謝蕾，肖良俊，吳濤，李賢忠，蘇包順，劉志彤

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；3.大理市林韻生物科技開發(fā)有限責(zé)任 公司，云南 大理 671000；4.巍山彝族回族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局園藝工作站，云南 大理 671000）

滇黃精Polygonatum kingianum又名云南黃精，在2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中與黃精P.sibiricum、多花黃精P.cyrtonema一起作為中藥黃精的基源品種[1]。黃精具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力、改善記憶、防止老年癡呆等功能[2]。黃精屬Polygonatum植物全球約有60 種，分類十分困難，其中有的種分布范圍很廣、形態(tài)變異很大，先是歸于百合科Liliaceae[3]或更窄的鈴蘭科Convallariaceae[4]或是假葉樹科Ruscaceae[5]，最近又根據(jù)核基因和葉綠體DNA 片段的系統(tǒng)分類證據(jù)歸并到天門冬科Asparagaceae[6-8]?！吨袊?guó)植物志》中記載的黃精屬植物廣泛分布于北溫帶，我國(guó)有31 種，目前尚未進(jìn)行全面研究，僅依據(jù)其表型差異和分布特征劃分為不同的“種”[3]。滇黃精部分分布在越南和緬甸，主產(chǎn)于中國(guó)的云南、四川、貴州、廣西等省（自治區(qū)）[9]。云南滇中、滇西北等地滇黃精產(chǎn)量較大，是滇黃精的重要分布區(qū)。

《云南植物志》中記載的滇黃精花被顏色類型有紫紅色、綠色、黃綠色和白色，并且以紫紅色和白色最為常見[10]。作者在大理州大理市挖色鎮(zhèn)進(jìn)行滇黃精資源收集和擴(kuò)繁過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，花被白色類型的滇黃精資源種植區(qū)內(nèi)出現(xiàn)白花帶紫斑類型的滇黃精，并對(duì)其進(jìn)行收集擴(kuò)繁。滇黃精花被顏色類型繁多且鑒定困難，新發(fā)現(xiàn)的白花帶紫斑類型具有花被白色和紫紅色的特征，查閱文獻(xiàn)和實(shí)地走訪并未找到相關(guān)記載，紫紅花、白花和白花帶紫斑3 種類型滇黃精的遺傳關(guān)系尚不清楚。

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)在黃精屬植物的種源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系等方面的研究中得到了廣泛應(yīng)用[11-14]。周曄等[15]運(yùn)用ISSR 分子標(biāo)記方法對(duì)黃精屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出可以有效辨別野生黃精、人工栽培黃精以及市面上黃精偽品的引物，還利用RAPD 手段對(duì)中藥黃精及主要摻偽品長(zhǎng)梗黃精P.filipes進(jìn)行鑒別，確保中藥使用的安全有效[16]。張家曾[17]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的黃精與多花黃精進(jìn)行遺傳學(xué)的系統(tǒng)研究，獲得了用于鑒定不同品種黃精及其遺傳多樣性的psbA-trnH序列。此外，陳友吾等[18]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒別和分析多花黃精EST-SSR 位點(diǎn)，為多花黃精遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供了大量有價(jià)值的候選標(biāo)記。這些工作為滇黃精資源鑒定和遺傳多樣性研究提供了很好的補(bǔ)充手段，本研究基于ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，以差異較大的花色為研究目標(biāo)分析了滇黃精的遺傳關(guān)系，以期為滇黃精資源的遺傳多樣性研究和分類鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣地點(diǎn)位于云南省大理州大理市挖色鎮(zhèn)，地處大理市中東部，地理坐標(biāo)為100°27′80″ E，25°95′05″ N，海拔為2 400 m，年平均氣溫為15℃，年降水量為1 100 mm。土壤紅色，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候溫和，常年無(wú)酷熱嚴(yán)寒，少風(fēng)霜，四季如春。

1.2 試驗(yàn)材料

2019 年7 月，試驗(yàn)所需材料采自云南省大理市挖色鎮(zhèn)滇黃精種植基地本。白花滇黃精（P1）為認(rèn)定良種‘林韻1 號(hào)’，白花帶紫斑滇黃精（P2）為新發(fā)現(xiàn)擴(kuò)繁植株，紫紅花滇黃精（P3）為認(rèn)定良種‘普洱1 號(hào)’，見圖1。將3 種不同花色類型滇黃精資源（P1、P2、P3）各采集16 個(gè)單株（編號(hào)分別為A1-A16、B1-B16、C1-C16）。取各植株的健康成熟葉片放入濾紙取樣袋中，置于裝有硅膠的收納盒中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 三種花色滇黃精照片F(xiàn)igure 1 P.kingianum with different flower color

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取 采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒DNAsecure Plant Kit（天根生化科技有限公司）提取滇黃精葉片的DNA。用產(chǎn)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 的ND 2000 檢測(cè)DNA 的含量和純度，用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 質(zhì)量。將DNA 濃度調(diào)整至20～ 40 ng·μL-1，―20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 擴(kuò)增及引物篩選 從96 條ISSR 引物中篩選出條帶清晰、重復(fù)性高的11 條引物（表1）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括MIX 10 μL、Primer 4 μL、Template 0.5 μL、H2O 5.5 μL。ISSR-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物取8 μL，用DL 2000 作為Markers，用2%瓊脂糖凝膠在150 V 下電泳22 min，EB 染色后用凝膠成像分析儀拍照保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用人工計(jì)帶法判讀電泳圖譜中的擴(kuò)增產(chǎn)物，相同遷移位置上條帶有或無(wú)分別計(jì)為“1”和“0”，構(gòu)成“0，1”矩陣。用POP-GENE 32 軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分比（P）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多樣性指數(shù)Shannon-Wiener 指數(shù)（H′）、基因多樣性指數(shù)Nei’s 指數(shù)（H）、遺傳相似系數(shù)（I）、Nei’s 遺傳距離（D）等遺傳參數(shù)；利用NTSYS-pc 2.10e 軟件的SAHN 程序進(jìn)行UPGMA 聚類分析，通過(guò)Tree plot 模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR 擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析

用11 條引物對(duì)3 種不同花色類型的48 份滇黃精樣品進(jìn)行ISSR 標(biāo)記，總共擴(kuò)增出103條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶有99 條（表1）。平均每個(gè)引物擴(kuò)增出9 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中8 條ISSR 引物包括引物840、887、889、826、880、886、890 和810 的多態(tài)性比率達(dá)100%，平均多態(tài)百分?jǐn)?shù)為96.1%。其中，用引物826 擴(kuò)增得到的總條帶數(shù)量和多態(tài)性條帶數(shù)量都是最多的，均為16 條。用引物887 和889 擴(kuò)增得到的總條帶數(shù)量最少，均為5 條。引物868 對(duì)48株滇黃精單株的ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

表1 48 株滇黃精單株的ISSR 擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Results of 48 P.kingianum individuals amplified with ISSR primers

圖2 引物868 對(duì)48 株滇黃精單株的ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Amplification results of 48 P.kingianum individuals with the ISSR primer 868

2.2 遺傳關(guān)系

由表2 可知，基于ISSR 標(biāo)記，3 種不同花色類型滇黃精多態(tài)位點(diǎn)百分率的變異范圍為54.4%～ 65.1%，平均為60.8%，其中，紫紅花滇黃精（P3）的多態(tài)位點(diǎn)百分率最小，白花滇黃精（P1）的最大。觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)的范圍分別為1.54～ 1.65 個(gè)、1.26～ 1.30 個(gè)和0.25～ 0.29，3 個(gè)不同花色類型滇黃精的平均Nei’s 指數(shù)為0.17，其中，白花滇黃精（P1）的Nei’s 指數(shù)相對(duì)較高，這表明白花滇黃精存在豐富的遺傳多樣性，變異水平較大，白花帶紫斑滇黃精（P2）的多態(tài)位點(diǎn)百分率介于白花滇黃精（P1）與紫紅花滇黃精（P3）之間。

表2 3 種不同花色類型滇黃精的遺傳關(guān)系Table 2 Genetic relationship of P.kingianum with three flower color

2.3 遺傳距離及聚類分析

由表3 可知，3 種不同花色類型滇黃精的遺傳一致度為0.89～ 0.91，均值為0.90；遺傳距離為0.10～ 0.12，平均遺傳距離為0.11，說(shuō)明3 種花色類型滇黃精之間的遺傳差異不大，其中白花帶紫斑滇黃精（P2）和紫紅花滇黃精（P3）之間具有相對(duì)較小的遺傳距離（0.10）和最大的遺傳一致度（0.91）。利用UPGAM 聚類法對(duì)48 份滇黃精樣品進(jìn)行分析，基于遺傳一致度構(gòu)建遺傳聚類圖。當(dāng)遺傳一致度為0.69 時(shí)，聚為三組——白花滇黃精（P1，A1-A16）、白花帶紫斑滇黃精（P2，B1-B16）和紫紅花滇黃精（P3，C1-C16）（圖3）。

表3 3 種不同花色類型滇黃精的遺傳一致度和遺傳距離Table 4 Genetic identity and genetic distance of P.kingianum with different flower color

圖3 基于遺傳一致度的UPMGA 聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram based on genetic identity

3 討論

本試驗(yàn)采樣的3 種不同花色類型滇黃精均來(lái)自同一塊基地，它們的空間距離較近，自然條件下通過(guò)蟲媒等影響各花色類型之間的花粉傳播，加強(qiáng)了基因交流。故推測(cè)白花帶紫斑滇黃精可能是紫紅花滇黃精和白花滇黃精的過(guò)渡類型，或者是白花滇黃精和紫紅花滇黃精自然授粉后，所產(chǎn)生的子代的一種雜合狀態(tài)。由于滇黃精栽培歷史較短、地域性差異較大，對(duì)其植物學(xué)特征和生物學(xué)特性的研究尚不充分的原因，導(dǎo)致了對(duì)同一個(gè)物種的形態(tài)學(xué)、物候期等基本生物學(xué)特性描述不一致的現(xiàn)象[19]。紫紅花滇黃精（P3）為野外常見類型，分布范圍廣，也是目前人工馴化栽培面積最大的類型，其塊莖芽頭少，但芽頭大，須根多，產(chǎn)量低；白花滇黃精（P1）主要分布在云南大理、祿豐一帶，植株較紫紅花滇黃精矮小、抗性強(qiáng)、芽頭多、須根少、產(chǎn)量高；白花帶紫斑滇黃精（P2）為在大理州大理市挖色鎮(zhèn)進(jìn)行滇黃精資源收集和擴(kuò)繁過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的類型，植株表現(xiàn)在株型、塊莖等方面與白花滇黃精（P1）基本一致，目前，關(guān)于白花帶紫斑滇黃精的資料記載和報(bào)道較少。黃精屬種間甚至種內(nèi)的形態(tài)特征有明顯的交錯(cuò)過(guò)渡，其中不少種類在地理分布上存在重合，變異復(fù)雜，常伴有種間雜交現(xiàn)象，種與種之間的界限相當(dāng)模糊，致使該屬的系統(tǒng)分類與種的鑒定不甚明確[20]。近年來(lái)，有通過(guò)生藥學(xué)鑒別[21-22]、花粉鑒別[23-24]、葉表皮及種皮鑒別[25-26]并通過(guò)細(xì)胞學(xué)[27-28]對(duì)黃精屬進(jìn)行分類鑒別研究的報(bào)道，但這些傳統(tǒng)植物形態(tài)學(xué)分類方法并不能保證黃精屬鑒別分類的可靠性。

隨著分子生物學(xué)科研究的完善與深入，先后出現(xiàn)了多種基于DNA 水平的分子鑒定技術(shù)，這些技術(shù)加速了黃精屬相關(guān)領(lǐng)域的研究并取得了較為豐碩的成果。目前，ISSR 技術(shù)被廣泛應(yīng)用于黃精屬種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析、指紋圖譜構(gòu)建[29]。多花黃精和長(zhǎng)梗黃精P.filipes為福建省市場(chǎng)上常見的易混黃精屬植物，徐惠龍等[30]利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)這兩種植物進(jìn)行了種質(zhì)資源鑒別，發(fā)現(xiàn)這兩種植物種質(zhì)間分化差異較大，多花黃精種質(zhì)與長(zhǎng)梗黃精種質(zhì)均能單獨(dú)聚為一類；楊青等[31]通過(guò)ISSR 分子標(biāo)記方法對(duì)武夷山及周邊地區(qū)的五份黃精屬植物進(jìn)行了有效區(qū)分；卜靜等[32]通過(guò)對(duì)野生居群玉竹P.odoratum與栽培居群玉竹的ISSR 分析比較發(fā)現(xiàn)，野生居群玉竹的遺傳多樣性高于栽培玉竹的，地理來(lái)源相同的野生居群與栽培居群親緣關(guān)系更加接近。以上研究表明ISSR 技術(shù)可為黃精屬種質(zhì)鑒別提供新的方法與參考依據(jù)。本研究利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)3 種花色類型滇黃精進(jìn)行了遺傳關(guān)系研究。但采用ISSR 標(biāo)記方法獲得的遺傳多樣性信息較為簡(jiǎn)單，下一步將在分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上結(jié)合滇黃精的表型特征、藥用功效及品質(zhì)評(píng)價(jià)對(duì)其進(jìn)行深入研究，從而獲得的更為豐富的遺傳多樣性信息，為滇黃精的資源分類及良種選育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在滇黃精DNA 數(shù)據(jù)較為匱乏的限制條件下，利用ISSR 分子標(biāo)記方法對(duì)3 種不同花色類型滇黃精的48 份樣品進(jìn)行了遺傳關(guān)系研究。白花滇黃精（P1）的多樣性指數(shù)為0.19，相對(duì)白花帶紫斑滇黃精（P2）和紫紅花滇黃精（P3）這兩種類型較高。從多態(tài)性和遺傳聚類結(jié)果看，白花滇黃精（P1）、白花帶紫斑滇黃精（P2）與紫紅花滇黃精（P3）均可以很好地各自獨(dú)立聚為一組，其中白花帶紫斑滇黃精與紫紅花滇黃精的親緣關(guān)系相對(duì)更近。新發(fā)現(xiàn)的滇黃精類型增加了分類鑒別的難度，但其豐富的變異為選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的滇黃精新品種提供豐富的育種材料。