李君 朱嘉晉 鄧雨萍 吳文鶴

[摘要] 目的 優(yōu)化線粒體DNA（mtDNA）提取和純度鑒定方法以滿足線粒體基因組測序的要求。方法 利用簡化的蔗糖密度梯度離心法、DNA酶Ⅰ并結(jié)合質(zhì)粒提取試劑盒提取純化mtDNA、盡量降低核DNA（nDNA）污染的可能。獲得的mtDNA經(jīng)NanoDrop檢測、瓊脂糖凝膠電泳和熒光定量PCR絕對定量法測定nDNA/mtDNA拷貝數(shù)比值等鑒定其純度。結(jié)果 從小鼠肝臟和大腦組織中提取純化得到mtDNA產(chǎn)率分別為311.7 μg/g和59.1 μg/g，其A260/280均介于1.8～2.0，A260/230濃度均大于2.0，熒光定量PCR絕對定量法測定nDNA/mtDNA拷貝數(shù)比值均低于0.005%。結(jié)論 本研究優(yōu)化了mtDNA提取和鑒定方法，得到的高純度mtDNA適用于后續(xù)線粒體基因組測序等分子生物學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 線粒體DNA;提取;純化;核DNA

[中圖分類號(hào)] R394.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）04-0040-04

[Abstract] Objective To optimize mitochondrial DNA （mtDNA） extraction and purity identification methods to meet the requirements of mitochondrial genome sequencing. Methods Simplified sucrose density gradient centrifugation， DNase I， and plasmid extraction kit were used to extract and purify mtDNA and minimize the possibility of nuclear DNA （nDNA） contamination. The purity of the obtained mtDNA was determined by NanoDrop detection， agarose gel electrophoresis， and determination of nDNA/mtDNA copy number ratio by fluorescence quantitative PCR absolute quantitative method. Results The yields of mtDNA extracted and purified from mouse liver and brain tissues were 311.7 μg/g and 59.1 μg/g， respectively. The A260/280 ranged from 1.8 to 2.0， and the A260/230 concentration was greater than that of 2.0. The ratio of nDNA/mtDNA copy number determined by fluorescence quantitative PCR absolute quantitative method was lower than 0.005%. Conclusion This study optimizes the mtDNA extraction and identification methods， and the high purity mtDNA obtained is suitable for subsequent mitochondrial genome sequencing and other molecular biology research.

[Key words] Mitochondrial DNA; Extraction; Purification; Nuclear DNA

隨著測序技術(shù)的快速蓬勃發(fā)展，獲取線粒體基因組序列變得更為容易[1]，如何高效分離和純化線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）而避免核DNA（nuclear DNA，nDNA）的污染是線粒體基因組測序及后續(xù)序列分析的關(guān)鍵[2]。另外，現(xiàn)有的DNA純度鑒定方法多采用PCR擴(kuò)增后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其敏感度較低且操作較繁瑣。因此，本研究通過對現(xiàn)有mtDNA提取和鑒定方法進(jìn)行優(yōu)化，獲得高純度的mtDNA，以滿足線粒體基因組測序和后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)研究的要求。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究經(jīng)學(xué)校動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取新鮮C57BL/6小鼠[動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（浙）2015-0009]肝臟和大腦組織200 mg進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

CFX Connect實(shí)時(shí)定量PCR儀（BIO-RAD，美國），NanoDrop one（Thermo Scientific，美國）。DNA酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）（NEB，美國），質(zhì)粒DNA小提試劑盒（Qiagen，美國），BCA蛋白定量分析試劑盒（Pierce，美國）。H緩沖液（10 mM Tris-HCl（pH 7.4）/250 mM 蔗糖/1 mM EDTA緩沖液），W緩沖液[10 mM Tris-HCl（pH 7.4）/250 mM 蔗糖]，S緩沖液（洗滌緩沖液/30%蔗糖），均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 線粒體粗提? 將新鮮小鼠大腦組織切成小塊（約1 mm3），4℃、500×g離心3 min，取沉淀加入5倍體積預(yù)冷的H緩沖液，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的玻璃勻漿器（高壓滅菌）中進(jìn)行勻漿，然后在4℃、1000×g離心10 min，上清即為粗提線粒體。

1.3.2 線粒體純化? 利用簡化的蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化線粒體[3-4]。將上述粗提線粒體，4℃、15 000×g離心15 min，取沉淀用1 ml預(yù)冷的H緩沖液重懸，輕輕加到30%蔗糖緩沖液上，在4℃、2400×g水平離心5 min;離心后，小心吸取3個(gè)分層中最上面一層懸浮液并轉(zhuǎn)入新離心管;加5倍體積預(yù)冷W緩沖液重懸，4℃、15 000×g離心10 min，純化后的線粒體處于離心管壁上的少量沉淀中。

1.3.3 mtDNA提取和濃度測定 利用DNA酶去除nDNA污染，進(jìn)一步純化線粒體[5]。用500 μl W緩沖液重懸，加入DNase Ⅰ和MgCl2（終濃度分別為10 U/ml和2.5 mM），混勻，冰上孵育1 h。加入pH 8.0 EDTA至終濃度50 mM終止DNase Ⅰ酶切反應(yīng)。4℃、15 000×g離心10 min，沉淀用質(zhì)粒DNA小提試劑盒提取mtDNA。采用NanoDrop測定DNA濃度和純度初測，有無蛋白污染用BCA蛋白定量分析試劑盒測定。

1.3.4 熒光定量PCR絕對定量法測定mtDNA和nDNA含量? ?構(gòu)建分別包含小鼠線粒體基因和核基因的兩組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，線粒體基因選用ND1基因[6-8]，核基因選用β-globin基因[9-10]，通過普通PCR擴(kuò)增目的片段，T-A克隆，構(gòu)建pCRTM2.1-TOPO-ND1（526 bp）和pCRTM 2.1-TOPO-globin（551 bp）重組質(zhì)粒，菌落PCR鑒定克隆并選取陽性克隆測序確認(rèn)載體構(gòu)建成功。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后用Thermo Nanodrop測定質(zhì)粒A260的值，通過公式換算成拷貝數(shù)（copies/μl），計(jì)算公式如下：質(zhì)粒濃度換算公式（copies/μl）=濃度（ng/μl）×6.02×1014/分子量。將構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒依次十倍稀釋成108～10 copies/μl標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，并與分析樣本同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR分析[11-12]，同一樣本分別擴(kuò)增ND1和β-globin，所用引物見表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Green master mix（2×）10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板5 μl，H2O 3 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min;循環(huán)40次：95℃ 15 s，60℃ 1 min。融解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次，并做陰性對照。mtDNA樣本中檢測到nDNA拷貝數(shù)低于0.005%則可以用于后續(xù)的線粒體基因組測序。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA濃度測定和純度初測

將純化后的mtDNA樣本經(jīng)NanoDrop測定分析，結(jié)果顯示從200 mg的小鼠肝臟和大腦組織中，分別得到62.34 μg和11.82 μg mtDNA，即產(chǎn)量分別為311.7 μg/g和59.1 μg/g;其A260/280均介于1.8～2.0，A260/230濃度均大于2.0，說明樣本無蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽污染。將純化后的mtDNA樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下可觀察到一條清晰的大小約16 kb的條帶，說明樣本無降解。見表2。

2.2 建立mtDNA和nDNA拷貝數(shù)檢測方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測序結(jié)果及比對? 利用NCBI在線BLAST工具，pCRTM2.1-TOPO-ND1和pCRTM2.1-TOPO-globin兩個(gè)重組質(zhì)粒測序結(jié)果分別與GeneBank上公布的C57BL/6小鼠線粒體ND1基因和β-globin基因比對，同源性為100%和99%。結(jié)合之前的菌落PCR結(jié)果，可以確認(rèn)分別含ND1基因526 bp片段和β-globin基因551 bp片段的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。其中，pCRTM2.1-TOPO-ND1大小為4457 bp，通過全部序列計(jì)算分子量為2753 915.7 g/mol;pCRTM2.1-TOPO-globin大小為4482 bp，通過全部序列計(jì)算分子量為2769 389.1 g/mol。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立? 如圖1（a）所示，ND1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.336X+34.91，其中R2=0.9986，擴(kuò)增效率=99.42%;如圖1（b）所示，β-globin標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.343X+35.69，其中R2=0.9995，擴(kuò)增效率=99.12%。說明ND1和β-globin兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率基本一致，均接近100%，且重復(fù)性好，適于樣本的分析。

2.3熒光定量PCR絕對定量法測定mtDNA純度

將純化后的mtDNA樣本與兩個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋液一起進(jìn)行熒光定量PCR，通過上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得到純化后的兩個(gè)mtDNA樣本拷貝數(shù)，并計(jì)算nDNA/mtDNA拷貝數(shù)比值。純化的小鼠肝臟和大腦mtDNA樣本中檢測到nDNA拷貝數(shù)分別為0.0016%和0.0012%，均低于0.005%，說明其中的nDNA量極低，可用于后續(xù)的線粒體基因組測序等。見表3。

3討論

在基因組時(shí)代，線粒體基因組和核基因組一樣重要。mtDNA具有高拷貝數(shù)、無基因重組、高突變率和母系遺傳等特點(diǎn)[13]，被廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[14-15]。目前，線粒體基因組測序基本原理是將樣本總DNA或分離純化后的mtDNA隨機(jī)打斷成片段化的單鏈DNA文庫[16]，與測序接頭序列連接后再進(jìn)行高通量測序，最后通過生物信息分析從海量的全基因組數(shù)據(jù)中獲取線粒體基因組序列。

由于mtDNA和nDNA之間存在一定的同源性，很難明確地識(shí)別隨機(jī)打斷片段的起源。另外，mtDNA的長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于nDNA，如人類和小鼠mtDNA長度都約為16 kb，而相應(yīng)的nDNA長度卻為mtDNA的成千上萬倍[2，17]，因此即使是極低拷貝數(shù)的nDNA污染也會(huì)導(dǎo)致獲得的單鏈DNA文庫大多是nDNA來源。所以如何高效分離和純化mtDNA，避免nDNA的污染是線粒體基因組測序及后期拼裝分析的關(guān)鍵。而這一步的關(guān)鍵在于先分離到高純度的線粒體。經(jīng)典的線粒體分離方法有密度梯度離心法[18-19]、差速離心法[20-21]等。差速離心法是利用細(xì)胞中不同組分具有不同的沉降系數(shù)，通過不同的離心力將其分離開來，但分離出的線粒體純度往往不高。而密度梯度離心法是在離心力固定的情況下，通過有機(jī)鹽、糖類等介質(zhì)形成不同的密度區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞分離。目前使用較多的介質(zhì)有氯化銫和蔗糖，但往往操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，而且氯化銫價(jià)格昂貴，操作具有一定的危險(xiǎn)性。所以本研究首先通過30%蔗糖緩沖液簡化蔗糖密度梯度離心法，去除粗提線粒體中混雜細(xì)胞核純化線粒體。接著利用DNase Ⅰ去除線粒體提取過程中可能的nDNA污染，進(jìn)一步純化線粒體[5]，再進(jìn)行mtDNA 的提取和純化。目前，mtDNA的提取和純化主要有堿裂解法、高鹽沉淀法、Triton法三種，其中堿裂解法應(yīng)用最為廣泛，如多種質(zhì)粒提取試劑盒。因此，本研究利用質(zhì)粒提取試劑盒去除nDNA、蛋白質(zhì)和RNA等污染再一次純化mtDNA。

另外，現(xiàn)有的DNA純度鑒定方法多采用PCR擴(kuò)增后通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足后續(xù)線粒體基因組測序的要求。因此，本研究除了利用NanoDrop檢測、瓊脂糖凝膠電泳確定樣本濃度和初步鑒定純度，還分別利用含ND1和β-globin的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立了一種熒光定量PCR絕對定量法測定mtDNA和nDNA拷貝數(shù)，進(jìn)一步確定提取的mtDNA樣本純度。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)NanoDrop檢測，從小鼠肝臟和大腦組織中提取純化得到mtDNA產(chǎn)率分別為311.7 μg/g和59.1 μg/g，其A260/280均介于1.8～2.0，A260/230濃度均大于2.0，說明樣本未見蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽污染。將純化后的mtDNA樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下可觀察到一條清晰的大小約16 kb的條帶，說明樣本無降解。最后通過這種熒光定量PCR絕對定量法檢測純化后的小鼠肝臟和大腦nDNA/mtDNA拷貝數(shù)比值分別為0.0016%和0.0012%，均低于0.005%，說明其中的nDNA量極低，可用于后續(xù)的線粒體基因組測序等。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Goudenege D，Bris C，Hoffmann V，et al. eKLIPse：A sensitive tool for the detection and quantification of mitochondrial DNA deletions from next-generation sequencing data[J].Genetics in Medicined，2019，21（6）：1407-1416.

[2] Quiros PM，Goyal A，Jha P，et al.Analysis of mtDNA/nDNA ratio in mice[J].Current Protocols in Mouse Biology，2017，7（1）：47-54.

[3] Panda AP，Roy SC，Sakhare DT，et al.Reduced cytochrome oxidase activity and increased protein tyrosine phosphorylation of mitochondria-rich fractions of buffalo（Bubalus bubalis）spermatozoa after a cycle of freezing and thawing[J].Reproduction，F(xiàn)ertility and Development，2019，31（10）：1567-1580.

[4] Sharaf A，F(xiàn)ussy Z，Tomcala A，et al.Isolation of plastids and mitochondria from Chromera velia[J].Planta，2019，250（5）：1731-1741.

[5] Lang BF，Burger G.Purification of mitochondrial and plastid DNA[J].Nature Protocols，2007，2（3）：652-660.

[6] Bindi E，Li B，Zhou H，et al.Mitochondrial DNA：A biomarker of disease severity in necrotizing enterocolitis[J].European Journal of Pediatric Surgery，2020，30（1）：85-89.

[7] Hoque SAM，Umehara T，Kawai T，et al.Adverse effect of superoxide-induced mitochondrial damage in granulosa cells on follicular development in mouse ovaries[J].Free Radical Biology and Medicine，2020，163：344-355.

[8] Ibis O，Selcuk AY，Sacks BN，et al.Whole mitochondrial genome of long-clawed mole vole（Prometheomys schaposchnikowi）from Turkey，with its phylogenetic relationships[J].Genomics，2020，112（5）：3247-3255.

[9] Liu Y，Shen Q，Zhao X，et al.Cell-free mitochondrial DNA in human follicular fluid：A promising bio-marker of blastocyst developmental potential in women undergoing assisted reproductive technology[J].Reproductive Biology and Endocrinology，2019，17（1）：54.

[10] Wu J，Ren J，Liu Q，et al.Effects of changes in the levels of damage-associated molecular patterns following continuous veno-venous hemofiltration therapy on outcomes in acute kidney injury patients with sepsis[J].Frontiers in Immunology，2019，9：3052.

[11] Kavlick MF.Development of a triplex mtDNA qPCR assay to assess quantification，degradation，inhibition，and amplification target copy numbers[J].Mitochondrion，2019， 46：41-50.

[12] Wang Y，Liu Y，Zhao Y，et al.Quantification of circadian rhythm in mitochondrial DNA copy number in whole blood，and identification of factors that influence it[J].Cellular and Molecular Biology（Noisy-le-grand），2020， 66（5）：179-184.

[13] Ingman M，Kaessmann H，Paabo S，et al.Mitochondrial genome variation and the origin of modern humans[J].Nature，2000，408（6813）：708-713.

[14] Haberman Y，Karns R，Dexheimer PJ，et al.Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response[J].Nature Communications，2019， 10（38）：1-13.

[15] Reinhardt K，Dowling DK，Morrow EH. Medicine.Mitochondrial replacement，evolution，and the clinic[J].Science，2013，341（6152）：1345-1346.

[16] Weissensteiner H，F(xiàn)orer L，F(xiàn)uchsberger C，et al. mtDNA-Server：Next-generation sequencing data analysis of human mitochondrial DNA in the cloud[J].Nucleic Acids Research，2016，44（W1）：W64-69.

[17] Bosworth CM，Grandhi S，Gould MP，et al.Detection and quantification of mitochondrial DNA deletions from next-generation sequence data[J].BMC Bioinformatics，2017， 18（Suppl 12）：407.

[18] Su YX，Huang XM，Huang ZS，et al.STAT3 localizes in mitochondria-associated ER membranes instead of in mitochondria[J].Frontiers in Cell and Developmental Biology，2020，8：274.

[19] Tarasenko TA，Subota IY，Tarasenko VI，et al.Plant mitochondrial subfractions have different ability to import DNA[J].Theoretical and Experimental Plant Physiology，2020，32（1）：5-18.

[20] Long NP，Min JE，Anh NH，et al.Isolation and metabolic assessment of cancer cell mitochondria[J].Acs Omega，2020，5（42）：27 304-27 313.

[21] Fisher KE，Bradbury SP，Coates BS.Prediction of mitochondrial genome-wide variation through sequencing of mitochondrion-enriched extracts[J].Scientific Reports，2020，10（1）：19 123.

（收稿日期：2021-02-09）