丁敏，王麗玲，秦玉川，劉本同，黃旭波，童曉青，方茹，王衍彬

（1.麗水市森林資源保護管理總站，浙江 麗水，323000；2.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

金銀花是忍冬科Caprifoliaceae 植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或初開的花，一般夏初花開放前采收，干燥后使用[1]。金銀花是常用的傳統(tǒng)藥食同源中藥，具有清熱解毒，疏散風熱的功效，并表現出抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化等多種藥理作用[2-3]。研究表明，金銀花的主要有效成分為有機酸、黃酮類等多類活性成分[4-6]，其中，綠原酸（Chlorogenic acid）是含量最高的有機酸成分。

綠原酸，即3-咖啡?？鼘幩?，是由奎寧酸與咖啡酸形成的帶有酯鍵的羥酚酸，是植物體內有氧呼吸經HMS途徑產生的一種苯丙素類次生代謝產物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂、保肝利膽、增加白血球、清除自由基和興奮中樞神經系統(tǒng)等藥理活性[7-9]，因而成為生物活性物質研究領域的熱點之一。目前，綠原酸是一種具有極高藥用價值和經濟價值的純天然提取物，被廣泛應用到人用藥品、保健品、化妝品、飲料、飼料、獸用藥等領域[10]。因而，綜合利用金銀花植物資源，實現精深加工和高值化利用，符合國家農業(yè)產業(yè)結構調整以及助力鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略。

目前，關于金銀花綠原酸不同提取工藝已有許多報道，包括以傳統(tǒng)有機溶劑為提取介質，如乙醇提取[11-12]、甲醇提取[13]；以生物酶加水為溶劑提取，如纖維素酶解法提取[14]；以及以新型溶劑為介質提取，如離子液體提取[15-16]、低共熔溶劑提取[17]等，盡管這些工藝技術各具特點，但是它們對生產條件和設備均具有一定的要求，不適用于在傳統(tǒng)金銀花種植產地進行規(guī)?；a。其次，雖然目前的文獻中對于金銀花中綠原酸提取的研究較多，如曹曉琴[18]等以水煎煮法、乙醇索氏提取法、醇提法、酸醇提取法、乙醇超聲提取法進行不同溶劑和方法的提取比較研究；李楊等[19]以水為溶劑采取傳統(tǒng)浸提法、滲漉提取法、索氏提取法、微波提取法、超聲波提取法對金銀花涼茶中的綠原酸進行提取，但對于回流法、超聲法、煎煮法與藥典方法的研究較少，且對金銀花中綠原酸僅僅以水為溶質的提取研究更少。此外，水是各種化學和生物過程的理想溶劑，它對環(huán)境的影響最小，安全問題也少。在天然活性物質的提取過程中，綠色溶劑水一直都是首要考慮的提取劑。本研究選擇水為溶劑，探索了不同水提取方法與主要因素對金銀花綠原酸提取率的影響，以期對金銀花中綠原酸的綠色、簡便與高效提取制備提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花藥材，購買于杭州某藥店。烘干藥材至含水量低于6%，磨成粉，過100 目篩置于干燥器中備用。綠原酸標準品購自中國食品藥品檢定研究院，色譜級乙腈購自霍尼韋爾貿易（上海）有限公司，甲酸、甲醇、磷酸等試劑為分析純，均購自上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

日本島津LC-20AD 高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括島津SIL-20A 自動進樣器、島津LC-20AD 泵、島津SPD-20A紫外-可見光檢測器、島津CTO-20A 柱溫箱；DLSB-5/10℃低溫冷卻循環(huán)泵，杭州惠創(chuàng)儀器設備有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；G2X-9076MBE 電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；電子天平，丹佛儀器有限公司；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZF-7 型暗箱三用紫外分析儀，上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸的HPLC 測定與標準曲線的制作 采用Thermo C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），以乙腈－0.1%甲酸（13∶87）溶液為流動相，流速為1 mL·min-1，檢測波長為327 nm，柱溫為30℃。以峰面積y及不同綠原酸標準品濃度x（μg·mL-1）繪制標準曲線，得到綠原酸回歸方程為：y=27 927x－1 716.1（R2=1），線性范圍為20～ 100 μg·mL-1。按照本液相方法測定得到樣品中綠原酸的峰面積，由標準曲線方程計算得到綠原酸濃度。用回流法提取金銀花樣品，分別在0、2、4、8、12、24 h 時進樣，按照上述色譜方法測定峰面積，結果顯示峰面積相對標準偏差（Relative standard deviation,RSD）為1.26 %，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

1.3.2 不同提取方法比較實驗 藥典法提取：取金銀花粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（40 KHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足損失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。應用1.3.1 方法得到綠原酸濃度，進一步計算得到該批次金銀花中綠原酸含量為3.97%±0.05%，本研究中以下提取方法實驗結果均以該綠原酸得率為100%計算相對提取率（R）。

式中，A1為實驗所得綠原酸提取率；A0為藥典法測得金銀花綠原酸含量。

煎煮法提?。喝〗疸y花粉末10 g，精密稱定，置不銹鋼小鍋中，加1 000 mL 蒸餾水煎煮2 次，每次1 h，合并提取液，過濾。將提取液減壓濃縮后定容至100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。經HPLC檢測后計算綠原酸相對提取率。

回流法提取：取金銀花粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加20 mL 水回流提取2 次，每次1 h。合并提取液過濾并定容到100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。經HPLC 檢測后計算綠原酸相對提取率。

超聲法提?。旱浇疸y花粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加20 mL 蒸餾水30℃超聲（40 KHz）提取2 次，每次1 h。合并提取液過濾并定容至100 mL，再取1 mL 提取液加50%甲醇定容至50 mL。經HPLC 檢測后計算綠原酸相對提取率。

1.3.3 水回流提取工藝單因素實驗

1.3.3.1 不同提取溫度 金銀花粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入30 mL 水，溫度分別設定為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，各回流提取1 h。每處理提取2 次，合并提取液濾過定容至100 mL。精密量取1 mL續(xù)濾液，加50 %甲醇定容至50 mL。

1.3.3.2 不同料液比 取金銀花粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，溫度設定為70℃，分別精密加入10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、60 mL 蒸餾水，各回流提取1 h。每處理提取2 次，合并提取液過濾定容至100 mL。精密量取1 mL 續(xù)濾液，加50%甲醇定容至50 mL。

1.3.3.3 不同回流時間 取金銀花粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，溫度設定為70℃，精密加入30 mL 蒸餾水，分別回流提取30 min、50 min、60 min、90 min、120 min。每處理提取2 次，合并提取液濾過定容至100 mL。精密量取1 mL 續(xù)濾液，加50%甲醇定容至50 mL。

1.3.3.4 不同回流次數 取金銀花粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，溫度設定為70℃，精密加入30 mL 蒸餾水，回流提取30 min，分別回流提取1、2、3、4 次。過濾，分別精密量取0.40 mL、5.00 mL、5.00 mL、5.00 mL、5.00 mL 續(xù)濾液，定容至10 mL。

1.3.4 水回流提取工藝正交試驗 根據單因素試驗的結果，以提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）設計三因素三水平L9（34）正交試驗，確定最佳提取工藝，試驗設計見表1 和表2。取樣品9 份，每份精密稱取金銀花粉末1 g，置圓底燒瓶中，按表2的實驗條件進行實驗。每處理提取2 次，合并提取液過濾定容至100 mL。精密量取1 mL 續(xù)濾液，加50 %甲醇定容至50 mL。

表1 水回流提取綠原酸因素與水平Table 1 Factors and levels for reflux water extraction of chlorogenic acid

表2 L9（34）正交試驗設計Table 2 Orthogonal test

1.4 數據分析處理

采用Excel 2013 對實驗結果進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 軟件13.0 對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 以水為溶劑的不同提取方法對綠原酸得率的影響

由圖1 可知，以藥典法中提取條件得到金銀花的綠原酸提取得率為100%，分別計算3 種水提取方法對金銀花中綠原酸的相對提取率大小依次為：回流法＞超聲法＞煎煮法，其中，回流法的綠原酸相對提取率為84.89%±3.37%，顯著高于其他兩種提取方法（P＜0.05）。因而在以下的實驗中，我們選取回流法提取進一步展開金銀花水提取工藝研究。

圖1 不同提取方法對綠原酸相對提取率的影響Figure 1 Effect of different extraction methods on yield of chlorogenic acid

2.2 水提回流法提取工藝中不同因素對綠原酸得率的影響

2.2.1 回流溫度對綠原酸得率的影響 由圖2 結果表明，在其他條件相同的情況下，溫度會影響金銀花水提取綠原酸的效果，整體上，隨著溫度的上升，綠原酸的相對提取率呈先升后降的趨勢。從60℃開始，隨著溫度的上升，綠原酸的相對提取率逐漸增大，到70℃時，綠原酸的相對提取率達到峰值，為80.86%±3.02%之后，隨著溫度的進一步升高，綠原酸的相對提取率反而下降，可能是因為溫度過高導致綠原酸分解，致使綠原酸的相對提取率降低。因此，選擇70℃左右作為回流法提取金銀花中綠原酸的最佳溫度。

圖2 不同回流溫度對綠原酸提取率的影響Figure 2 Effect of reflux temperature on yield of chlorogenic acid

2.2.2 液料比對綠原酸得率的影響 從圖3 可以看出，整體上，隨著液料比的增加，綠原酸的相對提取率呈先升后降，達到一定液料比后趨于平緩的趨勢。從10 mL·g-1開始，隨著液料比的增大，金銀花綠原酸的相對提取率逐漸增大，到液料比為30 mL·g-1時，綠原酸的相對提取率達到峰值，為81.61%±3.24%，之后，隨著液料比的進一步增大，綠原酸的相對提取率反而下降，至40 mL·g-1時，綠原酸的相對提取率逐漸趨于平緩，這可能是因為隨著液料比的增大，綠原酸的溶出越來越多直至達到提取極限；繼續(xù)增加液料比反而稀釋綠原酸濃度，增加雜質溶出率，從而引起綠原酸得率下降。所以，30 mL·g-1左右為最佳提取料液比。

圖3 不同液料比對綠原酸的提取率的影響Figure 3 Effect of liquid-solid ratio on yield of chlorogenic acid

2.2.3 回流時間對綠原酸得率的影響 由圖4 表明，隨著回流時間的增加，綠原酸的相對提取率先上升后下降。當回流時間為30～ 60 min 時，隨著回流時間的增加，綠原酸的相對提取率逐漸增加，至60 min 時，綠原酸的相 對提取率達到峰值，為81.11%±3.22%，之后隨著回流時間的增加，綠原酸的相對提取率反而下降。這可能是由于隨著回流時間的延長，會引起部分綠原酸的分解，導致提取率的降低。為了節(jié)約時間降低能耗和減少有效成分的分解，選取回流時間為60 min 左右較為合適。

圖4 不同回流時間對綠原酸提取率的影響Figure 4 Effect of reflux time on yield of chlorogenic acid

2.2.4 提取次數對綠原酸得率的影響 由圖5 表明，在其他條件固定不變的情況下，回流2 次后，金銀花中的綠原酸基本接近提取極限；繼續(xù)增加提取次數不會顯著增加其得率，反而會大大增加提取時間和能耗等綜合成本，因此，水提取綠原酸工藝固定為回流2次比較合適。

圖5 不同提取次數下綠原酸的提取率Figure 5 Effect of extraction numbers on yield of chlorogenic acid

2.3 回流提取工藝正交試驗結果分析

根據表3 正交試驗結果中極差R的大小可知，對金銀花中綠原酸的得率影響最顯著的是因素C 液料比，其次為因素B 回流時間，因素A 溫度的影響最不顯著。因此，采用水提回流法提取金銀花中的綠原酸時，應最大限度地控制好液料比，回流時間和回流溫度適中，以減少生產成本及降低綠原酸的損失，簡化生產工藝。由上述分析結果可以推導出，最佳提取工藝的條件為A2B2C2，即回流溫度為75℃，回流時間為60 min，液料比為25 mL·g-1。根據優(yōu)化所得最佳提取條件，平行提取3 份，在該條件下綠原酸的相對提取率為97.22%±0.84%。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test

3 結論與討論

綠原酸是金銀花的主要有效成分，具有多種生物活性和極高的藥用和經濟價值，其提取與利用技術研究一直備受關注，世界范圍中國、美國、日本、歐洲申報相關的專利已超過800 件，被廣泛應用到人用藥、保健品、化妝品、飲料、飼料、獸用藥、植物生長劑等行業(yè)[10]。已有關于金銀花綠原酸提取文獻報道也涉及多種不同工藝技術。王鑫等[11]優(yōu)化得到55%乙醇回流法提取綠原酸的最佳提取條件：乙醇體積分數為55%，液料比為40 mL·g-1，回流時間為60 min，提取溫度為60℃，在此提取條件下，綠原酸的得率為11.0%。劉金磊[12]等以70%的乙醇為提取劑得到金銀花中綠原酸提取的最佳條件：料液比為1∶25，pH 值為6.0，提取溫度為60℃，提取時間為60 min。李杰等[13,20]應用反應釜分別采用溶劑熱和水熱法優(yōu)化提取金銀花綠原酸工藝，結果表明，溶劑熱法提取綠原酸的最佳提取工藝條件為甲醇濃度為50%，提取溫度為110℃，提取溶劑pH 值為6.0，提取時間為30 min；綠原酸水熱法提取的最佳條件：液料比為20 mL·g-1，提取溫度為120℃，提取時間為20 min。浦娜娜等[21]通過響應面優(yōu)化得到超高壓處理提取金銀花綠原酸的最優(yōu)條件：提取壓力為325 MPa，保壓時間為10 min，提取時間為2 h，液料比為10 mL·g-1，乙醇濃度為60%。李華生等[22]采用高壓反應釜優(yōu)化得到加壓輔助同步提取金銀花中總黃酮和綠原酸的最佳工藝條件：甲醇濃度為60%，液料比為20 mL·g-1，提取壓力為2 MPa，提取時間為30 min，提取溫度為70℃。周慧燕等[15]優(yōu)選出[C4mim][BF4]的離子液體水溶液提取金銀花綠原酸工藝：離子液體與水體積比為4∶11，液料比為30 mL·g-1，400 W 微波提取為2.5 min。此外，周慧燕等[17]建立以氯化膽堿/尿素低共熔溶劑提取金銀花中綠原酸的新方法，通過單因素和正交試驗結果得到綠原酸提取的最佳工藝：液料比為25 mL·g-1，水浴溫度為70℃，提取時間為60 min。綜合以上文獻可知，最佳工藝的主要考察因素范圍：液料比為10～ 30 mL·g-1，提取溫度為60～ 120℃，提取時間30～ 120 min，得到金銀花綠原酸得率為3%～ 11%，存在較大差異，主要原因是所用實驗材料不同所以無法直接比較；由于它們大都采用有機溶劑或新型溶劑或特殊設備，因而對生產條件和設備均具有一定要求。

本實驗以水為提取溶劑，研究表明，水提回流法對金銀花中綠原酸的提取率優(yōu)于煎煮法和超聲法；進一步綜合單因素和正交試驗結果，優(yōu)化得到回流法提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件為：提取溫度為75℃，提取時間為60 min，液料比為25 mL·g-1，提取次數為2 次，與文獻報道的其他提取最佳工藝的因素參數比較接近，在該條件下綠原酸的相對提取率達到97%以上。相較于傳統(tǒng)乙醇、甲醇有機溶劑及一些新型提取溶劑，水是一種安全、環(huán)保、廉價的提取溶劑，此外水提回流法對設備要求相對簡單、成本較低，且該法較煎煮法和超聲法的溶劑耗用量少，因為溶劑能循環(huán)使用，有效成分浸出較完全，因而本研究結果為金銀花綠原酸提取提供了一種較為簡便與高效的方法，將為金銀花在種植產地的加工與綜合開發(fā)利用提供有益參考。