張家音，李浩楠，雷嗣超，趙泓濤，黃雪薇，楊芳

（武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205）

板栗（Castanea mollissima Blume）為雙子葉植物，在我國(guó)分布很廣[1]，尤其在低山丘陵的緩坡和河灘地段較為多見(jiàn)。目前，板栗加工主要以果仁為主，其加工副產(chǎn)物板栗殼通常是被丟棄或者焚燒，這樣既破壞環(huán)境，又浪費(fèi)資源。已有研究表明，板栗殼中含有酚類(lèi)[2]、香豆素、有機(jī)酸[3]、多糖[4]、黃酮[5]、植物甾醇和鞣質(zhì)[6]等多種生理活性成分，具有降血脂[7]、抗氧化[8-9]、抑菌[10]、營(yíng)養(yǎng)保健[11]抗腫瘤活性[12]等功能。

研究表明，板栗殼黃酮含量豐富，約占6%左右[13]，具有重要的利用價(jià)值，目前，實(shí)驗(yàn)室常用熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、堿提法、酶輔助提取法、微波輔助提法、超聲波輔助提法以及超臨界流體萃取法[14]等方法提取黃酮。熱水提取法只可提取黃酮苷類(lèi)，且提取物在放置過(guò)程中容易變質(zhì)；而用堿提法提取，其提取過(guò)程易受雜質(zhì)影響，從而影響黃酮得率；另外，酶輔助提取法操作相對(duì)來(lái)說(shuō)比較復(fù)雜；微波、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法所需的實(shí)驗(yàn)設(shè)備費(fèi)用較高。所以，綜合考慮黃酮得率、純度以及設(shè)備條件等因素，本試驗(yàn)采用醇提取法作為黃酮的提取方法[15-16]對(duì)板栗加工廢棄物中活性成分黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究板栗殼黃酮的組成及功能活性奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)有效地避免了資源的浪費(fèi)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析法得到板栗殼黃酮的最佳提取工藝，并采用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，UPLC-ESI-MS/MS）技術(shù)，對(duì)最優(yōu)條件下提取的板栗殼黃酮類(lèi)物質(zhì)的組成進(jìn)行分析，以期提高板栗殼黃酮的提取得率，并為板栗殼黃酮功能因子開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗（產(chǎn)自山東臨沂沂蒙山）：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、亞硝酸鈉（分析純）、硝酸鋁九水合物（分析純）、乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、濾膜（0.22 μm）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠(chǎng)；無(wú)水乙醇（色譜純）、甲醇（色譜純）：默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；PL-203分析天平：梅特勒托利多儀器（上海）公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（20目、60目）：浙江上虞市五四紗篩廠(chǎng)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHZ-D3循環(huán)水式多用真空泵：河南省予華儀器有限責(zé)任公司；UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司；XHF-DY高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；Ultimate 3000型超高效液相色譜儀：美國(guó)Dionex公司；QTRAP 6500型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18型色譜柱：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼黃酮的提取工藝

將板栗殼去雜后用水洗凈，自然干燥至表面無(wú)水分之后放入55℃烘干箱中烘干，烘干后粉碎并過(guò)20目篩，重復(fù)粉碎直至板栗殼的大小為20目。

參考王敏等[17]、蘇云霞等[18]的研究思路和提取方法，并加以改動(dòng)。將水提取液改為乙醇-水的混合提取液，恒溫水浴提取改為恒溫培養(yǎng)搖床提取，真空濃縮改為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，具體工藝如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g板栗殼粉于150 mL的錐形瓶中，加入試驗(yàn)設(shè)定的相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液后，于一定提取溫度的恒溫培養(yǎng)搖床中振蕩提取一定時(shí)間，冷卻后進(jìn)行真空抽濾并在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥濃縮液后得到黃酮粗提物（凍干粉）。

1.3.2 板栗殼黃酮的測(cè)定

1.3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

參考黃雪薇等[19]的方法，以乙醇溶液為提取劑，配制濃度梯度為 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在510 nm處測(cè)定吸光度并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為Y=11.54X-0.093 1，R2=0.999 4。

1.3.2.2 總黃酮得率的測(cè)定

根據(jù)1.3.2.1中的回歸方程，按照公式（1）計(jì)算板栗殼總黃酮得率。

式中：c為代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后得到的板栗殼黃酮提取物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為待測(cè)樣體積，mL；M為板栗殼粉的質(zhì)量，g；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

除變量外固定其他工藝條件[乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間及提取溫度為 70%、15∶1（mL/g）、90 min及55℃]不變的情況下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比 [10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）]、提取時(shí)間（60、70、80、90、100 min）、提取溫度（50、55、60、65、70℃）對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、液料比（mL/g）、提取時(shí)間（min）和提取溫度（℃）這4個(gè)對(duì)板栗殼總黃酮得率影響較大的因素為自變量，以板栗殼總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面的結(jié)果分析得到優(yōu)化的黃酮提取參數(shù)。試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Test factors and levels

1.3.5 組成分析

1.3.5.1 樣品的制備

稱(chēng)取1.3.1中的板栗殼黃酮粗提凍干粉0.1 g，并用70%甲醇水溶液定容至100 mL，離心后取上清，過(guò)0.22 μm 濾膜，備用。

1.3.5.2 色譜條件

色譜條件：Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18型色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相 A 為水和0.04%的乙酸，流動(dòng)相B為乙腈和0.04%的乙酸；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 2 μL；流速 0.40 mL/min；洗脫程序?yàn)?0～11.0 min（5%A），11.0 min～12.0 min（5%A），12.0 min～12.1 min（5%～95%A），12.1 min～15.0 min（95%A）。

1.3.5.3 質(zhì)譜條件

線(xiàn)性離子阱（linear ion trap，LIT）和三重四極桿（triple quadrupole，QQQ）掃描是在Q TRAP 6500三重四極桿-線(xiàn)性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)上獲得，該系統(tǒng)配備了電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）渦輪增壓離子噴霧接口，測(cè)試模式為正離子模式。ESI源操作參數(shù)：電噴霧電離，溫度為500℃，噴霧電壓為5 500 V，離子源氣Ⅰ、離子源氣Ⅱ和氣簾氣分別為55、60、25 psi（1 psi=6.895 kPa）。儀器調(diào)優(yōu)和質(zhì)量校準(zhǔn)分別在QQQ和LIT模式下，在10 μmol/L和100 μmol/L聚丙二醇溶液中進(jìn)行。試驗(yàn)使用的碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為5 psi，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）試驗(yàn)得到QQQ掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，板栗殼總黃酮得率逐漸上升。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，乙醇和水的比例達(dá)到最佳，總黃酮得率達(dá)到最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，板栗殼總黃酮得率降低，可能是由于其他不同結(jié)構(gòu)的醇溶性（如黃酮苷元）和水溶性（如二氫黃酮及二氫黃酮醇）雜質(zhì)溶出[20]，這些物質(zhì)與板栗殼中待提取的黃酮競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致板栗殼總黃酮得率降低。所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～80%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察范圍。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoid from chestnut shell

2.1.2 液料比對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響

液料比對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖 2 可以看出，液料比在 10∶1（mL/g）～15∶1（mL/g）范圍內(nèi)，隨液料比增大，總黃酮得率大幅度升高，可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)囊毫媳燃涌炝它S酮類(lèi)物質(zhì)的溶解[21]；當(dāng)液料比在15∶1（mL/g）時(shí)總黃酮得率達(dá)最高；但液料比繼續(xù)增加時(shí)，因?yàn)樘崛∫哼^(guò)多，而黃酮含量幾乎不變，整體出現(xiàn)總黃酮得率降低趨勢(shì)，且在工業(yè)上液料比過(guò)高存在不易濃縮、溶劑消耗量大的問(wèn)題。所以將液料比定在 10∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）作為響應(yīng)面的考察范圍。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖3可以看出，提取時(shí)間的增加使得板栗殼總黃酮得率呈波動(dòng)變化，兩個(gè)峰值分別出現(xiàn)在70 min和90 min處?？傮w上來(lái)說(shuō)，在60 min～100 min內(nèi)，黃酮提取率在5.2%～5.6%之間變化，差別并不明顯，并且在平行試驗(yàn)間存在一定的差別。而隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，其他能夠溶于乙醇和水的雜質(zhì)也逐漸溶出，從而抑制了板栗殼黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，同時(shí)考慮到黃酮類(lèi)物質(zhì)存在著水解的現(xiàn)象，有的黃酮水解只需要數(shù)分鐘，有的則需很長(zhǎng)時(shí)間，且在工業(yè)上提取時(shí)間越長(zhǎng)經(jīng)濟(jì)支出越高，因此在相同總黃酮得率的情況下，提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。因此，將提取時(shí)間60 min～80 min作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察范圍。

2.1.4 提取溫度對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)板栗殼總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of flavonoid from chestnut shell

由圖4可以看出，提取溫度為50℃～65℃時(shí)，總黃酮得率整體呈上升趨勢(shì)。原因可能是提取溫度升高分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加快，進(jìn)而加速了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出[22]。65℃時(shí)總黃酮得率達(dá)到最高，而提取溫度超過(guò)65℃時(shí)，過(guò)高溫度，加快其他醇溶性物質(zhì)的溶出，干擾黃酮在乙醇溶液中的溶出或者是因?yàn)闇囟冗^(guò)高破壞了黃酮類(lèi)物質(zhì)的穩(wěn)定性[23]，從而導(dǎo)致總黃酮得率的降低。故選擇提取溫度60℃～70℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的考察范圍。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化板栗殼總黃酮的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental

經(jīng)回歸擬合分析，得到的回歸方程：R=6.08-0.5258A+0.139 2B-0.037 5C+0.074 2D-0.345 0AB-0.035 0AC-0.052 5AD+0.042 5BC+0.060 0BD+0.150 0CD-1.02A2-0.440 6B2-0.288 1C2-0.203 1D2。

方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis variance

各因素對(duì)黃酮提取率的影響可以通過(guò)F值判定，F(xiàn)值越大，其影響越強(qiáng)；P值為該模型與試驗(yàn)各個(gè)考察因素的顯著程度。表3中模型的F值為14.30，且失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)R2=0.934 6，表明此方程可以充分的擬合數(shù)據(jù)，因此板栗殼黃酮提取的最佳工藝條件可以由該模型進(jìn)行分析。表3中乙醇體積分?jǐn)?shù)A影響極顯著（P<0.001），其余一次項(xiàng)B、C、D影響均不顯著（P>0.05）；在交互因素中AB的影響為顯著（P<0.05）；在二次項(xiàng)中A2、B2影響極顯著（P<0.001），C2影響是高度顯著（P<0.01），D2影響顯著（P<0.05）。4個(gè)影響因素按影響效果大小排列：乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間>提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面各因素間的交互分析

響應(yīng)面圖是試驗(yàn)中各因素交互作用的響應(yīng)值得到的3D曲面圖，試驗(yàn)的響應(yīng)值及各因素之間的影響作用可由圖分析。從等高線(xiàn)圖和3D圖中可以直觀地看出兩因素對(duì)總黃酮得率影響的交互程度，等高線(xiàn)圖為橢圓表示相互作用顯著，圓形則表示不顯著；3D曲面圖的爬坡越陡表示兩個(gè)因素的相互作用越顯著，反之則不顯著。用Design-Expert 11軟件處理得到板栗殼黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的等高線(xiàn)和3D響應(yīng)面見(jiàn)圖5～圖10。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用Fig.5 Interaction between ethanol concentration and liquid-solid ratio

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的交互作用Fig.6 Interaction between ethanol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的交互作用Fig.7 Interaction between ethanol concentration and extraction time

圖8 液料比與提取溫度的交互作用Fig.8 Interaction between liquid-solid ratio and extraction temperature

圖9 液料比與提取時(shí)間的交互作用Fig.9 Interaction between liquid-solid ratio and extraction time

圖10 提取時(shí)間與提取溫度的交互作用Fig.10 Interaction between extraction time and temperature

從圖5可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比這兩個(gè)因素交互形成的響應(yīng)面凸出陡峭且等高線(xiàn)圖為橢圓形，說(shuō)明這兩個(gè)考察因素間的相互作用能夠顯著影響板栗殼總黃酮的得率，這符合表3的結(jié)果。從圖6可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定為一定值時(shí)，板栗殼總黃酮得率開(kāi)始時(shí)隨著提取溫度的升高而增大，到達(dá)一定值時(shí)，其得率隨著提取溫度的升高而減小。當(dāng)提取溫度固定為一定值時(shí)，板栗殼總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但是總體變化趨勢(shì)較小。從圖7可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定為一定值時(shí)，板栗殼總黃酮得率開(kāi)始時(shí)隨著提取時(shí)間的升高而增大，到達(dá)一定值時(shí)，其得率隨著提取時(shí)間的升高而減小。當(dāng)提取時(shí)間固定為一定值時(shí)，板栗殼總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，但是總體變化趨勢(shì)較為平緩。結(jié)合圖8～圖10和表3，響應(yīng)面圖凸出不明顯且等高線(xiàn)圖趨于圓形，說(shuō)明各組兩因素的相互作用不能夠顯著影響板栗殼總黃酮的得率。

2.2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 11軟件擬合的結(jié)果得到了板栗殼總黃酮得率的最大理論值為6.27%。經(jīng)計(jì)算得出該條件下提取板栗殼黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 66.86%，液料比 17.08∶1（mL/g），提取溫度65.12℃，提取時(shí)間71.98 min。由于實(shí)際的操作限制，調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度以及提取時(shí)間分別為 70%、17∶1（mL/g）、65 ℃以及 70 min，在此提取工藝條件下，重復(fù)試驗(yàn)5次，得到板栗殼總黃酮得率的平均值為6.14%，接近理論值，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化分析所得的模型具有可靠性。

2.3 組成分析

板栗殼黃酮組成分析結(jié)果見(jiàn)表4（按照含量從高到低排列）。

表4 板栗殼黃酮組成Table 4 Composition of flavonoids from chestnut shell

本試驗(yàn)采用UPLC-ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)板栗殼黃酮的組成進(jìn)行分析，在正離子模式下，黃酮類(lèi)化合物的分離度和離子化的效果都較好，共鑒別出37種純度較高的黃酮。其中6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮含量最高，其次為香葉木素。

3 結(jié)論

本研究以乙醇溶液為提取劑，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到板栗殼黃酮提取最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，液料比 17∶1（mL/g），提取溫度 65 ℃，提取時(shí)間70 min，此時(shí)，總黃酮得率達(dá)到6.14%。影響板栗殼總黃酮得率的因素按從大到小排列：乙醇體積分?jǐn)?shù)>液料比>提取時(shí)間>提取溫度。采用UPLC-ESI-MS/MS技術(shù)分析板栗殼中黃酮類(lèi)化合物共有37種，其中6，7，8-三羥基-5-甲氧基黃酮的含量最高，其次為香葉木素。