本研究評估了兩種多肽——乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，和一種提取物——假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物對皮膚相關結構蛋白的協(xié)同增效促進作用，發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合給藥能夠顯著增加皮膚抗衰老相關蛋白的表達，獲得穩(wěn)定、顯著的抗衰老效果。本研究評價了5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或聯(lián)合應用于HFF-1細胞，對Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、LOXL-1、Col-I等膠原蛋白和彈性蛋白相關mRNA分子的影響。采用5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯+5μg/mL乙?；碾?2+5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物聯(lián)合進行細胞給藥，與5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨給藥相比，聯(lián)合給藥能協(xié)同促進HFF-1細胞中Col-I、LOXL-1，Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β的mRNA的表達（p<0.05）。因此，乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產物的聯(lián)合應用，具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性，具備在化妝品產品中少量添加就能達到更好效果的應用前景。

皮膚中存在眾多的ECM（extracellular matrix，細胞外基質）蛋白，其中膠原蛋白、彈性蛋白是最重要的兩種[1，2]，它們在皮膚抗衰老中起著非常重要的作用。除了膠原蛋白和彈性蛋白，還有非常多的結構蛋白，結構輔助蛋白[8，9，10]。在這些結構輔助蛋白里，LOXL-1是一種很重要的細胞外依賴銅的胺氧化酶[6，7]，催化膠原蛋白和彈性蛋白中交叉鏈接形成的第一步，其表達量的增加能更好地促進膠原蛋白和彈性蛋白纖維的生成[13-15]。

彈性蛋白是彈性纖維（elasticfibers）的主要成分。彈性纖維主要存在于韌帶和脈管壁。彈性纖維與膠原纖維共同存在，賦予組織以彈性和抗張能力。盡管彈性蛋白只占真皮總蛋白的2%，但它對皮膚彈性起著重要作用[16-19]。

乙?；?1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物都是各大化妝品公司經(jīng)常使用的核心原料，原料供應商提供的之前的研究資料表明，乙?；?1鯨蠟酯能有效促進彈力蛋白的再生，注重彈性纖維的修復，為肌膚打造一層健康、緊致的纖維網(wǎng)絡，抑制表情紋。它同時被稱作肌膚的“彈力素”，可支撐松垮的皮膚，提供緊致上揚的彈力。乙?；碾?2可以上調與膠原蛋白合成和黏著斑有關的基因表達，誘導彈性蛋白、I型膠原蛋白合成，從而增加皮膚緊實度。假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物具有促進成纖維細胞增殖，誘導I型，IV型膠原蛋白和彈性蛋白合成，提高皮膚屏障功能，減少炎性基因表達，抑制脂質過氧化等諸多功效，然而對這三者進行的單獨和聯(lián)合的功效比較測試還未有研究，此次研究就評估了三個原料的聯(lián)合對皮膚相關結構蛋白的協(xié)同增效促進作用。

材料和方法

01試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（20210121/20210406，Cellmax），血清（2132094P，Gibco），胰酶（20210113/20210323，碧云天），雙抗（20200828，北京索萊寶科技有限公司），TRIzon（03877/35120，康為世紀），三氯甲烷（20200105，國藥化學試劑），HiFiScriptcDNASynthesisKit（100rxns34520，康為世紀），UltraSYBR（31420，康為世紀），噻唑藍（MTT，Sigma-Aldrich公司，M2128-100MG），HFF-1人皮膚成纖維樣細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫，培養(yǎng)條件：5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基：89% DMEM+10%FBS+1%雙抗），乙酰基二肽-1鯨蠟酯（1453629，Sederma），乙酰基四肽-2（U19B013-20，Lipotec），假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物（U07K010-19，Lipotec），生物顯微鏡（LWD300-38LT，上海測維光電技術有限公司），恒溫水浴鍋（HH-1嘉興俊思電子有限公司），高速冷凍離心機（SorvallLegendMicro17R，Thermo），CO2培養(yǎng)箱（BB150，Thermo），純水儀（Smart-DUF，上海和泰儀器有限公司），多功能酶標儀（SpectraMaxiD3，MolecularDevices）。

02測試方法

2.1細胞毒性測試

取指數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，以1×104cells/mL的密度接種于96孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細胞貼壁，培養(yǎng)終體積為0.2mL，而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養(yǎng)終體積為0.2mL。24h后，顯微鏡下觀察細胞毒性情況。MTT法檢測細胞毒性，于490nm測定吸光度，計算細胞活率。細胞活率=ASample/AControl×100%。

2.2 qPCR檢測

取指數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，以1×105cells/mL的密度接種于6孔板上，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h使細胞貼壁，培養(yǎng)終體積為2mL。而后吸棄上清，加入新鮮制備的不同濃度的藥物（無血清）或者不加藥物（無血清）孵育，培養(yǎng)終體積為2mL。24h后，按RNA提取標準操作流程提取各孔RNA，qPCR法檢測HFF-1細胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達影響。

2.3受試物的配制方法

受試物和對照品用DMSO或者ddH2O配制成母液，再用無血清培養(yǎng)基或者PBS稀釋至合適濃度。

2.4分組與給藥（表1）

2.5指標檢測

細胞給藥后提取總RNA，qPCR，檢測HFF-1細胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、Col-XVII、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、Decorin、LOXL-1、TGF-β、IntegrinmRNA的表達影響。

2.6數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析

采用Excel錄入和GraphPadPrism7軟件包統(tǒng)計處理，以均數(shù)±標準誤表示。各組間做單因素方差分析（ANOVA）。認為p<0.05有統(tǒng)計學差異。

結果

01受試物對HFF-1細胞毒性的影響

分別用0.1、0.5、1、5、10、20、40μg/mL乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物，或乙?；?1鯨蠟酯：乙酰基四肽-2：假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物質量比為1：1：1聯(lián)合給藥，MTT法評估細胞毒性，結果如圖1所示，由圖1可知，乙?；?1鯨蠟酯在20ug/mL下都沒有細胞毒性，乙?；碾?2在40ug/mL都沒有毒性，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物在40ug/mL下都沒有細胞毒性，乙酰基二肽-1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物三者1：1：1聯(lián)合給藥，在20ug/mL下非但沒有細胞毒性，而且還能促進細胞增殖。

乙?；?1鯨蠟酯，乙酰基四肽-2，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或聯(lián)合給藥24h對HFF-1細胞增殖的影響。n=3，Mean±SEM?！?**”表示與對照組相比p<0.001。

02受試物對HFF-1細胞膠原蛋白相關基因表達的影響

本研究選取5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或聯(lián)合對HFF-1細胞孵育24h，提取細胞總RNA后，qPCR檢測膠原蛋白相關mRNA的表達，結果如圖2所示。5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨給藥能促進COL-I，COL-III，COL-IV，LOXL-1的表達，與單獨給藥相比，5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物聯(lián)合給藥，協(xié)同增加HFF-1細胞Col-I、LOXL-1mRNA的表達（p<0.05）。

乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或聯(lián)合給藥24h對HFF-1細胞膠原蛋白相關基因mRNA表達的影響。n=3，Mean±SEM?！?”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05，“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01，“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

03受試物對HFF-1細胞彈性蛋白相關基因表達的影響

5μg/mL乙酰基二肽-1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或1：1：1聯(lián)合對HFF-1細胞孵育24h，提取細胞總RNA后，qPCR檢測彈性蛋白相關mRNA的表達，結果如圖3所示。5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙酰基四肽-2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨給藥能促進Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-β、Integrin的mRNA表達，與單獨給藥相比，5μg/mL乙?；?1鯨蠟酯、5μg/mL乙?；碾?2、5μg/mL假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物聯(lián)合給藥協(xié)同增加HFF-1細胞Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5、TGF-βmRNA的表達（p<0.05）。

乙?；?1鯨蠟酯，乙?；碾?2，假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物單獨或聯(lián)合處理24h對HFF-1細胞相關mRNA表達的影響。n=3，Mean±SEM?！?”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.05，“**”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.01，“***”表示與聯(lián)合給藥組相比p<0.001。

小結與討論

化妝品中的生物多肽類化合物具有高生物活性、易吸收、安全無毒的獨特優(yōu)勢。近年來其在美容護膚、抗衰老研究課題中的生理作用與生物效應逐漸引發(fā)關注[3，4，11，12];多肽的生物學活性取決于其氨基酸組成和序列，人體內各種生理進程幾乎都是由特定的氨基酸序列組成的多肽或者蛋白質調控的。因此，生物活性肽為化妝品研發(fā)和應用提供了全新方向和思路，并且功能越來越細分，如抗衰老、抗過敏、修復、抗氧化、抗水腫、促進毛發(fā)再生、抑制黑色素生成等。添加多肽到化妝品中能夠幫助改善、修復皮膚的各種問題，但目前單種多肽活性物質應用報道較多，而多種多肽和活性物的組合應用研究開發(fā)較少[5]，特別是多種不同類型的肽類和活性物組合針對抗衰老的靶點協(xié)同增效作用報道較少。本研究中的多肽提取物組合協(xié)同增效結果，在活性物組合的研究中，具備較強的創(chuàng)新性。在本研究中，我們采用乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物聯(lián)合給藥，發(fā)現(xiàn)協(xié)同給藥能協(xié)同促進HFF-1細胞Col-I、LOXL-1、Elastin、Fibrillin-1、Fibulin-5mRNA的表達，獲得更強、更顯著的抗衰老效果。

綜上所述，本研究采用乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2和假交替單胞菌發(fā)酵產物提取物三種活性組份，針對抗衰老的靶點進行協(xié)同增效作用，能夠顯著地增加對抗衰老相關的重要蛋白的表達。因而，本研究中的抗衰老組合物、乙?；?1鯨蠟酯、乙?；碾?2、假交替單胞菌發(fā)酵產物的聯(lián)合應用，具有更好的協(xié)同增效的抗衰老活性，因為聯(lián)合作用功效增強了，在同等的功效下，聯(lián)合作用原料可以用量更小，所以這樣的組合具備在化妝品產品中少量添加就能達到更好效果的應用前景。

作者介紹：洪民華，供職于懿奈（上海）生物科技有限公司。