至刻度作為空白溶液，在25℃，選用最優(yōu)激發(fā)波長，測定反應體系的熒光強度（F）與空白溶液熒光強度（F0），以 ΔF（ΔF=F/F0）和鏈霉素反應濃度繪制標準曲線。

1.3.6 共存物的影響

取1 mL碳量子點、1 mL鏈霉素（1×10-6moL/L）置于5 mL容量瓶中，然后對應容量瓶中分別加入1 mL Zn2+、Mg2+、Fe3+、淀粉和糊精溶液（藥品輔料），濃度均為1×10-4moL/L，用最佳pH值的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻。另取2個5 mL的容量瓶，一個只加入1 mL碳量子點（空白），另一個加入1 mL碳量子點和1 mL 鏈霉素（1×10-6moL/L），不加共存物，用同樣的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液定容至刻度，搖勻。在25℃下，測定各溶液的熒光強度（F）與空白液熒光強度（F0），考察共存物對鏈霉素濃度測定的影響。

1.3.7 樣品中鏈霉素的測定

鏈霉素藥品試樣的制備：鏈霉素藥品研碎，稱取一定量樣品溶解于水中，超聲15 min后定容于100 mL容量瓶中，并根據當前濃度逐漸稀釋到指定濃度。

采用測定一系列鏈霉素標準溶液相同的條件，測定樣品的熒光強度，根據標準曲線計算樣品鏈霉素的含量，同時在樣品中加入一定體積的鏈霉素標準液，同步測定體系的熒光強度，并計算樣品加標回收率以及相對標準偏差。根據下式計算加標回收率和相對標準偏差。

加標回收率/%=[（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量]×100

式中：RSD為相對標準偏差；S為標準偏差；Xi為測量值；為所測數據的算術平均值；n為測量次數。

1.4 數據處理

采用EXCEL 2010軟件進行數據整理和計算，通過Origin 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 制備碳量子點的原料優(yōu)選及波長的選擇

圖1為不同原料量制備的碳點在最佳激發(fā)波長時的熒光光譜圖，圖2為用0.5 g葡萄糖和0.2 g L-半胱氨酸混合制備碳點的熒光光譜圖。

圖1 不同原料制備的碳點在最佳激發(fā)波長下的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of carbon dots prepared from different raw materials at optimum excitation wavelength

圖2 0.5 g葡萄糖和0.2 g L-半胱氨酸用量下制備碳點的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of carbon dots prepared with 0.5 g glucose and 0.2 g L-cysteine

加入不同量的原料制備不同的碳量子點，研究制備條件對碳量子點熒光強度的影響。由圖1可知，隨著半胱氨酸用量的增加，最佳發(fā)射波長逐漸紅移，但熒光強度先增強后減弱。由圖2可知，隨著激發(fā)波長從380 nm增加到500 nm，熒光碳點溶液的發(fā)射波長熒光強度先升高后降低，峰的位置也隨之紅移，這是由于不同能級通過不同官能團形成的不同“表面態(tài)”和溶液中不同粒徑碳點共存有關，符合文獻[22]報道的碳量子點具備激發(fā)獨立性的特點。由圖1和圖2可知，0.5 g葡萄糖和0.2 g L-半胱氨酸用量下混合制備碳點的最佳激發(fā)波長偏長波方向，且其在最佳激發(fā)波長440 nm下具有最高的發(fā)射熒光強度，因此本試驗采用0.5 g葡萄糖和0.2 g L-半胱氨酸用量下制備碳量子點并選用其最優(yōu)激發(fā)波長440 nm測定溶液熒光強度。

2.2 碳量子點的形貌及光譜特性

碳量子點紫外-可見吸收光譜圖見圖3。

圖3 碳量子點紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet-visible absorption spectra of carbon quantum dots

所制備碳量子點在白熾光條件下碳量子點的顏色為淡黃棕色，在黑暗中用365 nm紫外光照射時，碳量子點有熒光效果，顏色為淡藍色。如圖3所示，在250 nm～270 nm波長之間有一個吸收峰，說明形成的碳量子點存在共軛結構[23]，這是歸于碳量子點sp2區(qū)域的 π-π*躍遷[23-24]。

2.3 碳量子點用量的選擇

圖4為碳量子點用量對熒光強度的影響。

由圖4所知，加入碳點量為0.5 mL時，熒光強度較低；加入碳點量為1 mL時，熒光強度較適中；加入碳點1.5 mL時，熒光強度較強，考慮到鏈霉素或其他因素對碳量子點溶液造成的熒光猝滅或增強現象及儀器的檢測強度范圍（≤1 000），所以在定容至5 mL容量瓶的情況下，加入1 mL的碳量子點較適宜。

圖4 碳量子點用量對熒光強度的影響Fig.4 Effect of the amount of carbon quantum dots on fluorescence intensity

2.4 pH值與反應時間的選擇

探討NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液配制的3個pH 值（6.9、7.1、7.4）下，加入鏈霉素后碳點熒光強度的穩(wěn)定性，結果如圖5所示。

圖5 pH值及反應時間對熒光體系的影響Fig.5 Effect of pH value and reaction time on fluorescence system

鏈霉素是弱堿性有機物，在偏中性環(huán)境中較穩(wěn)定。從圖5可知，pH值為6.9、7.1、7.4時，溶液在15 min的時間內可以達到穩(wěn)定狀態(tài)，并持續(xù)較長時間。緩沖溶液pH值為6.9和7.1時，碳點溶液都有稍強的熒光增強或明顯的猝滅效果，而緩沖液pH值為7.4時，熒光強度無明顯熒光增強或猝滅現象而且穩(wěn)定，所以確定后續(xù)試驗在pH7.4的緩沖溶液中進行。

2.5 共存物的影響

試驗研究在鏈霉素濃度為2×10-7moL/L時，考察濃度均為 2×10-5moL/L 的共存物（Zn2+、Mg2+、Fe3+、淀粉、糊精）對體系熒光強度的影響，結果如圖6所示。

由圖 6 可知，Mg2+、Zn2+、Fe3+、淀粉和糊精對體系熒光強度的影響相對較小，可忽略其存在。

圖6 共存物質對鏈霉素的熒光強度測定干擾圖Fig.6 Interference of fluorescence intensity determination of streptomycin by coexisting substances

2.6 線性范圍

在定容于5 mL容量瓶中碳量子點的用量為1 mL，緩沖溶液的pH值為7.4，熒光測試激發(fā)波長為440 nm檢測條件下，研究測定不同濃度的鏈霉素與碳量子點結合后，體系熒光強度變化的規(guī)律。以鏈霉素濃度為橫坐標，相對熒光強度（ΔF=F/F0）為縱坐標做線性曲線，如圖7所示。

圖7 不同濃度的鏈霉素與體系相對熒光強度變化的標準曲線Fig.7 Standard curve of relative fluorescence intensity of streptomycin with different concentrations

在 2×10-9mol/L～2×10-6mol/L，鏈霉素濃度與體系熒光強度F/F0呈現出良好的線性關系，其線性回歸方程為y=162 219x+0.812 3，相關系數為0.997 2。根據國際純粹與應用化學聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry）的規(guī)定以空白的3倍標準偏差除以標準曲線的斜率得到了本試驗方法的檢出限為CL=3S/K=8.62×10-10mol/L。

2.7 樣品分析

樣品加標回收率檢測結果見表1。

表1 樣品加標回收率檢測結果（n=5）Table 1 Determination results of standard recovery rate（n=5）

將鏈霉素藥品研碎，稱取一定量樣品溶解于水中，超聲15 min后定容于100 mL容量瓶中，并根據當前濃度逐漸稀釋到指定濃度，在上述最佳試驗條件下，平行測定5次，同時做加標回收試驗。回收率在98.30%～101.50%，相對標準偏差較小。所以用碳點法檢測鏈霉素濃度有一定的可行性。

3 結論

以葡萄糖、L-半胱氨酸為原料，采用水熱法一步合成熒光碳量子點，并對碳量子點對鏈霉素的熒光現象的試驗條件進行優(yōu)化，探討共存離子對鏈霉素熒光現象的影響，同時研究碳點熒光現象與鏈霉素的濃度線性響應范圍，并做加標回收率試驗。試驗結果表明：在0.5 g葡萄糖和0.2 g L-半胱氨酸用量下，以此條件制備的碳量子點作為熒光探針，檢測鏈霉素的最佳環(huán)境：定容于5 mL容量瓶中碳量子點的用量為1 mL，緩沖溶液的pH值為7.4，激發(fā)波長為440 nm下，測得鏈霉素對熒光碳量子點的熒光強度有較明顯的熒光變化效果且較穩(wěn)定。在此條件下鏈霉素在濃度2×10-9moL/L～2×10-6moL/L，其濃度與相對熒光強度呈現出良好的線性關系，線性回歸方程為y=162 219x+0.812 3，相關系數為0.997 2。加標回收率在98.30%～101.50%，相對標準偏較小。Zn2+、Mg2+、Fe3+、淀粉、糊精這五種共存物質對體系熒光強度的影響較小，說明利用碳點溶液的熒光現象測定一定低濃度范圍的鏈霉素溶液的方法具有較高的可靠性和參考價值。