雷佩雯，干詩穎，孫家怡，彭思嫻，欒牧，高培軍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

開化紙因產(chǎn)自浙江省開化縣而得名，有紙壽千年、中國手工紙皇冠上的明珠之美譽(yù)。開化紙始于唐宋，盛于明清，風(fēng)靡朝野，是明清時期古籍印刷的御用紙，紙色潔白雅致、質(zhì)地柔軟堅韌，其以蕘花屬Wikstroemia植物韌皮纖維為主要原料制作[1]。清末，因戰(zhàn)亂、造紙核心原料枯竭等原因，造紙技藝中斷百年。古籍修復(fù)是古籍保護(hù)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，我國古籍修復(fù)紙主要依賴日本進(jìn)口，而隨著開化紙造紙工藝的復(fù)原，這種依賴進(jìn)口的境況將得到極大改善，對于發(fā)明造紙術(shù)的我國來講，不僅有極高的經(jīng)濟(jì)價值，更有重大的政治意義。目前，國內(nèi)外尚未開展蕘花屬植物的人工林培育，開化紙造紙原料主要依靠采挖野生資源及從菲律賓進(jìn)口干料來完成，已嚴(yán)重影響開化紙的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，蕘花屬植物人工林培育迫在眉睫。因此，需要快速繁殖大量蕘花屬植物種苗來全面滿足人工林營造的生產(chǎn)需求。

北江蕘花W.monnula為瑞香科Thymelaeaceae 蕘花屬多年生落葉灌木[2]，具有瀉水逐飲，消堅破積之功效[3]；其枝條細(xì)長，韌皮纖維發(fā)達(dá)，可造紙。北江蕘花主要生長在浙江衢州等地區(qū)，可作為開化紙的制作原料，取材方便。目前，關(guān)于北江蕘花的組織培養(yǎng)和快速繁殖尚未見報道，僅有關(guān)于北江蕘花同屬植物南嶺蕘花W.indica的組織培養(yǎng)研究[4]。南嶺蕘花與北江蕘花都是主要生長在南方的蕘花屬植物，生長習(xí)性相似，因此，可參考前人的研究內(nèi)容設(shè)計北江蕘花組織培養(yǎng)試驗(yàn)方案。

本研究以北江蕘花幼嫩葉片和莖段為材料，開展不定芽誘導(dǎo)、增殖與壯苗的研究，以期構(gòu)建最適宜北江蕘花組培快繁的育苗體系，實(shí)現(xiàn)北江蕘花的離體快速繁殖。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018 年11 月，從浙江省衢州市開化縣引種30 株2 年生北江蕘花裸根苗，苗高約為1.56 m，地徑約為1.45 cm。采用塑料花盆（38 cm×28 cm），盆內(nèi)栽培基質(zhì)為泥炭、珍珠巖和蛭石，按1∶1∶1 的體積比混合，栽培于浙江農(nóng)林大學(xué)智能溫室，3 個月后供試驗(yàn)用。

MS 培養(yǎng)基、WPM 培養(yǎng)基、α-萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）購自PhytoTech，蔗糖、活性炭（AC）購自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司，植物凝膠（Gelrite）購自Sigma 公司，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）購自上海源葉生物科技有限公司，試劑NaClO、噻苯?。═DZ）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）購自浙江卡爾生物技術(shù)有限公司。

1.2 外植體的選擇和消毒方法

取生長健壯的北江蕘花盆栽苗當(dāng)年生枝條，截取枝條前端15 cm 左右，在流水下沖洗2 h 后，先用75%酒精消毒30 s，無菌水洗3～ 5 遍后再用0.50% NaClO 溶液浸泡消毒10 min，無菌水洗5～ 7 遍。在無菌條件下，剪取葉腋上0.5 cm、葉腋下0.5 cm 幼嫩莖段和靠近葉柄端的葉片，用無菌濾紙吸干試材表面水分后接種至未添加任何激素的培養(yǎng)基中。每隔3 d 觀察1 次污染情況，30 d 后統(tǒng)計污染數(shù)量和未污染且能萌發(fā)的外植體數(shù)量。以污染數(shù)與總接種數(shù)的比值為污染率，以未污染但褐死的外植體與總接種數(shù)的比值為褐死率。結(jié)果表明，以幼嫩葉片為外植體，污染率為37.82%，褐死率為26.8%；以幼嫩莖段為外植體，污染率為33.66%，褐死率為29.85%。

1.3 直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽試驗(yàn)

取無菌幼嫩莖段外植體接種至附加了3 種不同濃度6-BA（0.01、0.10、1.00 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基中[5]。試驗(yàn)共設(shè)置6 個處理，每個處理的接種數(shù)為50 個莖段，3 次重復(fù)，30 d 后觀察萌發(fā)情況并計算芽誘導(dǎo)率。

1.4 間接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽試驗(yàn)

取無菌幼嫩葉片外植體接種至附加不同濃度2,4-D（0、0.2、2.0 mg·L-1）和TDZ（0.4、4.0、8.0 mg·L-1）的MS 培養(yǎng)基中[6]。試驗(yàn)共設(shè)置9 個處理，每個處理接種50 個外植體，3 次重復(fù)，培養(yǎng)30 d 后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況和芽生長情況并計算出愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率。

1.5 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

挑選無污染、長勢一致的無菌苗接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基以WPM 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（0.1、1.0、3.0 mg·L-1）和NAA（0、0.01、0.10 mg·L-1）[8]。試驗(yàn)共設(shè)置9 個處理，每個處理接種50 株無菌苗，3 次重復(fù)，30 d 后觀察并記錄叢芽的生長狀況和增殖情況。

1.6 壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)

將增殖后長勢良好的組培苗接種至增殖培養(yǎng)基上。壯苗培養(yǎng)分別采用附加聚乙烯吡咯烷酮（PVP：500、1 000 mg·L-1）和活性炭（AC：1 000、2 000 mg·L-1）的增殖培養(yǎng)基以及未附加上述物質(zhì)的增殖培養(yǎng)基作為對照。試驗(yàn)共設(shè)置5 個處理，每個處理接種50 株組培苗，3 次重復(fù)，30 d 后觀察并記錄叢芽的生長狀況和增殖情況。

1.7 其它條件

本試驗(yàn)中若無特殊說明，均在培養(yǎng)基中加入30 g·L-1蔗糖，pH 調(diào)節(jié)至5.7，以3.5 g·L-1Gelrite 為凝固劑，滅菌條件為121℃、215 KPa，滅菌時間為10 min。無菌外植體的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度2.5×103lx，每天的光照時間為16 h，環(huán)境溫度為（25±2）℃，空氣相對濕度為60%～ 90%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，方差分析采用Duncan’s 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同6-BA 濃度和培養(yǎng)基對腋芽誘導(dǎo)的影響

由腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），在MS 培養(yǎng)基中的組培苗均出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，在添加0.01 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中，大部分組培苗出現(xiàn)玻璃化，隨著6-BA 濃度的增加，葉片的玻璃化程度加深；在WPM 培養(yǎng)基中，添加0.01 mg·L-16-BA 處理的組培苗未發(fā)生玻璃化，生長狀況最好，腋芽誘導(dǎo)率達(dá)45.3%，隨著6-BA 濃度的增加，葉片玻璃化程度逐漸加深，芽誘導(dǎo)率呈先上升后下降趨勢，但各處理間的芽誘導(dǎo)率無顯著差異，這表明最佳的北江蕘花腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是WPM+0.01 mg·L-16-BA（圖1A）。

表1 不同6-BA 濃度和培養(yǎng)基對北江蕘花腋芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different 6-BA concentration and medium on axillary bud induction

圖1 北江蕘花組織培養(yǎng)過程的不同階段Figure 1 Different stages of tissue culture of W.monnula

2.2 不同濃度2,4-D 和TDZ 對愈傷組織誘導(dǎo)和芽誘導(dǎo)的影響

2.2.1 對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 由愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），在MS 培養(yǎng)基中未添加2,4-D 處理，對愈傷組織誘導(dǎo)率較低；添加2,4-D 后，隨著2,4-D 濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈上升趨勢。在2,4-D 濃度一定時，隨著TDZ 濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈先上升后下降趨勢。處理8（2.0 mg·L-12,4-D＋4.0 mg·L-1TDZ）的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)65.1%，與處理2（4.0 mg·L-1TDZ）相比，愈傷組織誘導(dǎo)率增加了6.5 倍。處理2的芽誘導(dǎo)率最高，與處理8 相比，芽誘導(dǎo)率增加了2.8 倍。

表2 不同濃度2,4-D 和TDZ 對愈傷組織誘導(dǎo)和芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of different concentrations of 2,4-D and TDZ on callus and bud induction

F檢驗(yàn)結(jié)果表明（表3），TDZ 和2,4-D 對愈傷組織誘導(dǎo)均呈現(xiàn)出極顯著性差異，TDZ 和2,4-D 的交互作用差異顯著。因此，最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS +2 mg·L-12,4-D+4 mg·L-1TDZ。

長期以來對數(shù)學(xué)實(shí)用性的誤解層出不窮，很多數(shù)學(xué)家也認(rèn)為數(shù)學(xué)應(yīng)該追求純粹的知識，即使是阿基米德那樣的偉大人物也反對站在實(shí)用的角度研究知識，這也是古希臘文明一度沉寂的原因。歷史已經(jīng)證明，聯(lián)系現(xiàn)實(shí)世界才是數(shù)學(xué)的出路，高職學(xué)生要學(xué)好數(shù)學(xué)，唯一的途徑只能是開發(fā)便于理解，方便記憶，隨時應(yīng)用現(xiàn)實(shí)世界的課程。

表3 不同激素處理對愈傷組織誘導(dǎo)影響的方差分析Table 3 ANOVA on effect of different hormone treatments on callus induction

2.2.2 對芽分化率的影響 由表4 可知，未添加NAA 時，隨著TDZ 濃度的升高，愈傷組織的芽分化率呈先上升后下降趨勢；添加NAA 后，隨著TDZ 濃度的升高，芽分化率呈上升趨勢。處理6（1.0 mg·L-1NAA＋2.5 mg·L-1TDZ）的芽分化率與其他處理均存在顯著差異（P＜0.05），在該處理下芽分化率最大，達(dá)64.9%，較處理4（1.0 mg·L-1NAA＋0.4 mg·L-1TDZ）增加了60%。

表4 不同濃度TDZ 和NAA 對芽分化率的影響Table 4 Effect of different concentrations of TDZ and NAA on bud differentiation rate

F 檢驗(yàn)結(jié)果表明（表5），TDZ、TDZ 和NAA 的交互作用對芽分化率的影響差異極顯著（P<0.01）。因此，最佳的愈傷組織分化培養(yǎng)基為WPM+1 mg·L-1NAA +2.5 mg·L-1TDZ（圖1D）。

表5 不同處理對芽分化率影響的方差分析Table 5 ANOVA of effect of different treatments on bud differentiation rate

2.3 不同濃度6-BA 和NAA 對無菌苗不定芽增殖的影響

由增殖試驗(yàn)結(jié)果（表6）表明，未添加NAA 時，增殖系數(shù)偏低；添加NAA 后，隨著6-BA 濃度的升高，增殖系數(shù)呈下降趨勢，組培苗葉色逐漸變黃，褐化逐漸加重。在6-BA 濃度一定時，隨著NAA 濃度的升高，增值系數(shù)呈上升趨勢。處理3（0.1 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA）的增殖系數(shù)最高，達(dá)4.84，且無菌苗的生長狀況良好（圖2A），較處理9（3.0 mg·L-16-BA＋0.10 mg·L-1NAA）的增殖系數(shù)增加了近1 倍。

表6 不同濃度6-BA 和NAA 對增殖的影響Table 6 Effect of different concentrations of 6-BA and NAA on multiplication

圖2 增殖培養(yǎng)Figure 2 Multiplication culture

F檢驗(yàn)結(jié)果表明（表7），6-BA 和NAA 對無菌苗不定芽增殖均呈現(xiàn)出極顯著性差異（P<0.01），6-BA 和NAA 的交互作用差異不顯著。因此，最適宜北江蕘花增殖的培養(yǎng)基為WPM+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA。

表7 不同處理對增殖影響的方差分析Table 7 ANOVA on effect of different treatments on multiplication

2.4 不同濃度PVP 和AC 對組培苗生長的影響

在組培增殖過程中，許多植物會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于后續(xù)的培養(yǎng)發(fā)育，所以需要對組培苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)[9]。由表8 試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照相比，添加500 mg·L-1PVP 后增殖系數(shù)顯著增加，為4.94，當(dāng)PVP 濃度升高至1 000 mg·L-1時，增值系數(shù)增加到5.42，但2 種PVP 濃度處理的增殖系數(shù)無顯著差異，植物葉片顏色變淺，葉形不變，莖變粗（圖2B）；與對照相比，添加1 000 mg·L-1AC 后增殖系數(shù)增加，為3.98，當(dāng)AC 濃度升高至2 000 mg·L-1時，增值系數(shù)下降到2.78，葉片顏色保持濃綠，葉形由卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)榕樞?，部分植株葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，且低濃度AC 處理，植株高生長較快（圖2C）。從后續(xù)生產(chǎn)角度考慮，添加1 000 mg·L-1PVP 處理增殖系數(shù)最高，可獲得更多生長健壯的幼苗。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可知，最適宜北江蕘花壯苗的培養(yǎng)基為WPM+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+1 000 mg·L-1PVP。

表8 不同類型添加物和不同添加量對北江蕘花生長狀況的影響Table 8 Effect of different concentrations of PVP and AC on tissue cultured seedling growth

3 討論

組培快繁是實(shí)現(xiàn)種苗規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑之一[10]。隨著組培快繁技術(shù)的不斷成熟，該技術(shù)在珍稀瀕危、資源緊缺的植物資源保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用。Yadav[11]等使用三角葉楊Populusdeltoids的葉片、根系、莖節(jié)等器官進(jìn)行組培研究，獲得了完整植株。武夢瑤[12]以米槁Cinnamomum m igao帶芽莖段和葉片為外植體，通過不定芽及愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及煉苗移栽的過程，成功獲得再生植株。

3.1 直接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

瑞香科植物莖段常采用6-BA 誘導(dǎo)不定芽[13]。本研究結(jié)果表明，6-BA 濃度過高會抑制不定芽的形成，并且芽苗質(zhì)量差，葉片玻璃化嚴(yán)重，這與張虎等[14]對芫花Daphne genkwa莖段的誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果相似；北江蕘花對基本培養(yǎng)基類型較敏感，高無機(jī)鹽含量的MS 培養(yǎng)基不利于不定芽誘導(dǎo)，中等無機(jī)鹽含量的WPM 培養(yǎng)基更適宜莖段直接誘導(dǎo)不定芽[15]。

3.2 間接器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)不定芽

植物生長調(diào)節(jié)劑能促進(jìn)愈傷組織的形成和不定芽的產(chǎn)生[16]，TDZ 對木本植物的再生非常有效，而且需要較高濃度才能促進(jìn)木本植物器官發(fā)生[17]。沈苗苗[18]研究發(fā)現(xiàn)TDZ 對芍藥Paeonia lactiflora愈傷組織誘導(dǎo)起到關(guān)鍵作用，與2,4-D 結(jié)合能更好地誘導(dǎo)外植體愈傷組織形成。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用TDZ 對愈傷組織誘導(dǎo)率較低，加入2,4-D 后對愈傷組織誘導(dǎo)率顯著增加，TDZ 濃度過高時對愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制作用[19]。這可能是由于TDZ對愈傷組織誘導(dǎo)的促進(jìn)作用具有一定的濃度區(qū)間，在適宜的含量區(qū)間內(nèi)效果顯著[20]。植物在不同階段所需激素種類與濃度不盡相同，2,4-D 是植物脫分化的重要激素，因而在分化過程中不應(yīng)添加，而NAA 有利于植株分化[21]。張嬌等[22]在華北繡線菊Spiraea fritschiana試驗(yàn)中選擇TDZ 與NAA 組合誘導(dǎo)不定芽，植株分化后不定芽生長健壯。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以TDZ 和NAA 為外源激素，通過濃度及配比的不同，產(chǎn)生交互作用，對植株的分化能力產(chǎn)生促進(jìn)作用[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，以莖段誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)、葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)2 種途徑對北江蕘花進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，2 種培養(yǎng)途徑均有各自優(yōu)勢，莖段誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)途徑用時短，但芽生長勢較弱，易玻璃化，后續(xù)需壯苗培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)途徑培養(yǎng)方式用時較長，但芽誘導(dǎo)率高、生長勢良好。因此，對比發(fā)現(xiàn)，莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)可作為北江蕘花不定芽誘導(dǎo)的最佳途徑。

3.3 增殖培養(yǎng)

有研究表明，單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素不利于叢生芽增殖和生長，與生長素組合有利于叢生芽的誘導(dǎo)和增殖[24]。在瑞香科植物中，徐強(qiáng)興等[25]對土沉香Aquilaria s inensis、江洪如等[26]對金邊瑞香Daphne od ora采用6-BA 和NAA 組合進(jìn)行增殖試驗(yàn)，增殖系數(shù)最高達(dá)4.1。本研究結(jié)果表明，6-BA 和NAA 組合對北江蕘花不定芽增殖效果較好，增殖系數(shù)最高達(dá)到4.84，增殖系數(shù)高于二人所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果；6-BA 濃度要在較低水平才能獲得理想的增殖率和生長勢，提高濃度會導(dǎo)致組培苗生長狀況變差[27]。從研究結(jié)果初步推斷，高濃度6-BA 處理可能會破壞植物體內(nèi)的激素平衡水平，從而抑制了芽的生長[28]。因此，在以6-BA 誘導(dǎo)芽增殖時應(yīng)選擇合適的激素配比。

4 結(jié)論與展望

北江蕘花幼嫩葉片和莖段分別采用兩種方式進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，以莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽時，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+0.01 mg·L-16-BA，腋芽誘導(dǎo)率為45.3%，誘導(dǎo)得到的芽生長狀況良好，葉片舒展，顏色較淺，無玻璃化；以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4 mg·L-1TDZ+2 mg·L-12.4-D，愈傷組織誘導(dǎo)率為65.1%；將誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最佳分化培養(yǎng)基為WPM+2.5 mg·L-1TDZ+1 mg·L-1NAA，芽分化率為64.9%。以6-BA 與NAA 誘導(dǎo)北江蕘花不定芽的增殖，不定芽的最佳增殖培養(yǎng)基為WPM+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，增殖系數(shù)為4.84。將長勢較好的組培苗接入壯苗培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)基WPM+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+1 000 mg·L-1PVP 中，增殖系數(shù)達(dá)到5.42。

后續(xù)北江蕘花組織培養(yǎng)的研究重點(diǎn)主要在以下兩方面：一是對北江蕘花無菌苗生根技術(shù)進(jìn)行研究，二是對生根苗進(jìn)行煉苗與移栽，從而建立一套北江蕘花無菌苗再生體系，實(shí)現(xiàn)北江蕘花產(chǎn)業(yè)化育苗。