劉 強(qiáng) ，盧亞紅，吳 慧，馬瑜浩 ，張宇鵬，孫文瀟，張 宏*

（1.西北民族大學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730030；2.環(huán)境友好復(fù)合材料國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030）

0 前言

PE塑料發(fā)展至今因其具有生產(chǎn)成本低、防水和堅(jiān)固耐用等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)（如塑料地膜、澆灌水帶）、生活用品（如塑料吸管、包裝袋）、建筑領(lǐng)域（如管材）的生產(chǎn)制造中，成為我們?nèi)粘Ｉ钪袩o法代替的材料［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年全球塑料的生產(chǎn)量都在不斷增長(zhǎng)，截止2018年總產(chǎn)量達(dá)到7.8×109t，中國塑料的生產(chǎn)量在全球塑料產(chǎn)量中占比最大，年產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的25%［2］，但是據(jù)生態(tài)環(huán)境部統(tǒng)計(jì)，2019年我國廢棄塑料的回收率不到10%。這些被人們隨意丟棄在自然環(huán)境中的塑料因其高疏水性和化學(xué)惰性很難在環(huán)境中自然降解，所以導(dǎo)致產(chǎn)生世界性的“白色污染”問題，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了巨大的影響。目前全球?qū)τ谶@些極難被自然降解的PE塑料主要采用比較原始的處理方式，如填埋、焚燒［3］、堆肥等。但這些方式會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的二次污染，填埋的塑料隨著時(shí)間的推移會(huì)使其變成危害性更大的微塑料［4］，可能會(huì)通過食物被人體吸收，其對(duì)于人體的具體危害情況還未見報(bào)道。目前的研究認(rèn)為，生物降解可將廢舊PE同化最后產(chǎn)物只有CO2和H2O，所以生物降解作為環(huán)境友好的處理方法可很好地解決廢舊PE的污染治理難題。

目前，廣泛應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｉ钪械乃芰掀贩N主要包括聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）、PE、聚氯乙烯（PVC）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）和聚氨酯（PU）等。近年來對(duì)這些塑料的微生物降解研究已經(jīng)初見成果，其中PET、PS和PU的微生物代謝途徑已經(jīng)被研究者發(fā)現(xiàn)［5-6］。PVC和PP由于官能團(tuán)和雙鍵的存在增加了降解酶的作用位點(diǎn)，所以與PE相比有利于微生物的降解；PE由于具有高疏水性、高分子量和結(jié)晶度導(dǎo)致在微生物降解中難于其他各種塑料，所以PE的微生物降解成為本文的關(guān)注點(diǎn)。

自20世紀(jì)70年代以來，大量報(bào)道證實(shí)，在自然環(huán)境中存在以PE為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，這為PE廢物處理提供了新的思路［7］?，F(xiàn)在全球的生物學(xué)家意在尋找一種高效的PE降解菌。在報(bào)道中，大多數(shù)研究人員采用比較傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法對(duì)PE降解菌進(jìn)行分離，最后通過對(duì)降解前后聚合物物理化學(xué)性質(zhì)的變化來評(píng)價(jià)各降解菌的降解效率，這些物理化學(xué)性質(zhì)的變化包括7個(gè)方面：表面官能團(tuán)、親水性/疏水性、結(jié)晶度、分子量、表面形貌、力學(xué)性能和質(zhì)量損失［8］。各研究人員雖然在研究流程上大體相同，但是在降解能力測(cè)試中由于所用PE類型的不同和表征方法的誤用等因素，造成無法對(duì)各類型降解菌的降解效率進(jìn)行對(duì)比，讓PE降解研究中的工作者不能很好地理解“高效”這一概念；甚至?xí)?dǎo)致篩選出假陽性降解表型的菌株，阻礙了PE生物降解研究的發(fā)展。所以Montazer等［9］在2019年提出了一種“生物降解實(shí)驗(yàn)的建議流程”，以闡明實(shí)現(xiàn)PE生物降解所需的參數(shù)并簡(jiǎn)化PE微生物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較。本文將從參與降解的微生物和表征方法對(duì)近期的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，對(duì)上述的“生物降解實(shí)驗(yàn)的建議流程”進(jìn)行改進(jìn)和補(bǔ)充，為進(jìn)一步研究PE的微生物降解特別是降解菌的高效性定義上提供理論參考。

1 參與PE降解的微生物

大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)許多研究者從自然環(huán)境（土壤、海洋、垃圾處理站等）和特定培養(yǎng)基中篩選出了能夠降解PE的微生物，還有一些菌株在印度粉蛾和蠟蟲的腸道中被發(fā)現(xiàn)［7］。研究者們利用不同的技術(shù)手段對(duì)降解前后的聚合物進(jìn)行表征，證實(shí)了自己實(shí)驗(yàn)中篩選的菌株對(duì)聚合物進(jìn)行了不同程度的降解。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前篩選出的微生物中細(xì)菌種類最多；放線菌最少。眾所周知，土壤中的菌落組成中放線菌的數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌，但是報(bào)道中少見放線菌菌株從土壤中被篩選出來，這與統(tǒng)計(jì)結(jié)果產(chǎn)生了矛盾，作者認(rèn)為造成這種矛盾的原因是由于實(shí)驗(yàn)條件和培養(yǎng)基選擇上的限制，所以放線菌的篩選應(yīng)該引起研究者的注意。相信在以后的研究中，隨著篩選方案的優(yōu)化和新技術(shù)的應(yīng)用，越來越多且降解能力極強(qiáng)的菌株會(huì)被報(bào)道出來。

1.1 參與PE塑料微生物降解的細(xì)菌菌株

超過20個(gè)細(xì)菌屬已被證明能降解不同類型的PE。這些菌包括各種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌菌屬、克雷伯氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬等，以及紅球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌等［10-13］。這些細(xì)菌菌株中的大多數(shù)都具有破壞PE表面和（或）在PE上形成生物膜的能力。表1總結(jié)了近年來被發(fā)現(xiàn)的與PE生物降解相關(guān)的細(xì)菌菌株。報(bào)道中，大多數(shù)研究者使用低密度聚乙烯（PE-LD）和高密度聚乙烯（PE-HD）作為降解菌的唯一碳源。2016年，Kowalczyk等［14］從土壤中分離到一株新的木糖氧化芽孢桿菌PE-1，用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)降解前后的樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果表明PE-HD的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由于木糖氧化桿菌PE-1對(duì)PE-HD薄膜的降解作用，最后還檢測(cè)到約9%的質(zhì)量損失。2018年，Ndahebwa Muhonja等［15］從丹多拉垃圾場(chǎng)篩選出一些PE降解細(xì)菌，對(duì)細(xì)菌的16S rDNA和18S rDNA序列分析表明，屬于真假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、纖維素微生物屬、賴氨酸桿菌屬，在以PE-LD為唯一碳源生長(zhǎng)16周后通過FTIR分析顯示，由于碳?xì)浠衔锝到?，出現(xiàn)了新的官能團(tuán)。還通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度以尋找降解實(shí)驗(yàn)的最佳條件。2020年，Maroof等［16］從巴基斯坦的一處垃圾處理廠篩選出6株具有潛在生物降解活性的菌株，用無添加劑PE-LD薄膜作為唯一碳源培養(yǎng)90 d后，利用SEM觀察到PE-LD薄膜有輕微的表面破裂，傅里葉變換紅外光譜顯示形成典型的羰基峰，通過羰基指數(shù)測(cè)定，孵育后羰基峰明顯減少。X射線衍射分析顯示結(jié)晶度百分比增加，還在細(xì)菌分離物中鑒定出不同的負(fù)責(zé)降解PE-LD的基因。

表1 參與PE塑料生物降解的細(xì)菌菌株Tab.1 Bacterial strains involved in biodegradation of polyethylene plastics

1.2 參與PE塑料微生物降解的真菌菌株

除了細(xì)菌，一些真菌屬，包括曲霉屬、枝孢霉屬、鐮孢屬、青霉屬、黃孢原毛平革菌屬也被報(bào)道可降解PE［24-25］。一般來說，真菌被認(rèn)為比細(xì)菌更能有效地降解PE，因?yàn)檎婢谏镌恍迯?fù)過程中會(huì)產(chǎn)生疏水蛋白，其雙層結(jié)構(gòu)能在疏水/親水界面形成兩親性膜（Amphipathicfilm），作為生物表面活性劑提高了底物的接觸面積，從而大大提高降解效率［26］。表2總結(jié)了近年來能夠降解PE的真菌菌株。2014年，Merina等［27］從城市垃圾處理廠的土壤中以PE-LD粉末為唯一碳源篩選出5種真菌，其中4種被鑒定為曲霉菌屬，剩下的為鐮孢菌屬；在33.3℃下培養(yǎng)60 d后進(jìn)行測(cè)試樣品的失重情況，其中FSM-10和FSM-3表現(xiàn)出最大的降解效率，分別為9%和8%；FSM-6和FSM-8次之為7%；FSM-5的最小為5%。2016年，Gajendiran等［28］從填埋場(chǎng)的土壤中篩選出一株具有降解PE潛力的真菌，基于18S rRNA分析分離的菌株被鑒定為棒狀曲霉并命名為Aspergillus clavatus JASK1。在培養(yǎng)90 d后觀察到PE-LD膜的失重率為35%。2018年，Ndahebwa等［15］從丹多拉垃圾場(chǎng)篩選出一些PE降解真菌，在以PE-LD為唯一碳源生長(zhǎng)16周后通過FTIR分析顯示，由于碳?xì)浠衔锝到猓霈F(xiàn)了新的官能團(tuán)?？傮w分析證實(shí)，真菌比細(xì)菌能更好地降解PE，真菌使PE-LD平均質(zhì)量損失了（36.4±5.53）%。實(shí)驗(yàn)還通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度以尋找降解實(shí)驗(yàn)的最佳條件。2020年，Zhang等［29］從蠟螟Galleria mellonella的腸道中分離到一株具有降解PE潛力的真菌，經(jīng)基因鑒定為黃曲霉并命名為黃曲霉PEDX3。在以PE-HD為唯一碳源培養(yǎng)28 d后的結(jié)果表明，PE-HD的分子量降低；FTIR分析證實(shí)了羰基和醚基的出現(xiàn)；最后通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)潛在降解酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：2個(gè)漆酶樣多銅氧化酶（LMCOs）基因AFLA-006190和AFLA-053930在降解過程中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能作為關(guān)鍵酶參與到PE的降解過程中。

表2 參與PE塑料生物降解的真菌菌株Tab.2 Fungal strains involved in the biodegradation of polyethylene plastics

1.3 參與PE塑料微生物降解的放線菌菌株

據(jù)報(bào)道，現(xiàn)在篩選出的能夠降解PE的放線菌包括鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬和紅球菌屬3個(gè)菌屬［33-34］。Esperanza等［34］從蚯蚓腸道中分離出能夠降解PE的放線菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從蚯蚓腸道分離的放線菌群能夠在4周內(nèi)顯著減小低密度聚乙烯微塑料（PE-LD-MP）的大小，而且在放線菌以PE-LD-MP為唯一碳源的土壤中檢測(cè)出一些長(zhǎng)鏈烷烴聚合物，其中包括十八烷、二十烷等，因?yàn)樗鼈冊(cè)诤蠵E-LD-MP的無菌土壤中未被檢測(cè)到，所以烷烴的形成可視為PE-LD-MP長(zhǎng)碳鏈斷裂的產(chǎn)物。土壤中的放線菌資源豐富且放線菌與人類的關(guān)系極其密切，絕大數(shù)屬有益菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物作為藥物來源對(duì)人類的健康做出巨大貢獻(xiàn)。然而目前關(guān)于放線菌降解PE的文獻(xiàn)報(bào)道較少，筆者認(rèn)為放線菌的篩選應(yīng)該引起研究人員的關(guān)注，特別是關(guān)于放線菌降解PE過程中次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，推動(dòng)廢舊PE資源化利用的發(fā)展。

綜上所述，目前的生物降解研究中大部分以純菌種為研究對(duì)象，但是微生物作為一個(gè)完整的生態(tài)系統(tǒng)是不會(huì)單獨(dú)作用于PE材料的。微生物之間是存在著各種關(guān)系的，包括互生、共生、寄生等，在土壤微生物中，互生關(guān)系就十分普遍［35］。雖然在Han等［36］的研究中發(fā)現(xiàn)，與單一菌種相比使用Arthrobacter sp.和Streptomyces sp.的混合菌群共同形成了更厚更復(fù)雜的生物膜，這也促進(jìn)了更高的PE礦化率，但是對(duì)混合菌群提高降解率的協(xié)同機(jī)制沒有進(jìn)行深入研究。筆者認(rèn)為多菌種聯(lián)合降解中協(xié)同機(jī)制的研究有助于人們了解自然環(huán)境下各個(gè)菌種在PE生物降解過程中扮演的角色，以此建立“人工生態(tài)系統(tǒng)”對(duì)廢舊PE進(jìn)行高效降解，為以后廢舊塑料生物降解的工廠化提供理論依據(jù)。而且在以后的研究中進(jìn)行多菌種聯(lián)合降解及其協(xié)同機(jī)制的探究可以作為提高PE生物降解率的突破口之一。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PE生物降解的研究重心從宏觀上物理化學(xué)的變化逐漸偏移到微觀上降解酶和降解機(jī)理的研究，尤其是高通量測(cè)序和代謝組學(xué)分析的利用在生物降解機(jī)理的研究中發(fā)揮了重要作用，在這段發(fā)展過程中研究者也發(fā)現(xiàn)PE生物降解的本質(zhì)是酶的降解，所以尋找PE生物降解過程中的關(guān)鍵酶及其基因調(diào)控機(jī)制的研究在未來的生物降解研究中是極為重要的。

2 PE降解的表征方法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前研究者們通過對(duì)降解前后聚合物物理和化學(xué)性質(zhì)的變化來評(píng)價(jià)各降解菌的降解效率，這些物理和化學(xué)性質(zhì)的變化主要體現(xiàn)在7個(gè)方面：表面官能團(tuán)、親水性/疏水性、結(jié)晶度、分子量、表面形貌、力學(xué)性能和質(zhì)量損失［8］。以下將對(duì)目前使用各種表征儀器所出現(xiàn)的問題進(jìn)行分析。

2.1 FTIR

FTIR用于研究微生物降解導(dǎo)致的非生物和生物氧化后PE表面各種官能團(tuán)的形成。PE表面的這些官能團(tuán)被認(rèn)為是重要的，因?yàn)檠趸鶊F(tuán)導(dǎo)致親水性增加，進(jìn)而導(dǎo)致微生物有效附著在PE表面，從而促進(jìn)生物降解［29］。

2.2 測(cè)量表面與水的接觸角

細(xì)菌產(chǎn)生的生物表面活性劑是生物降解實(shí)驗(yàn)和PE降解的關(guān)鍵因素。生物表面活性劑分子的分泌降低了表面張力，使微生物易于附著在PE表面［9］，這是微生物降解PE的前提條件。PE表面張力的變化通常通過測(cè)量表面與水的接觸角來估算，與水的小接觸角表明降解后PE表面的高親水性。

2.3 SEM

SEM可以很直觀地向研究者展示降解菌對(duì)PE膜/顆粒表面的侵蝕情或者降解菌是否定殖在PE表面，但是要保證樣品在處理中保持無損狀態(tài)，處理后要保持清潔狀態(tài)，避免外界因素對(duì)樣品造成損傷影響實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性。

2.4 質(zhì)量損失

檢測(cè)生物降解能力最簡(jiǎn)單的方法就是使用足夠靈敏的天平測(cè)量質(zhì)量損失。但是處理樣品的過程中會(huì)導(dǎo)致PE材料質(zhì)量的損失，尤其是PE顆粒在回收的過程中極其容易丟失，所以會(huì)造成較大的偏差。近年來，大部分研究者還以CO2生成量來計(jì)算生物降解所產(chǎn)生的失重，這也可以作為以后PE生物降解中不可或缺的表征手段之一。

還有一些研究者利用同位素示蹤法來跟蹤生物降解從開始到最終產(chǎn)物的生成即：CO2和微生物中的碳，以此更好地研究降解菌的降解機(jī)理和計(jì)算降解速率。還有通過測(cè)定降解過程中降解菌的濃度從而制作降解菌生長(zhǎng)曲線，用來表示降解菌以PE材料為唯一碳源的生長(zhǎng)情況，也可作為是否降解PE的依據(jù)。利用氣相和液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)PE生物降解后的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析也可以作為一種表征手段。作者認(rèn)為上述的表征技術(shù)對(duì)于PE的生物降解都是相互佐證的，研究中不能單獨(dú)以某一技術(shù)作為生物降解的證據(jù)，如CO2生成量的測(cè)定，在PE的生物降解過程中，首先降解菌分泌胞外酶將長(zhǎng)鏈PE切割成各種不同的中間產(chǎn)物，而降解菌只能吸收一些能穿過細(xì)胞壁的小分子中間產(chǎn)物，所以單獨(dú)測(cè)定CO2的生成量是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹?/p>

3 PE微生物降解實(shí)驗(yàn)流程的改進(jìn)與補(bǔ)充

對(duì)PE微生物降解實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行如圖1所示改進(jìn)與補(bǔ)充。

圖1 PE微生物降解實(shí)驗(yàn)流程的改進(jìn)與補(bǔ)充Fig.1 Improvement and supplement of polyethylene microbial degradation experimental process

（1）PE膜處理：現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)的PE塑料大部分有各種添加劑以便于達(dá)到各種用途，包括抗菌劑、抗氧化劑、增塑劑等［37］。這些添加劑都會(huì)干擾研究者對(duì)降解菌降解效果的判斷，這就是造成降解效率無法進(jìn)行比較的首要問題。為避免這些問題出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中使用的PE膜應(yīng)購買純PE膜或利用濕膜涂布器在實(shí)驗(yàn)室制得的純PE膜。

（2）測(cè)定PE膜平均分子量、分子量分布和質(zhì)量：利用凝膠滲透色譜測(cè)定PE膜在被微生物降解前后的分子量分布和平均分子量的變化，可以判斷PE被微生物降解后，是否發(fā)生了長(zhǎng)鏈的解聚［7］。這應(yīng)該作為不可或缺的佐證來證明PE塑料降解之后的質(zhì)量損失或者產(chǎn)生的CO2是否是來自PE塑料高分子長(zhǎng)鏈的解聚和降解［38］。這些工作必須在降解前后立即進(jìn)行。

（3）培養(yǎng)基選擇：作為降解測(cè)試的培養(yǎng)基應(yīng)提供菌種所需除碳源外的所有營養(yǎng)物質(zhì)，以確保PE膜提供唯一碳源，所以選擇無機(jī)鹽培養(yǎng)基便于以后的表征測(cè)試。

（4）降解后的表征測(cè)定：這些測(cè)定可以參照第二章內(nèi)容進(jìn)行；此外還應(yīng)采用X射線光電子能譜（XPS）檢測(cè)降解前后是否被引入了氧元素，氧元素的進(jìn)入是降解開始的重要標(biāo)志；由于在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中測(cè)試菌種都是附著于PE膜片上的，所以采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌種濃度以繪制降解菌的生長(zhǎng)曲線是不準(zhǔn)確的，可以在試驗(yàn)一段時(shí)間后采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察沒經(jīng)過清洗的PE膜表面菌種定殖和生長(zhǎng)情況。

4 結(jié)語

從微生物角度出發(fā)，目前研究者已經(jīng)從各種生態(tài)環(huán)境中篩選出大量的降解菌，但是大多數(shù)研究中菌株被單獨(dú)作用于PE材料，研究者們忽略了整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中的每個(gè)個(gè)體是相互關(guān)聯(lián)的，微生物間的生態(tài)相互作用在PE降解過程中也是非常重要的。在自然環(huán)境中，對(duì)于PE的生物降解菌群之間必然存在協(xié)同過程，未來研究中應(yīng)該多留意降解菌之間的互生和共生關(guān)系，采用多菌種聯(lián)合降解的方式，以提高目前整體的降解水平。

從降解實(shí)驗(yàn)過程出發(fā)，大量的降解菌被發(fā)現(xiàn)，但是由于研究者們對(duì)影響降解菌生物降解因素的忽略，如，在文獻(xiàn)報(bào)道中各種用于測(cè)試降解菌生物降解能力的PE材料被研究者使用，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致篩選出只是利用PE材料中添加劑的假陽性降解表型的菌株。所以建議在做降解菌能力測(cè)試的時(shí)候采用一種簡(jiǎn)單可靠的實(shí)驗(yàn)流程，以便于各研究者對(duì)篩選出的降解菌在降解能力上進(jìn)行比較。未來的研究中也可以真正了解到目前發(fā)現(xiàn)或者改性的降解菌整體的降解水平，為降解菌的高效性定義上提供了數(shù)據(jù)支持，對(duì)進(jìn)一步推動(dòng)降解能力水平的提高來說意義重大。

還有一點(diǎn)容易忽視的是，PE降解菌在降解之后的代謝產(chǎn)物是否對(duì)環(huán)境具有危害性，研究者從毒理學(xué)的角度分析生物降解后的代謝產(chǎn)物是極其重要的，目前的研究中這一問題還未得到研究者的重視，在以后的研究中還應(yīng)將篩選出來的PE降解菌返還到土壤、水池等自然環(huán)境中，測(cè)試各種指標(biāo)以檢測(cè)其對(duì)農(nóng)作物、魚類等有無危害。

在未來的研究中，還可以通過對(duì)已知降解菌的改性或者對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化兩個(gè)方面來提高降解水平。一是改性，可以從分子水平研究降解機(jī)理，確定關(guān)鍵功能基因或者蛋白質(zhì)，再利用基因工程的相關(guān)技術(shù)構(gòu)建高效的降解微生物；二是通過將實(shí)驗(yàn)條件（pH、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、多菌種聯(lián)合等）作為變量做正交實(shí)驗(yàn)，探究微生物生物降解的最佳條件，以達(dá)到提高生物降解水平的目的。