郭宏文，錢朋智，徐婷婷，劉曉蘭，李冠龍

（1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

我國是一個稻谷生產(chǎn)大國，據(jù)統(tǒng)計，2019年我國稻谷總產(chǎn)量達(dá)到2.096億噸[1]。稻米加工過程中會產(chǎn)生15%～20%的碎米[2-3]。碎米的用途很多，可以作為酒、醋和糖等的原材料[4-6]。我國每年的碎米產(chǎn)量較大，多作為飼料進(jìn)行加工，若綜合利用率很低[7]，會造成一定的資源浪費。碎米的淀粉含量較高，價格較低，可利用它的這一優(yōu)勢來制備淀粉糖類產(chǎn)品，以提高碎米的經(jīng)濟(jì)價值。

在工業(yè)生產(chǎn)中，來自玉米、大米等原料的淀粉經(jīng)過液化酶、糖化酶水解成葡萄糖，葡萄糖在異構(gòu)化酶的作用下轉(zhuǎn)化為果糖，獲得的果糖和葡萄糖混合的產(chǎn)品被稱為果葡糖漿[8-9]。果葡糖漿是一種重要的甜味劑，風(fēng)味有些類似于天然果汁，具有清香、爽口的口感[10-11]。果葡糖漿甜度與蔗糖相近，且具有滲透壓大、易于吸收、抗結(jié)晶性強(qiáng)、溶解度高、抗齲齒性、保濕性好等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用到醫(yī)療行業(yè)與食品工業(yè)中[12-14]。果葡糖漿應(yīng)用性廣、特性優(yōu)越、功效性能多樣，在世界范圍內(nèi)受到人們廣泛認(rèn)可，逐漸成為甘蔗糖和甜菜糖以外的第三類糖源[15]。在國內(nèi)市場，隨著果葡糖漿應(yīng)用范圍的拓寬，其需求量也在增加，開發(fā)玉米淀粉以外更多來源的果葡糖漿產(chǎn)品已成為一個新的趨勢。

近年來，國內(nèi)學(xué)者在利用碎米為原料制備果葡糖漿的工藝方面開展了一些研究[16-18]。這些研究中的碎米糖化用酶均為單一型糖化酶，未見使用復(fù)合型酶的研究。普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，它可與糖化酶協(xié)同作用，聯(lián)合對直鏈淀粉和支鏈淀粉進(jìn)行切割，提高糖化速度。因此，可以把普魯蘭酶用于碎米的糖化工藝。本研究利用碎米為原料制備果葡糖漿，液化工藝使用耐高溫α-淀粉酶，糖化工藝使用含有糖化酶和普魯蘭酶的復(fù)合型葡糖淀粉酶，研究其液化和糖化工藝條件，旨在取得較好的糖化效果。本研究可以為提高碎米的經(jīng)濟(jì)價值及開發(fā)碎米來源的淀粉糖產(chǎn)品提供基礎(chǔ)試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碎米:市售；耐高溫 α-淀粉酶（20 000 U/mL）、糖化酶（110 000 U/mL）-普魯蘭酶（1 000 U/mL）復(fù)合型葡糖淀粉酶（均為食品級）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑公司；硫酸銅、氫氧化鈉（分析純）：哈爾濱化學(xué)試劑廠；葡萄糖（分析純）：蘇州鵬成化工科技有限公司；碘（分析純）：濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)（CS-700Y型）：武義海納電器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2型）：上海力辰科技有限公司；恒速強(qiáng)力攪拌器（AM200L-H型）：上海昂尼儀器儀表有限公司；阿貝折光儀（Master-T型）：上海圖新電子科技有限公司；酸度計（PB10型）：廣州市授科儀器科技有限公司；高效液相色譜儀（日立Primaide型）：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 碎米前處理

新鮮的碎米放入粉碎機(jī)中粉碎，過80目篩。過篩后的碎米粉按一定比例加水后調(diào)成米漿用于液化處理。

1.3.2 液化工藝的優(yōu)化

以測定的液化液葡萄糖值（dextrose equivalent，DE）作為評價液化效果的指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗。初始條件選定：液化溫度90℃，液化時間30 min，加酶量為40 U/g，pH自然。因液化工藝對于后續(xù)的糖化有很大的影響，DE值過大不利于水解，過小不利于葡萄糖淀粉酶與底物的結(jié)合，一般葡萄糖生產(chǎn)中液化液DE值取15%～20%左右[19]。本試驗中以液化液DE值在15%～20%之間為滿足要求。

1）料液比優(yōu)化：料液比分別為 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）進(jìn)行液化，測定液化液的DE值，確定最佳的料液比。

2）液化溫度優(yōu)化：液化溫度分別為 78、82、86、90、94℃進(jìn)行液化，測定液化液的DE值，確定最佳液化溫度。

3）液化時間優(yōu)化：液化時間分別為 25、30、35、40、45 min進(jìn)行液化，測定液化液的DE值，確定最佳液化時間。

4）耐高溫α-淀粉酶加酶量的優(yōu)化：加酶量分別為20、30、40、50、60 U/g進(jìn)行液化，測定液化液的 DE 值，確定最佳的加酶量。

5）pH 值優(yōu)化：pH 值分別為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 進(jìn)行液化，測定液化液的DE值，確定最佳的液化pH值。

1.3.3 糖化工藝的優(yōu)化

以測定的糖化液DE值作為評價糖化效果的指標(biāo)。采用單因素試驗及正交試驗確定最佳糖化工藝條件。經(jīng)過預(yù)試驗，單因素試驗選定的初始條件：糖化溫度60℃，糖化時間48 h，pH4.5。單因素試驗包括糖化加酶量、糖化時間和糖化溫度的優(yōu)化。

1）糖化加酶量的優(yōu)化：葡糖淀粉酶加酶量分別為110、165、220、275、330 U/g，測定糖化液的 DE 值，確定最佳的加酶量。

2）糖化時間的優(yōu)化：糖化時間分別為 36、40、44、48、52 h，測定糖化液的DE值，確定最佳的糖化時間。

3）糖化溫度優(yōu)化：糖化溫度分別為 56、58、60、62、64℃，測定糖化液的DE值，確定最佳的糖化溫度。

糖化正交試驗：依據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗，確定最佳糖化工藝條件。

1.3.4 碎米糖化液的初步純化

將糖化液升溫至100℃，滅酶5 min，過濾；使用活性炭對糖化液脫色處理：糖化液中添加0.3%的活性炭，60℃條件下脫色30 min，過濾。通過脫色除去糖化液中肉眼可見的雜質(zhì)、一些蛋白質(zhì)和有色物質(zhì)。

1.3.5 指標(biāo)檢測與計算

1）酶解液固形物含量測定：采用阿貝折光儀法。

2）還原糖含量測定：采用菲林試劑法[20]。

3）DE 值計算[19]公式如下。

液化液DE值=液化液中還原糖含量/液化液中固形物含量×100

糖化液DE值=糖化液中還原糖含量/糖化液中固形物含量×100

4）高效液相色譜法分析[21]

樣品預(yù)處理：將樣品和乙腈按體積比1∶1混溶，過0.22 μm針頭式過濾器，超聲波除氣后備用。色譜分析條件為檢測器：RID檢測器；色譜柱：COSMOSIL sugar-D column（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=75∶25（體積比）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 液化工藝的優(yōu)化

2.1.1 料液比對液化效果的影響

料液比對液化效果的影響見圖1。

圖1 料液比對液化效果的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on liquefaction

由圖1可知，液化液DE值隨溶劑量的增大先增加后下降。料液比為1∶5（g/mL）時，DE值最大，之后DE值開始下降。溶劑量較小時米漿濃度過大，耐高溫α-淀粉酶的作用不充分，酶解效果差，DE值較低。隨著溶劑量的增加，酶作用變得充分，DE值增加。料液比為1∶5（g/mL）時對應(yīng)的DE值為15.8%，滿足在15%～20%之間的要求，因此，選擇最佳料液比為1∶5（g/mL）。

2.1.2 液化溫度對液化效果的影響

液化溫度對液化效果的影響見圖2。

圖2 液化溫度對液化效果的影響Fig.2 Effect of liquefaction temperature on liquefaction

由圖2可知，液化溫度為78℃時，液化液DE值較低，僅為8.2%。隨著液化溫度的增加，酶解速度越來越大，液化液DE值逐漸增加，液化溫度為90℃時的DE值達(dá)到最大，90℃后DE值開始下降。液化溫度為90℃時的液化液DE值15.8%，符合15%～20%的要求，因此，選擇最佳液化溫度為90℃。

2.1.3 液化時間對液化效果的影響

液化時間對液化效果的影響見圖3。

圖3 液化時間對液化效果的影響Fig.3 Effect of liquefaction time on liquefaction

由圖3可知，液化時間25 min對應(yīng)的液化液DE值為4.6%，隨著液化時間的延長，DE值增加，35 min時達(dá)到最高，DE值為17.2%。之后再延長液化時間時DE值略微下降，主要是因為碎米淀粉中α-1，6糖苷鍵的存在影響了酶反應(yīng)速度。而水解40 min后，由于α-淀粉酶的繼續(xù)作用，還原糖的含量繼續(xù)升高，DE值再次升高，45 min時的DE值為17.0%。液化時間35min～45min時，液化液的DE值均符合15%～20%的要求，考慮經(jīng)濟(jì)方面原因，選擇35min為最佳液化時間。

2.1.4 耐高溫α-淀粉酶加酶量對液化效果的影響

耐高溫α-淀粉酶加酶量對液化效果的影響見圖4。

圖4 耐高溫α-淀粉酶加酶量對液化效果的影響Fig.4 Effect of thermostable α-amylase amount on liquefaction

由圖4可知，液化液的DE值隨著耐高溫α-淀粉酶加酶量的增加而增加，加酶量為40 U/g時，DE值為17.2%，之后，酶濃度趨于飽和，酶量增加對淀粉液化的速度影響減弱，液化液的DE值增加較少，加酶量為60 U/g時，DE值為17.4%。加酶量在40 U/g～60 U/g時，DE值均符合15%～20%的要求，加酶量40 U/g和60 U/g的DE值相近，考慮經(jīng)濟(jì)方面原因，選擇耐高溫α-淀粉酶最佳加酶量為40 U/g。

2.1.5 pH值對液化效果的影響

pH值對液化效果的影響見圖5。

圖5 pH值對液化效果的影響Fig.5 Effect of pH on liquefaction

由圖5可知，碎米漿pH值對液化效果有一定的影響。pH5.0對應(yīng)的液化液DE值為11.8%，隨著pH值的增加DE值逐漸增加，pH6.5時的DE值最大，為17.2%。pH5.5～pH6.5對應(yīng)的DE值均符合15%～20%的要求，選擇最佳液化pH值為6.5。

2.2 復(fù)合酶糖化工藝的優(yōu)化

2.2.1 糖化加酶量對糖化效果的影響

糖化加酶量對糖化效果的影響見圖6。

由圖6可知，糖化液DE值起初著隨著加酶量加酶量的增加而增加，復(fù)合型葡糖淀粉酶加酶量110 U/g對應(yīng)糖化液的DE值為91.0%，加酶量為275 U/g時，DE值達(dá)到最大，為99.4%。加酶量330 U/g時，DE值變化不大，可能是復(fù)合型葡糖淀粉酶用量達(dá)到275U/g后，酶濃度趨于飽和，酶量的增加對碎米淀粉的水解速率影響減弱。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇最佳加酶量為275 U/g。

圖6 糖化加酶量對糖化效果的影響Fig.6 Effect of saccharifying enzyme amount on saccharification

2.2.2 糖化時間對糖化效果的影響

糖化時間對糖化效果的影響見圖7。

圖7 糖化時間對糖化效果的影響Fig.7 Effect of saccharification time on saccharification

由圖7可知，糖化時間36 h的糖化液DE值為89.8%，36 h～40 h糖化液DE值增幅不大，40 h后隨著時間的增加糖化液DE值增加迅速，糖化時間48 h時達(dá)到最高，DE值為99.4%，糖化52 h時糖化液DE值不再增加?？紤]經(jīng)濟(jì)方面原因，選擇最佳糖化時間為48 h。

2.2.3 糖化溫度對糖化效果的影響

糖化溫度對糖化效果的影響見圖8。

圖8 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.8 Effect of saccharification temperature on saccharification

由圖8可知，糖化溫度56℃時的糖化液DE值為99.0%，隨著溫度的增加，糖化液DE值整體變化幅度不大。糖化溫度60℃對應(yīng)的DE值最大，為99.4%。因此，選擇最佳糖化溫度為60℃。

2.2.4 糖化正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗，各因素水平分別選擇：糖化加酶量 220、275、330 U/g，糖化溫度 58、60、62 ℃，糖化時間 44、48、52 h，pH 值 4.2、4.5、4.8。正交試驗對糖化工藝優(yōu)化后的結(jié)果見表1。

表1 糖化正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 1 Design and results of orthogonal test for saccharification

對表1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可知，四個因素對糖化效果的影響順序由大到小依次：A糖化加酶量>B糖化時間>C pH值>D糖化溫度，最佳糖化工藝組合應(yīng)為A3B2C2D3。經(jīng)過試驗，A3B2C2D3條件下糖化得到的糖化液DE值為99.5%，明顯優(yōu)于單一評價指標(biāo)的結(jié)果。因此，糖化工藝條件最佳組合為A3B2C2D3，即糖化加酶量為330 U/g，糖化溫度 60℃，糖化時間為48 h，pH4.8。

據(jù)李文釗等[22]報道，在利用大米制備果葡糖漿的工藝中，糖化溫度控制在60℃～62℃，pH值4.3，糖化時間30 h～40 h，糖化結(jié)束后糖化液DE值可以達(dá)到95%～98%。將本研究與之進(jìn)行比較，糖化工藝條件參數(shù)都比較接近。但在本研究中糖化時間40 h以上繼續(xù)增加時，得到糖化液的DE值也隨之增大，糖化44 h時的糖化液DE值為99.2%，糖化48 h時DE值達(dá)到了99.5%，取得了較好的糖化效果。

2.3 碎米糖化液的糖組分分析

碎米糖化液經(jīng)過濾和脫色初步純化后，對其糖類成份進(jìn)行了分析。糖類物質(zhì)的分離可以通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）在色譜柱中實現(xiàn)。采用高效液相色譜法分別確定了葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、果糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時間，結(jié)果如圖9～圖10所示。

圖9 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of glucose standard

分析圖9、圖10可知，流動相乙腈對應(yīng)的峰最大，其出峰保留時間為2.940 min。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰保留時間為8.493 min，果糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰保留時間6.973 min。

采用高效液相色譜法對碎米糖化液中的糖組分進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖11所示。

分析圖11可知，碎米糖化液組分色譜圖中除乙腈的峰之外，還有1個主峰，出峰保留時間為8.487 min，峰面積為951 705，與圖9葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時間8.493 min基本一致，表明碎米糖化液的糖類主要由葡萄糖組成，依據(jù)峰面積計算得到葡萄糖的含量為73.2%。此外，色譜圖中還有一個組分的出峰保留時間為7.033 min，峰面積為144 048，因其含量相對較低，所對應(yīng)的峰圖顯示不明顯，其出峰保留時間與圖10果糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰保留時間6.973 min基本一致，可以確定糖化液的糖類中還含有果糖，依據(jù)峰面積計算得到果糖的含量為11.1%。

圖10 果糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.10 HPLC chromatogram of fructose standard

圖11 碎米糖化液的組分高效液相色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of components in saccharified liquid of broken rice

3 結(jié)論

本研究碎米液化的最佳工藝條件：料液比為1∶5（g/mL），液化溫度 90 ℃，液化時間為 35 min，耐高溫α-淀粉酶加酶量40 U/g，pH6.5，得到液化液的DE值為17.2%。糖化的最佳工藝條件：復(fù)合型葡糖淀粉酶加酶量330 U/g，糖化溫度60℃，糖化時間為48 h，pH4.8，得到的糖化液DE值為99.5%。糖化效果較好。

研究結(jié)果表明液化及糖化使用的兩種酶用于碎米液化及糖化工藝的作用效果尚佳。采用高效液相色譜法分析了碎米糖化液的糖類成分，其中的葡萄糖、果糖含量分別為73.2%和11.1%。在糖化液中含有少量的果糖，對后續(xù)進(jìn)一步利用葡萄糖異構(gòu)酶制備果葡糖漿的工藝過程是有利的，可以減少葡萄糖異構(gòu)酶的用量和縮短異構(gòu)化反應(yīng)時間，節(jié)約生產(chǎn)成本。