陳鐵楊，胡文忠，侯夢陽，陳雁，王佳宇，閆麗娜

（1.大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024）

金花茶[Camellia petelotii（Merrill）Sealy]，為山茶科山茶屬植物，主要分布于廣西防城港市，為國家一級保護植物，是一種具有開發(fā)利用價值的特有珍稀植物資源，具有獨特的觀賞價值、經濟價值和藥用價值[1-3]。金花茶含有多酚、多糖、總皂苷等成分以及鍺、鋅、硒等能夠維持機體健康的微量元素。研究表明，金花茶花朵具有抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化、降血脂和保護心腦血管等作用[4-7]。金花茶葉片用作茶飲，可起到清熱解毒、利咽止痛、利尿消腫和增強體質等保健功效[8-9]。近年來金花茶被逐漸應用于食品、化妝品等功能性健康產品的開發(fā)，但是金花茶葉并未得到科學合理的開發(fā)利用。

植物多酚是植物體內的次級代謝產物，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌和增強免疫力等多種生物活性，已廣泛應用于食品、保健、生物醫(yī)藥等領域[10-11]。酚類物質的傳統(tǒng)提取方法包括熱水浸提法、回流提取法等，但是存在提取效率不高、提取時間長和步驟復雜等問題[12-13]。超聲波輔助法的提取效果較為理想，可以大大縮短提取時間、提高提取效率、降低成本消耗和保護天然活性成分功效，是一種常應用于天然產物活性成分領域的提取方法[14-16]。

目前針對金花茶葉多酚的提取工藝研究未見報道，本研究采用超聲波輔助法提取金花茶葉多酚，并通過正交試驗對金花茶葉多酚的提取工藝進行優(yōu)化，同時對金花茶葉多酚提取物的體外抗氧化活性進行評價，以期為金花茶葉多酚的開發(fā)利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶葉：采摘于廣西防城港市；沒食子酸（標準品）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氨-二-（3-乙基-苯并噻-6-磺酸）二胺鹽[2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）]、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）：上海源葉科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津科密歐試劑有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒：蘇州科銘有限公司；福林酚試劑（均為分析純）：北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-250電熱恒溫干燥箱：杰瑞爾電器公司；DW-160中藥粉碎機：永康市鉑歐五金有限公司；FA1204B分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-320E超聲波清洗器：昆山超聲儀器公司；SHZ-Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵：河南艾瑞德設備公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器公司；Multiskan GO酶標儀：美國THERMO SCIENTFIC公司；RE-201D旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金花茶葉多酚的制備

將新鮮采摘的金花茶葉洗凈，在60℃下烘干，粉碎，過60目篩后裝入密封袋中，避光保存，備用。準確稱取1.0 g粉末，按預定的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間在超聲波清洗器中進行多酚提?。ü潭üβ蕿?00 W，固定頻率為40 kHz），合并提取液，過濾，得到金花茶葉多酚提取溶液。

1.3.2 金花茶葉多酚含量的測定

沒食子酸標準曲線的建立參考Hao等[17]的報道，并略加修改。首先配制40 μg/mL～120 μg/mL沒食子酸工作液，分別吸取0.25 mL不同濃度的沒食子酸工作液于試管內，向試管內加入1.25 mL的福林酚試劑（用去離子水稀釋10倍），搖勻。25℃避光反應3 min，接著加入1.0 mL的7.5%碳酸鈉溶液，在45℃水浴鍋中加熱60 min，于765 nm處下測定吸光度，得線性回歸方程為 y=0.092 1x+0.197 9（R2=0.999 6）。

金花茶葉多酚提取量計算公式如下。

式中：C 為多酚質量濃度，mg/mL；V 為體積，mL；n為稀釋倍數；W為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取1.0 g金花茶葉粉末，采用超聲輔助法進行多酚提取，考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（10、20、30、40、50、60 min）、提取溫度（25、35、45、55、65、75 ℃）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]對金花茶葉多酚提取量的影響。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比對金花茶葉多酚提取量的影響，相應因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 抗氧化活性試驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Hou等[18]測定方法并略加修改?，F配濃度為0.5 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液，備用。分別吸取240 μL不同濃度樣品溶液，加入60 μL DPPH-無水乙醇溶液，搖勻，于酶標儀25℃孵育30 min，在517 nm處測定樣品溶液吸光度A1。按照相同方法，吸取樣品溶液和無水乙醇，測定吸光度A2；吸取無水乙醇和DPPH溶液，測定吸光度A0。以Trolox溶液作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考Shen等[19]測定方法并略加修改。使用蒸餾水配制50 mL 7 mmol/L ABTS和50 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，混勻，室溫下避光反應16 h，得到ABTS母液。蒸餾水稀釋ABTS工作液，使其在734 nm處吸光值穩(wěn)定在0.7±0.02范圍內，即制備得到ABTS工作液。

分別吸取50μL不同濃度的樣品溶液，加入200μL ABTS工作液，搖勻，于酶標儀37℃孵育10 min，在734 nm處測定吸光度A1。按照相同方法，吸取樣品溶液和蒸餾水，測定吸光度A2；吸取蒸餾水和ABTS工作液，測定吸光度A0。以Trolox溶液作為陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.3 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力采用總抗氧化能力檢測試劑盒進行測定。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，試驗結果使用Excel 2010、SPSS 19.0、Origin 2018等軟件進行分析和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響

乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖1可知，乙醇濃度40%～80%時，多酚提取量在不斷提高，而且呈現較快的增長速度，當乙醇濃度80%時，多酚提取量最高，達到167.50 mg/g，隨后下降。原因可能是乙醇濃度過高時，多酚與溶劑的極性相差很大，蛋白質變性沉淀，同時會有大量脂溶性、醇溶性物質溶解，導致酚類化合物的溶解度降低[20-22]。因此，選擇最佳乙醇濃度為80%進行后續(xù)試驗。

2.1.2 提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響

提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響見圖2。

圖2 提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖2可知，提取時間由10min增加至30min時，多酚提取量在不斷提高，當提取時間為30 min時，多酚提取量最高，達到205.70 mg/g，繼續(xù)延長提取時間，提取量呈下降趨勢。原因可能是在一定的提取時間內，隨著提取時間的延長，多酚會通過超聲波空化效應和機械效應不斷溶出。提取時間過長時，會使多酚被逐漸分解和多糖、皂苷等雜質溶出，導致多酚提取量下降[23-25]。因此，選擇最佳提取時間為30 min進行后續(xù)試驗。

2.1.3 提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響

提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖3可知，提取溫度由25℃升高至35℃時，多酚提取量不斷提高，當提取溫度達到35℃時，多酚提取量最高，達到214.74 mg/g，隨后開始明顯下降。原因可能是金花茶葉對于溫度特別敏感，隨著體系溫度升高，會提高分子的擴散能力，加大分子的運動速率，加速多酚的溶出，提高多酚提取量。當提取溫度繼續(xù)升高時，超聲波熱效應會使多酚結構被破壞和其他雜質溶出，多酚物質無法繼續(xù)溶出，而且酚類結構對高溫比較敏感，最終導致多酚提取量下降[26-28]。因此，選擇最佳提取溫度為35℃進行后續(xù)試驗。

2.1.4 料液比對金花茶葉多酚提取量的影響

料液比對金花茶葉多酚提取量的影響見圖4。

由圖 4 可知，料液比由 1∶10（g/mL）增加至 1∶50（g/mL）時，多酚提取量隨之提高，當料液比為1∶50（g/mL）時，提取量達到最高，為281.33 mg/g，隨后開始下降。原因可能是料液比過小時，提取溶劑與樣品接觸不完全因而提取量很低，不斷增加料液比后，多酚物質會逐漸溶出。但是繼續(xù)增加料液比，其他雜質溶出量會增加，而且增加濃縮多酚的時間，造成資源浪費和成本增加[29-31]。因此，選擇最佳料液比為 1∶50（g/mL）進行后續(xù)試驗。

圖4 料液比對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，影響提取量的主次順序為A（乙醇濃度）>D（料液比）>C（提取溫度）>B（提取時間），結果表明乙醇濃度是最顯著的影響因素，提取時間對金花茶葉多酚提取量影響較小。正交試驗優(yōu)化金花茶葉多酚提取量的最佳提取工藝參數組合為A3B2C2D2，即乙醇濃度90%、提取時間30 min、提取溫度35℃、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下進行驗證試驗，重復3組試驗，得到金花茶葉多酚提取量為295.82 mg/g。

2.3 抗氧化活性測定結果

2.3.1 金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響

金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響見圖5。

圖5 金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of Camellia petelotii leaves polyphenols on the scavenging ability of DPPH free radicals

由圖5可知，在15 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內，金花茶葉多酚和Trolox溶液對DPPH自由基具有一定的清除能力，并且清除率隨濃度的增加而提高，金花茶葉多酚清除率從25.98%上升至92.27%，呈現出良好的線性關系。Trolox清除率基本保持在96.25%，隨著質量濃度的增加，金花茶葉多酚的清除率逐步接近Trolox溶液，卻略低于Trolox溶液清除率，其IC50值為0.030 9 mg/mL，表明Trolox溶液的DPPH自由基清除能力高于金花茶葉多酚。

2.3.2 金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響

金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of Camellia petelotii leaves polyphenols on the scavenging ability of ABTS+free radicals

由圖6可知，在15 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內，金花茶葉多酚和Trolox溶液對ABTS+自由基均具有較好的清除能力，清除率隨濃度的增加而增強，金花茶葉多酚清除率從23.04%升高至78.85%，濃度和清除率呈現正相關線性關系，但是明顯低于Trolox溶液的清除率，其IC50值為0.043 4 mg/mL。

2.3.3 金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響

金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響見圖7。

圖7 金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of Camellia petelotii leaves polyphenols on total antioxidant capacity

由圖7可知，在0.4 mg/mL～2.4 mg/mL濃度范圍內，多酚提取物總抗氧化能力隨著樣品濃度的增加而增強，濃度與總抗氧化能力表現出正相關性，并不斷接近Trolox溶液的總抗氧化能力，但一直低于Trolox溶液的總抗氧化能力。金花茶葉多酚提取物濃度為2.4 mg/mL時，其總抗氧化能力為0.82 mmol/L，表明其具有較好的總抗氧化能力。

3 結論

本試驗通過正交試驗優(yōu)化得到金花茶葉多酚最佳提取工藝條件為乙醇濃度90%，提取時間30 min，提取溫度35℃，料液比1∶50（g/mL），在此條件下多酚提取量達295.82 mg/g。DPPH、ABTS+自由基清除能力及總抗氧化能力試驗結果表明，金花茶葉多酚提取物具有一定的抗氧化能力，其IC50值分別為0.030 9、0.043 4 mg/mL，總抗氧化能力為0.82 mmol/L。本試驗可為進一步提高金花茶葉資源的有效開發(fā)利用提供科學依據。