黃 瑤，李紅銳，李育曉，孫靜賢，熊 勇，邵金良，黃相中，田 凱

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650504；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明)，云南 昆明 650223)

鱗毛蕨屬(DryopterisAdanson)植物在我國(guó)分布廣泛并多達(dá)300余種，其中已有20余種被列為藥用植物[1-2].有關(guān)鱗毛蕨屬植物的藥理活性研究表明，該屬中多種植物具有良好的驅(qū)蟲[3]、抑菌[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化以及抗病毒等活性[7].

重齒鱗毛蕨(Dryopterisjuxtaposita)與假邊果鱗毛蕨(Dryopteriscaroli-hopei)具有相似的生長(zhǎng)環(huán)境，生長(zhǎng)于海拔 1 500-2 500 m 的山谷或溪邊林下，在云南、四川、西藏南部等地均有分布.經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，關(guān)于重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的化學(xué)成分和藥理活性的研究較少，楊申明等[8]采用75%乙醇按料液比(m/v,1∶12)回流提取 3 h 得到重齒鱗毛蕨的粗提物并通過(guò)分光光度法測(cè)得黃酮類化合物提取率可達(dá)1.05%.由于黃酮類化合物是普遍存在于蕨類植物中的一類化學(xué)成分，不同種蕨類植物的總黃酮含量各有不同，且總黃酮成分復(fù)雜不同植物之間化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)也會(huì)存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致各植物的藥理活性也將存在差異[9].重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨在云南地區(qū)資源豐富，為了更好地開發(fā)和利用這2種蕨類植物，文中采用95%的乙醇回流提取重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨藥材獲得乙醇提取物，通過(guò)DPPH法、ABTS法、pNPG法以及脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞所建立的炎癥模型探究其抗氧化、降血糖和抗炎活性，為重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨更深入的研究與利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用重齒鱗毛蕨(Dryopterisjuxtaposita)與假邊果鱗毛蕨(Dryopteriscaroli-hopei)均采自云南省新平縣，經(jīng)云南大學(xué)陸樹剛教授鑒定；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)二氨鹽(ABTS)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；阿卡波糖(百靈威科技有限公司)；脂多糖(LPS)(Sigma公司)；α-葡萄糖苷酶(Sigma公司)；RAW264.7細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海源培生物科技股份有限公司)；NO檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(Sigma公司)；無(wú)水乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；DMSO(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；CY-500A型高速多功能粉粹機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(昆明友寧科技有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨乙醇提取物的制備

重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的全草干燥后粉碎，分別稱取粗粉 20.0 g，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇回流提取3次，每次提取時(shí)間為 2 h，棄除濾渣并對(duì)濾液進(jìn)行收集，通過(guò)減壓蒸餾分別得重齒鱗毛蕨乙醇提取物(DJE)和假邊果鱗毛蕨乙醇提取物(DCE).

1.2.2 清除DPPH自由基的活性

參照文獻(xiàn)[10]，分別將DJE和DCE用無(wú)水乙醇配制質(zhì)量濃度為：5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的樣品待測(cè)液，取 2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE各待測(cè)溶液，加入 2.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液，將溶液充分搖勻后于室溫下進(jìn)行避光反應(yīng)，時(shí)間為 30 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用多功能酶標(biāo)儀于 517 nm 處測(cè)定其吸光度值(A)，每組實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn).陽(yáng)性對(duì)照組(Vc)、樣品背景組和空白對(duì)照組采用同樣的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行測(cè)定.

DPPH自由基清除率S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,

式中，吸光度A0為 2.0 mL 無(wú)水乙醇+2.0 mL DPPH溶液；吸光度A1為 2.0 mL 待測(cè)樣品+2.0 mL DPPH溶液；吸光度A2為 2.0 mL 待測(cè)樣品+2.0 mL 無(wú)水乙醇.

1.2.3 清除ABTS自由基的活性

參照文獻(xiàn)[11]的方法，精確稱取適量的DJE和DCE，按一定的梯度將其質(zhì)量濃度分別配制為5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL，分別取DJE和DCE各待測(cè)液 0.2 mL 加入到含有 0.8 mL ABTS+工作液的試管，將其充分混勻后于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間為 6 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用多功能酶標(biāo)儀于 734 nm 處測(cè)定其吸光值(A).每組實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，以Vc為陽(yáng)性對(duì)照.

ABTS自由基清除率S(%)=(A1-A2)/A1×100,

式中，吸光度A1為 0.2 mL 無(wú)水乙醇+0.8 mL ABTS工作液；吸光度A2為 0.2 mL 樣品+0.8 mL ABTS工作液.

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶的活性

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12-14]并進(jìn)行了一定的改動(dòng)，各化合物采用96孔板對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)定.將待測(cè)的樣品用DMSO配制成終質(zhì)量濃度為：0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 μg/mL 的樣品待測(cè)液，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置酶活性組、酶空白組、實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖.具體實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系如下表：

表1 待測(cè)樣品反應(yīng)體系各組成的體積 μL

各組加入底物之前先將反應(yīng)體系于 37 ℃ 進(jìn)行恒溫孵育，時(shí)間為 5 min，加入底物后繼續(xù)將反應(yīng)體系于相同溫度下孵育 15 min 后向各反應(yīng)體系中加入終止液.實(shí)驗(yàn)中各組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各孔的總反應(yīng)體積為 150 μL，其中總體積不足的組分采用PBS進(jìn)行補(bǔ)足.采用多功能酶標(biāo)儀于 400 nm 處測(cè)定吸光度值(A).

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A實(shí)驗(yàn)-A對(duì)照實(shí)驗(yàn))/(A酶活性-A酶空白)]×100.

1.2.5 體外抗炎活性的測(cè)定

1)DJE和DES對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞的密度調(diào)整為 1×105個(gè)/L，以 200 μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在條件為 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為 24 h.培養(yǎng)結(jié)束后，分別將DJE和DES待測(cè)樣品(終質(zhì)量濃度為：6.25、12.50、25.00、50.00、100.00和 200.00 μg/mL 加入培養(yǎng)板中(50 μL/每孔)，每個(gè)樣品的各個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.加樣結(jié)束后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為 24 h，之后將濃度為 5 mg/mL 的MTT溶液分別加在各個(gè)孔中，體積為 20 μL，加樣結(jié)束后再繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)(4～6 h).取出96孔板，輕輕吸棄各孔上清液，再在每孔中加入DMSO溶液(150 μL)，在避光和室溫條件下進(jìn)行振蕩，時(shí)間為 15 min，振蕩結(jié)束后立即用多功能酶標(biāo)儀于波長(zhǎng) 490 nm 處測(cè)定其吸光度值(A)，對(duì)細(xì)胞的存活率進(jìn)行計(jì)算:

細(xì)胞存活率(%)=(A樣品/A空白)×100.

2)DJE和DES對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

參照文獻(xiàn)[16]的方法，前期細(xì)胞培養(yǎng)方法參見(1)，分別將實(shí)驗(yàn)配制的DJE和DCE待測(cè)液(終質(zhì)量濃度為：6.25、12.50、25.00、50.00和 100.00 μg/mL)加入培養(yǎng)板中(50 μL/每孔)，每個(gè)樣品的各個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.陽(yáng)性對(duì)照組：加入L-NMMA(終質(zhì)量濃度為：12.50 μg/mL).除空白組其余各組均分別以 50 μL/每孔的量加入脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞，LPS終質(zhì)量濃度為 2 μg/mL.加樣結(jié)束后細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間為 24 h，培養(yǎng)結(jié)束后分別取出各孔的上清液，并按照試劑盒的操作方法對(duì)其NO含量進(jìn)行測(cè)定.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性的結(jié)果

DJE和DCE對(duì)DPPH自由基的清除結(jié)果如圖1所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知DJE和DCE在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 μg/mL)對(duì)DPPH自由基具有不同程度的清除活性，且二者活性均呈質(zhì)量濃度依賴性，可隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增強(qiáng).DJE在5.0～80.0 μg/mL濃度內(nèi)的活性始終弱于陽(yáng)性對(duì)照(Vc)，而當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)80.0～100.0 μg/mL 時(shí)，其活性與陽(yáng)性對(duì)照組(Vc)相當(dāng).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：DJE IC50值為(15.21±1.19)μg/mL清除DPPH自由基的活性強(qiáng)于相同濃度下的DCE IC50值為(74.29±2.03)μg/mL.

圖1 DJE和DCE對(duì)DPPH自由基的清除活性 圖2 DJE和DCE對(duì)ABTS自由基的清除活性

2.2 ABTS自由基清除活性的結(jié)果

DJE和DCE對(duì)ABTS自由基的清除結(jié)果如圖2所示，由結(jié)果可知DJE和DCE在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 μg/mL)對(duì)ABTS自由基的清除活性呈濃度依賴性，可隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到 100.0 μg/mL 的時(shí)候，DJE和DCE對(duì)ABTS自由基所具有的清除率是83.7%和56.37%.在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(5.0～100.0 g/mL)陽(yáng)性對(duì)照Vc對(duì)ABTS自由基的清除活性始終強(qiáng)于DJE和DCE，其中DJE和DCE的IC50值分別可達(dá)(25.60±2.13)μg/mL和(53.69±1.85)μg/mL.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)DJE和DCE對(duì)ABTS自由基均顯示出良好的清除活性，其中DCE對(duì)ABTS自由基的清除活性明顯弱于DJE.

2.3 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的結(jié)果

一分子pNPG經(jīng)α-葡萄糖苷酶催化后可分解為一分子對(duì)硝基酚和一分子葡萄糖，對(duì)硝基酚在 400 nm 出現(xiàn)特征吸收峰，且pNPG和葡萄糖在該波長(zhǎng)下吸收很弱可忽略，因此采用pNPG法測(cè)定反應(yīng)體系在 400 nm 處的吸光值可用于評(píng)價(jià)待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力的強(qiáng)弱[16].DJE和DCE兩者的體外降血糖活性可根據(jù)其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性而進(jìn)行評(píng)價(jià)，其結(jié)果如表2所示.當(dāng)質(zhì)量濃度為(0.8～51.2)μg/mL時(shí)，待測(cè)樣品DJE和DCE對(duì)α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，二者的IC50值分別可達(dá)(1.04±0.27)μg/mL和(5.73±1.18)μg/mL.與陽(yáng)性對(duì)照Acarbose相比，重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨粗提物在均較低的濃度就對(duì)α-葡萄糖苷酶顯示出明顯的抑制作用.

表1 DJE和DCE對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性

2.4 體外抗炎活性的測(cè)定

2.4.1 DJE和DCE對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

DJE和DCE對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖3所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DJE和DCE在濃度為6.25～12.50 μg/mL 時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與繁殖沒有顯著的影響.隨著兩者質(zhì)量濃度的不斷增加，細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，尤其是當(dāng)DJE質(zhì)量濃度為 200.00 μg/mL 時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率低于50%.

圖3 DJE和DCE對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 圖4 不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

2.4.2 DJE和DCE對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

通過(guò)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型探究DJE和DCE的抗炎活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4,與空白組相比，###表示p<0.001；與模型組相比，***、**和*分別表示p<0.001、p<0.01和p<0.05.與空白組相比，模型組RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后分泌出大量NO(p<0.01)，表明細(xì)胞模型建立成功.實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同濃度的DJE和DCE待測(cè)樣品干預(yù)后，NO的釋放量均有不同程度的降低.綜合考慮DJE和DCE對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖影響，在不影響細(xì)胞正常增殖的情況下，即DJE樣品質(zhì)量濃度為6.25～12.50 μg/mL 時(shí)以及DCE樣品質(zhì)量濃度為6.25～50.00 μg/mL 時(shí)，2種植物的乙醇提取物均能不同程度抑制炎癥細(xì)胞釋放NO，具有潛在的抗炎活性.

3 結(jié)語(yǔ)

DJE和DCE均有清除DPPH和ABTS自由基的活性且有濃度依賴性，2種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法均顯示DJE的抗氧化活性強(qiáng)于DCE，尤其是當(dāng)DJE濃度為80.0～100.0 μg/mL 時(shí)，其活性與陽(yáng)性對(duì)照(Vc)相當(dāng).DJE和DCE均能不同程度地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，IC50值分別為(1.04±0.27)μg/mL 和(5.73±1.18)μg/mL.當(dāng)待測(cè)樣品濃度為6.25～12.50 μg/mL 時(shí)，DJE和DCE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與繁殖沒有顯著的影響，然而隨著兩者濃度的增大，細(xì)胞存活率逐漸減小.在抗炎活性測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DJE和DCE待測(cè)樣品干預(yù)后，NO的釋放量均有不同程度的降低，在不影響細(xì)胞正常增殖的情況下，DJE樣品濃度為6.2～12.50 μg/mL 時(shí)以及DCE樣品質(zhì)量濃度為6.25～50.00 μg/mL 時(shí)，2種植物的乙醇提取物均能不同程度抑制炎癥細(xì)胞釋放NO，具有潛在的抗炎活性.綜上所述，DJE和DCE均具有良好的抗氧化、降血糖以及抗炎活性，但蕨類植物的化學(xué)成分復(fù)雜，具體的功效成分尚不明確，本實(shí)驗(yàn)研究為今后更深入地研究重齒鱗毛蕨和假邊果鱗毛蕨的有效成分和作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).