本研究評(píng)估了兩種多肽——乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，和一種提取物——假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對(duì)皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)同增效促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合給藥能夠顯著增加皮膚抗衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，獲得穩(wěn)定、顯著的抗衰老效果。本研究評(píng)價(jià)了5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于HFF-1細(xì)胞，對(duì)Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、LOXL-1、Col-I等膠原蛋白和彈性蛋白相關(guān)mRNA分子的影響。采用5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯+5μg/mL乙?；碾?2+5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合進(jìn)行細(xì)胞給藥，與5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)給藥相比，聯(lián)合給藥能協(xié)同促進(jìn)HFF-1細(xì)胞中Col-I、LOXL-1，Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β的mRNA的表達(dá)（p<0.05）。因此，乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物的聯(lián)合應(yīng)用，具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性，具備在化妝品產(chǎn)品中少量添加就能達(dá)到更好效果的應(yīng)用前景。

皮膚中存在眾多的ECM（extracellular matrix，細(xì)胞外基質(zhì)）蛋白，其中膠原蛋白、彈性蛋白是最重要的兩種[1，2]，它們?cè)谄つw抗衰老中起著非常重要的作用。除了膠原蛋白和彈性蛋白，還有非常多的結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)輔助蛋白[8，9，10]。在這些結(jié)構(gòu)輔助蛋白里，LOXL-1是一種很重要的細(xì)胞外依賴銅的胺氧化酶[6，7]，催化膠原蛋白和彈性蛋白中交叉鏈接形成的第一步，其表達(dá)量的增加能更好地促進(jìn)膠原蛋白和彈性蛋白纖維的生成[13-15]。

彈性蛋白是彈性纖維（elasticfibers）的主要成分。彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁。彈性纖維與膠原纖維共同存在，賦予組織以彈性和抗張能力。盡管彈性蛋白只占真皮總蛋白的2%，但它對(duì)皮膚彈性起著重要作用[16-19]。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物都是各大化妝品公司經(jīng)常使用的核心原料，原料供應(yīng)商提供的之前的研究資料表明，乙酰基二肽-1鯨蠟酯能有效促進(jìn)彈力蛋白的再生，注重彈性纖維的修復(fù)，為肌膚打造一層健康、緊致的纖維網(wǎng)絡(luò)，抑制表情紋。它同時(shí)被稱作肌膚的“彈力素”，可支撐松垮的皮膚，提供緊致上揚(yáng)的彈力。乙?；碾?2可以上調(diào)與膠原蛋白合成和黏著斑有關(guān)的基因表達(dá)，誘導(dǎo)彈性蛋白、I型膠原蛋白合成，從而增加皮膚緊實(shí)度。假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)I型，IV型膠原蛋白和彈性蛋白合成，提高皮膚屏障功能，減少炎性基因表達(dá)，抑制脂質(zhì)過氧化等諸多功效，然而對(duì)這三者進(jìn)行的單獨(dú)和聯(lián)合的功效比較測試還未有研究，此次研究就評(píng)估了三個(gè)原料的聯(lián)合對(duì)皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)同增效促進(jìn)作用。

材料和方法

01試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），雙抗（20200828，北京索萊寶科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康為世紀(jì)），三氯甲烷（20200105，國藥化學(xué)試劑），HiFiScriptcDNASynthesisKit（100rxns34520，康為世紀(jì)），UltraSYBR（31420，康為世紀(jì)），噻唑藍(lán)（MTT，Sigma-Aldrich公司，M2128-100MG），HFF-1人皮膚成纖維樣細(xì)胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)條件：5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基：89% DMEM+10%FBS+1%雙抗），乙?；?1鯨蠟酯（1453629，Sederma），乙酰基四肽-2（U19B013-20，Lipotec），假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物顯微鏡（LWD300-38LT，上海測維光電技術(shù)有限公司），恒溫水浴鍋（HH-1嘉興俊思電子有限公司），高速冷凍離心機(jī)（SorvallLegendMicro17R，Thermo），CO2培養(yǎng)箱（BB150，Thermo），純水儀（Smart-DUF，上海和泰儀器有限公司），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMaxiD3，MolecularDevices）。

02測試方法

2.1細(xì)胞毒性測試

取指數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×104cells/mL的密度接種于96孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)終體積為0.2mL，而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養(yǎng)終體積為0.2mL。24h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞毒性情況。MTT法檢測細(xì)胞毒性，于490nm測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活率。細(xì)胞活率=ASample/AControl×100%。

2.2 qPCR檢測

取指數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×105cells/mL的密度接種于6孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)終體積為2mL。而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養(yǎng)終體積為2mL。24h后，按RNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各孔R(shí)NA，qPCR法檢測HFF-1細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達(dá)影響。

2.3受試物的配制方法

受試物和對(duì)照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用無血清培養(yǎng)基或者PBS稀釋至合適濃度。

2.4分組與給藥（表1）

2.5指標(biāo)檢測

細(xì)胞給藥后提取總RNA，qPCR，檢測HFF-1細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達(dá)影響。

2.6數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel錄入和GraphPadPrism7軟件包統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各組間做單因素方差分析（ANOVA）。認(rèn)為p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

01受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞毒性的影響

分別用0.1、0.5、1、5、10、20、40μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物，或乙?；?1鯨蠟酯：乙?；碾?2：假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物質(zhì)量比為1：1：1聯(lián)合給藥，MTT法評(píng)估細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，乙?；?1鯨蠟酯在20ug/mL下都沒有細(xì)胞毒性，乙?；碾?2在40ug/mL都沒有毒性，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物在40ug/mL下都沒有細(xì)胞毒性，乙?；?1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三者1：1：1聯(lián)合給藥，在20ug/mL下非但沒有細(xì)胞毒性，而且還能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合給藥24h對(duì)HFF-1細(xì)胞增殖的影響。n=3，Mean±SEM?！?**”表示與對(duì)照組相比p<0.001。

02受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

本研究選取5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)HFF-1細(xì)胞孵育24h，提取細(xì)胞總RNA后，qPCR檢測膠原蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)給藥能促進(jìn)COL-I，COL-III，COL-IV，LOXL-1的表達(dá)，與單獨(dú)給藥相比，5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥，協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Col-I、LOXL-1mRNA的表達(dá)（p<0.05）。

乙?；?1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合給藥24h對(duì)HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。n=3，Mean±SEM?！?”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05，“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01，“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

03受試物對(duì)HFF-1細(xì)胞彈性蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或1：1：1聯(lián)合對(duì)HFF-1細(xì)胞孵育24h，提取細(xì)胞總RNA后，qPCR檢測彈性蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)給藥能促進(jìn)Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin的mRNA表達(dá)，與單獨(dú)給藥相比，5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA的表達(dá)（p<0.05）。

乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨(dú)或聯(lián)合處理24h對(duì)HFF-1細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響。n=3，Mean±SEM?！?”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05，“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01，“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

小結(jié)與討論

化妝品中的生物多肽類化合物具有高生物活性、易吸收、安全無毒的獨(dú)特優(yōu)勢。近年來其在美容護(hù)膚、抗衰老研究課題中的生理作用與生物效應(yīng)逐漸引發(fā)關(guān)注[3，4，11，12];多肽的生物學(xué)活性取決于其氨基酸組成和序列，人體內(nèi)各種生理進(jìn)程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質(zhì)調(diào)控的。因此，生物活性肽為化妝品研發(fā)和應(yīng)用提供了全新方向和思路，并且功能越來越細(xì)分，如抗衰老、抗過敏、修復(fù)、抗氧化、抗水腫、促進(jìn)毛發(fā)再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妝品中能夠幫助改善、修復(fù)皮膚的各種問題，但目前單種多肽活性物質(zhì)應(yīng)用報(bào)道較多，而多種多肽和活性物的組合應(yīng)用研究開發(fā)較少[5]，特別是多種不同類型的肽類和活性物組合針對(duì)抗衰老的靶點(diǎn)協(xié)同增效作用報(bào)道較少。本研究中的多肽提取物組合協(xié)同增效結(jié)果，在活性物組合的研究中，具備較強(qiáng)的創(chuàng)新性。在本研究中，我們采用乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥，發(fā)現(xiàn)協(xié)同給藥能協(xié)同促進(jìn)HFF-1細(xì)胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5mRNA的表達(dá)，獲得更強(qiáng)、更顯著的抗衰老效果。

綜上所述，本研究采用乙?；?1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2和假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三種活性組份，針對(duì)抗衰老的靶點(diǎn)進(jìn)行協(xié)同增效作用，能夠顯著地增加對(duì)抗衰老相關(guān)的重要蛋白的表達(dá)。因而，本研究中的抗衰老組合物、乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物的聯(lián)合應(yīng)用，具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性，因?yàn)槁?lián)合作用功效增強(qiáng)了，在同等的功效下，聯(lián)合作用原料可以用量更小，所以這樣的組合具備在化妝品產(chǎn)品中少量添加就能達(dá)到更好效果的應(yīng)用前景。

作者介紹：洪民華，供職于懿奈（上海）生物科技有限公司。