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        多肽復(fù)配組合物對皮膚結(jié)構(gòu)相關(guān)效應(yīng)蛋白促進(jìn)表達(dá)協(xié)同增效的研究

        2022-03-26 13:29:04洪民華
        中國化妝品 2022年3期
        關(guān)鍵詞:二肽乙?;?/a>抗衰老

        本研究評估了兩種多肽——乙酰基二肽-1鯨蠟酯,乙酰基四肽-2,和一種提取物——假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物對皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)同增效促進(jìn)作用,發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合給藥能夠顯著增加皮膚抗衰老相關(guān)蛋白的表達(dá),獲得穩(wěn)定、顯著的抗衰老效果。本研究評價了5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙?;碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或聯(lián)合應(yīng)用于HFF-1細(xì)胞,對Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、LOXL-1、Col-I等膠原蛋白和彈性蛋白相關(guān)mRNA分子的影響。采用5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯+5μg/mL乙?;碾?2+5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合進(jìn)行細(xì)胞給藥,與5μg/mL乙?;?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨給藥相比,聯(lián)合給藥能協(xié)同促進(jìn)HFF-1細(xì)胞中Col-I、LOXL-1,Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β的mRNA的表達(dá)(p<0.05)。因此,乙?;?1鯨蠟酯,乙?;碾?2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物的聯(lián)合應(yīng)用,具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性,具備在化妝品產(chǎn)品中少量添加就能達(dá)到更好效果的應(yīng)用前景。

        皮膚中存在眾多的ECM(extracellular matrix,細(xì)胞外基質(zhì))蛋白,其中膠原蛋白、彈性蛋白是最重要的兩種[1,2],它們在皮膚抗衰老中起著非常重要的作用。除了膠原蛋白和彈性蛋白,還有非常多的結(jié)構(gòu)蛋白,結(jié)構(gòu)輔助蛋白[8,9,10]。在這些結(jié)構(gòu)輔助蛋白里,LOXL-1是一種很重要的細(xì)胞外依賴銅的胺氧化酶[6,7],催化膠原蛋白和彈性蛋白中交叉鏈接形成的第一步,其表達(dá)量的增加能更好地促進(jìn)膠原蛋白和彈性蛋白纖維的生成[13-15]。

        彈性蛋白是彈性纖維(elasticfibers)的主要成分。彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁。彈性纖維與膠原纖維共同存在,賦予組織以彈性和抗張能力。盡管彈性蛋白只占真皮總蛋白的2%,但它對皮膚彈性起著重要作用[16-19]。

        乙?;?1鯨蠟酯,乙?;碾?2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物都是各大化妝品公司經(jīng)常使用的核心原料,原料供應(yīng)商提供的之前的研究資料表明,乙酰基二肽-1鯨蠟酯能有效促進(jìn)彈力蛋白的再生,注重彈性纖維的修復(fù),為肌膚打造一層健康、緊致的纖維網(wǎng)絡(luò),抑制表情紋。它同時被稱作肌膚的“彈力素”,可支撐松垮的皮膚,提供緊致上揚(yáng)的彈力。乙?;碾?2可以上調(diào)與膠原蛋白合成和黏著斑有關(guān)的基因表達(dá),誘導(dǎo)彈性蛋白、I型膠原蛋白合成,從而增加皮膚緊實度。假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)I型,IV型膠原蛋白和彈性蛋白合成,提高皮膚屏障功能,減少炎性基因表達(dá),抑制脂質(zhì)過氧化等諸多功效,然而對這三者進(jìn)行的單獨和聯(lián)合的功效比較測試還未有研究,此次研究就評估了三個原料的聯(lián)合對皮膚相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)同增效促進(jìn)作用。

        材料和方法

        01試劑與儀器

        DMEM培養(yǎng)基(20210121/20210406,Cellmax),血清(2132094P,Gibco),胰酶(20210113/20210323,碧云天),雙抗(20200828,北京索萊寶科技有限公司),TRIzon(03877/35120,康為世紀(jì)),三氯甲烷(20200105,國藥化學(xué)試劑),HiFiScriptcDNASynthesisKit(100rxns34520,康為世紀(jì)),UltraSYBR(31420,康為世紀(jì)),噻唑藍(lán)(MTT,Sigma-Aldrich公司,M2128-100MG),HFF-1人皮膚成纖維樣細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細(xì)胞庫,培養(yǎng)條件:5% CO2,37℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基:89% DMEM+10%FBS+1%雙抗),乙?;?1鯨蠟酯(1453629,Sederma),乙?;碾?2(U19B013-20,Lipotec),假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物(U07K010-19,Lipotec),生物顯微鏡(LWD300-38LT,上海測維光電技術(shù)有限公司),恒溫水浴鍋(HH-1嘉興俊思電子有限公司),高速冷凍離心機(jī)(SorvallLegendMicro17R,Thermo),CO2培養(yǎng)箱(BB150,Thermo),純水儀(Smart-DUF,上海和泰儀器有限公司),多功能酶標(biāo)儀(SpectraMaxiD3,MolecularDevices)。

        02測試方法

        2.1細(xì)胞毒性測試

        取指數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以1×104cells/mL的密度接種于96孔板上,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)終體積為0.2mL,而后吸棄上清,加入新鮮制備的不同濃度的藥物(無血清)或者不加藥物(無血清)孵育,培養(yǎng)終體積為0.2mL。24h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞毒性情況。MTT法檢測細(xì)胞毒性,于490nm測定吸光度,計算細(xì)胞活率。細(xì)胞活率=ASample/AControl×100%。

        2.2 qPCR檢測

        取指數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以1×105cells/mL的密度接種于6孔板上,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)終體積為2mL。而后吸棄上清,加入新鮮制備的不同濃度的藥物(無血清)或者不加藥物(無血清)孵育,培養(yǎng)終體積為2mL。24h后,按RNA提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各孔RNA,qPCR法檢測HFF-1細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達(dá)影響。

        2.3受試物的配制方法

        受試物和對照品用DMSO或者ddH2O配制成母液,再用無血清培養(yǎng)基或者PBS稀釋至合適濃度。

        2.4分組與給藥(表1)

        2.5指標(biāo)檢測

        細(xì)胞給藥后提取總RNA,qPCR,檢測HFF-1細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達(dá)影響。

        2.6數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析

        采用Excel錄入和GraphPadPrism7軟件包統(tǒng)計處理,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。各組間做單因素方差分析(ANOVA)。認(rèn)為p<0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

        結(jié)果

        01受試物對HFF-1細(xì)胞毒性的影響

        分別用0.1、0.5、1、5、10、20、40μg/mL乙?;?1鯨蠟酯,乙?;碾?2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物,或乙?;?1鯨蠟酯:乙酰基四肽-2:假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物質(zhì)量比為1:1:1聯(lián)合給藥,MTT法評估細(xì)胞毒性,結(jié)果如圖1所示,由圖1可知,乙酰基二肽-1鯨蠟酯在20ug/mL下都沒有細(xì)胞毒性,乙?;碾?2在40ug/mL都沒有毒性,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物在40ug/mL下都沒有細(xì)胞毒性,乙?;?1鯨蠟酯,乙?;碾?2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三者1:1:1聯(lián)合給藥,在20ug/mL下非但沒有細(xì)胞毒性,而且還能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

        乙酰基二肽-1鯨蠟酯,乙酰基四肽-2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或聯(lián)合給藥24h對HFF-1細(xì)胞增殖的影響。n=3,Mean±SEM。“***”表示與對照組相比p<0.001。

        02受試物對HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

        本研究選取5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或聯(lián)合對HFF-1細(xì)胞孵育24h,提取細(xì)胞總RNA后,qPCR檢測膠原蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá),結(jié)果如圖2所示。5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨給藥能促進(jìn)COL-I,COL-III,COL-IV,LOXL-1的表達(dá),與單獨給藥相比,5μg/mL乙?;?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?;碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥,協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Col-I、LOXL-1mRNA的表達(dá)(p<0.05)。

        乙?;?1鯨蠟酯、乙?;碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或聯(lián)合給藥24h對HFF-1細(xì)胞膠原蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。n=3,Mean±SEM?!?”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05,“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01,“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

        03受試物對HFF-1細(xì)胞彈性蛋白相關(guān)基因表達(dá)的影響

        5μg/mL乙?;?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?;碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或1:1:1聯(lián)合對HFF-1細(xì)胞孵育24h,提取細(xì)胞總RNA后,qPCR檢測彈性蛋白相關(guān)mRNA的表達(dá),結(jié)果如圖3所示。5μg/mL乙?;?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?;碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨給藥能促進(jìn)Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin的mRNA表達(dá),與單獨給藥相比,5μg/mL乙?;?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥協(xié)同增加HFF-1細(xì)胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA的表達(dá)(p<0.05)。

        乙?;?1鯨蠟酯,乙?;碾?2,假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物單獨或聯(lián)合處理24h對HFF-1細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響。n=3,Mean±SEM。“*”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05,“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01,“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

        小結(jié)與討論

        化妝品中的生物多肽類化合物具有高生物活性、易吸收、安全無毒的獨特優(yōu)勢。近年來其在美容護(hù)膚、抗衰老研究課題中的生理作用與生物效應(yīng)逐漸引發(fā)關(guān)注[3,4,11,12];多肽的生物學(xué)活性取決于其氨基酸組成和序列,人體內(nèi)各種生理進(jìn)程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質(zhì)調(diào)控的。因此,生物活性肽為化妝品研發(fā)和應(yīng)用提供了全新方向和思路,并且功能越來越細(xì)分,如抗衰老、抗過敏、修復(fù)、抗氧化、抗水腫、促進(jìn)毛發(fā)再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妝品中能夠幫助改善、修復(fù)皮膚的各種問題,但目前單種多肽活性物質(zhì)應(yīng)用報道較多,而多種多肽和活性物的組合應(yīng)用研究開發(fā)較少[5],特別是多種不同類型的肽類和活性物組合針對抗衰老的靶點協(xié)同增效作用報道較少。本研究中的多肽提取物組合協(xié)同增效結(jié)果,在活性物組合的研究中,具備較強(qiáng)的創(chuàng)新性。在本研究中,我們采用乙?;?1鯨蠟酯、乙?;碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物聯(lián)合給藥,發(fā)現(xiàn)協(xié)同給藥能協(xié)同促進(jìn)HFF-1細(xì)胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5mRNA的表達(dá),獲得更強(qiáng)、更顯著的抗衰老效果。

        綜上所述,本研究采用乙?;?1鯨蠟酯、乙酰基四肽-2和假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物三種活性組份,針對抗衰老的靶點進(jìn)行協(xié)同增效作用,能夠顯著地增加對抗衰老相關(guān)的重要蛋白的表達(dá)。因而,本研究中的抗衰老組合物、乙酰基二肽-1鯨蠟酯、乙?;碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產(chǎn)物的聯(lián)合應(yīng)用,具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性,因為聯(lián)合作用功效增強(qiáng)了,在同等的功效下,聯(lián)合作用原料可以用量更小,所以這樣的組合具備在化妝品產(chǎn)品中少量添加就能達(dá)到更好效果的應(yīng)用前景。

        作者介紹:洪民華,供職于懿奈(上海)生物科技有限公司。

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