姚林娜，張瑞華，張愛蓮，陳亞薄，陳永健，俞雪蘭

（1.浙江省特色中藥資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300；2.杭州市臨安區(qū)青山湖街道辦事處，浙江 杭州 311305；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 安吉 313399）

竹又名竹子，是禾本科Poaceae 和竹亞科Bambusoideae 多年生常綠植物，熱帶和副熱帶是其生長的主要地區(qū)[1]。中國竹資源充裕，目前成熟的竹子產(chǎn)業(yè)主要是在竹材加工、竹筍消費及竹化工等方面，是備受重視的綠色環(huán)保產(chǎn)業(yè)[2]。然而，涉及竹葉的相關(guān)產(chǎn)品較少，大部分作為廢棄物燃燒丟棄[3]。竹葉入藥的歷史早有記載，是我國傳統(tǒng)藥材之一。竹葉中含有大量的次生代謝產(chǎn)物，其中黃酮類化合物是主要有效物質(zhì)，是一種天然食品抗氧化劑。竹葉黃酮（Bamboo Leaf Flavonoids，BLF）是指從剛竹屬Phyllostachys竹的葉片中分離出來的黃酮類制劑，具有多種功效，如抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌等，在化妝品、保健品等領(lǐng)域有著較大的應(yīng)用潛力，于2014 年被國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準(zhǔn)作為“新食品原料”使用[4]。竹葉黃酮的原料為竹葉，具有大量的資源和成熟的制備工藝[5]。

大孔吸附樹脂因其相對低的成本及易再生的特點而被應(yīng)用于富集多酚化合物、類黃酮等活性成分[6]。雖然有文獻報道過采用大孔樹脂分離和純化竹葉黃酮，但一些研究局限于評價樹脂的靜態(tài)性能，缺少對于樹脂的動態(tài)吸附和解吸行為的了解，不利于竹葉黃酮的分離和純化[7]。本實驗擬考察AB-8 大孔樹脂吸附-解吸特性以及用于竹葉總黃酮分離純化的最佳工藝條件，運用紫外分光光度法對竹葉黃酮含量進行檢測；以清除DPPH 自由基、·OH 的能力為指標(biāo)，對純化前后竹葉總黃酮的抗氧化能力進行了研究，為減少竹葉資源浪費，加快竹葉黃酮產(chǎn)業(yè)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

實驗樣品與化學(xué)試劑：竹葉黃酮初樣品（浙江圣氏生物科技有限公司）、蘆丁（合肥博美生物科技有限公司）、無水乙醇、乙酸乙酯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、濃硫酸、過氧化氫（永華化學(xué)股份有限公司）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰菲羅啉、1,1-二苯基-2-苦基肼（上海源葉生物科技有限公司）、硫酸亞鐵（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、鹽酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）、AB-8 大孔吸附樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司）等。

實驗儀器：電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、電子分析天平（FA2204，力辰科技公司）、超聲波清洗儀（D5-7510DTH，上海生析超聲儀器有限公司）、旋片式真空泵（2XZ-2，上海雅譚真空設(shè)備有限公司）、真空干燥箱（DZF-6020，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、酶標(biāo)儀（EPOCH2，美國伯騰公司）、超純水儀（D24UV，彤迪科學(xué)儀器（上海）有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置（R-201，上海申勝生物技術(shù)有限公司）、普通層析柱（13 mm×150 mm，溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 AB-8 大孔樹脂預(yù)處理 結(jié)合相關(guān)文獻與預(yù)實驗結(jié)果，選取AB-8 大孔樹脂進行后續(xù)實驗。用95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇浸泡過夜，用高純水洗至無醇味，用5%鹽酸溶液漂洗4 h，再用高純水洗脫，洗至pH 值為中性后，用5%氫氧化鈉溶液漂洗4 h，然后用高純水洗至pH 值為中性，浸泡于95%乙醇中備用，使用前用高純水洗一段時間，直到洗脫液無醇味[8]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4.5 mg，用50%乙醇定容至10 mL 容量瓶中，搖勻得濃度為0.45 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.3 mL，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉4 mL，加入50%乙醇至刻度，搖勻。放置15 min，于510 nm 波長處測得各個蘆丁質(zhì)量濃度的吸光度，記錄數(shù)值[9]。設(shè)置吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

式中，x為蘆丁質(zhì)量濃度，y為510 nm 處的吸光度。相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

1.2.3 樣品的測定 取待測洗脫液2.0 mL 于10 mL 容量瓶中，按“1.2.2”項下操作，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3 動態(tài)優(yōu)化AB-8 大孔樹脂吸附-解吸竹葉總黃酮

選用規(guī)格為13 mm×150 mm 的層析柱。在室溫下，根據(jù)其膨脹系數(shù)及柱體積將13 mL 處理好的AB-8 大孔樹脂濕法上柱，設(shè)置梯度上樣液質(zhì)量濃度、體積、上樣流速以及洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)和體積，分別探究各個條件對AB-8 大孔樹脂吸附率、解吸率的影響。合理分析每次所得數(shù)據(jù)，篩選并確定最優(yōu)工藝條件。

1.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對吸附效果的影響 精密稱量竹葉黃酮初樣品0.12 g，在容量瓶中用水定容至100 mL，配制成濃度分別為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mg·mL-1的供試品溶液，以2 BV·h-1（BV：柱體積，下同）流速上樣，收集各洗脫液，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度，求得AB-8 大孔樹脂的吸附率[10]。

1.3.2 上樣流速對吸附效果的影響 保持體積100 mL、竹葉黃酮初樣品質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1不變，分別以1、2、3、4、5 BV·h-1的流速上樣，且在3 BV·h-1流速下，收集各個洗脫液，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度[11-12]，繪制AB-8 大孔樹脂柱動態(tài)吸附穿透曲線，找出泄漏點，最終確定最佳的竹葉總黃酮流速。

1.3.3 上樣體積對吸附效果的影響 保持流速為3 BV·h-1、竹葉黃酮初樣品質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1不變，分別以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mL 體積上樣，且在3 BV·h-1流速下，以10 mL 為一體積單位在試管中收集，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度，繪制AB-8 大孔樹脂柱動態(tài)吸附穿透曲線，找出泄漏點，最終確定最佳上樣體積。

1.3.4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響 恒定流速為3 BV·h-1，用100 mL 體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脫，收集各洗脫液，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度，根據(jù)上述檢測數(shù)據(jù)計算得到AB-8 大孔樹脂在各洗脫體積分?jǐn)?shù)下的動態(tài)解吸率。

1.3.5 洗脫體積對解吸率的影響 保持70%乙醇，3 BV·h-1的流速不變，分別以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mL 體積洗脫，每10 mL 收集一次[13]，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度，得到最佳洗脫液的體積。

1.3.6 不同洗脫流速對洗脫效果的影響 根據(jù)所得的最佳上樣條件上柱，洗脫時，分別用60 mL 的70%乙醇以1、2、3、4、5 BV·h-1的流速進行洗脫。收集各洗脫液，測定洗脫液中黃酮的質(zhì)量濃度，計算解吸率，得到最佳洗脫流速[14]。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 清除DPPH 自由基能力的測定

（1）分別取25 mg 竹葉黃酮樣品，用無水乙醇定容至25 mL，得到濃度為1 mg·mL-1的竹葉黃酮供試品溶液；分別取2、4、6、8 mL 上述溶液各用無水乙醇稀釋至10 mL 容量瓶，得到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1濃度的供試品溶液。

（2）將已配制成0.1 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液，分別吸取不同梯度質(zhì)量濃度的竹葉黃酮樣品溶液及DPPH溶液各100 μL于96 孔板小孔內(nèi)；室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度[15]，測定3 次取平均值（A1）；準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度的竹葉黃酮樣品溶液和乙醇溶液各100 μL 共置于96 孔板小孔內(nèi)，避光放置反應(yīng)30 min，在517 nm 波長處測定吸光度（A2）；準(zhǔn)確吸取DPPH 溶液和乙醇溶液100 μL 共置于96 孔板小孔內(nèi)，避光放置反應(yīng)30 min，在517 nm 波長處測定吸光度（A0）[16]。利用下列公式計算不同質(zhì)量濃度竹葉黃酮樣品對DPPH 自由基的清除率：

1.4.2 清除·OH 能力測定

（1）分別取25 mg 竹葉黃酮樣品，用水定容至25 mL，得到濃度為1 mg·mL-1的竹葉黃酮供試品溶液；分別取2、4、6、8 mL 上述溶液各用水稀釋至10 mL 容量瓶，得到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的供試品溶液。

（2）取5 支試管，在試管中分別加入pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液2 mL、0.75 mmol·L-1鄰菲羅啉無水乙醇溶液1 mL 及0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1 mL，每加一管后立即混勻，再向其中加入不同濃度梯度的1 mL 竹葉黃酮樣品溶液，混勻，最后加入1%雙氧水溶液1 mL，于37℃下水浴保溫1 h，在510 nm 波長處測定吸光度（A2）[17]。重復(fù)上述步驟，另外再做損傷管和未損傷管，其中損傷管A1中加入1%的雙氧水溶液和蒸餾水各1 mL，未損傷管A0以2 mL 蒸餾水代替雙氧水溶液和樣品溶液作為空白對照[18]。計算清除率，其計算公式為：

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，求得不同條件下竹葉黃酮的吸附率和解吸率，DPPH 自由基清除率以及·OH 清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝條件對AB-8 大孔樹脂吸附-解吸竹葉總黃酮的影響

2.1.1 上樣液質(zhì)量濃度對竹葉總黃酮吸附效果的影響 由圖1 可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，AB-8 大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率逐漸降低。當(dāng)上樣液濃度為0.8 mg·mL-1時，AB-8 大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率為94.1%，而當(dāng)上樣液濃度為1.6 mg·mL-1時，AB-8 大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率降低為71.1%。這說明在一定濃度范圍內(nèi)，上樣液質(zhì)量濃度越高，單位表面積與大孔樹脂接觸量也越大，傳質(zhì)速率越慢，大孔樹脂表面吸附越容易趨于飽和，導(dǎo)致吸附率逐漸下降。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度較小時，樹脂的利用率比較低，綜合考慮黃酮的吸附率與樹脂的利用率，選擇0.8 和1.6 mg·mL-1的平均濃度1.2 mg·mL-1作為最佳上樣濃度。

2.1.2 上樣流速和上樣體積對竹葉總黃酮吸附效果的影響 本實驗通過控制樹脂床的流速考察不同流速下的吸附效果，上樣流速對樹脂的吸附效率及所用時間均有著一定的影響。由圖2 可知，隨著上樣流速的增加，AB-8大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附率逐漸降低。在低流速下，AB-8 大孔樹脂對竹葉總黃酮的吸附效果相對較好，但是隨之所耗時間會變長。綜合兩者來看，選擇2 BV·h-1作為上樣流速為宜。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對竹葉總黃酮吸附效果的影響Figure 1 Influence of mass concentration of loading solution on adsorption effect

圖2 上樣流速對竹葉總黃酮吸附效果的影響Figure 2 Influence of loading flow rate on adsorption effect

由圖3 可知，隨著上樣體積的增加，竹葉黃酮的吸附率逐漸降低。當(dāng)上樣體積較大時，竹葉黃酮單位表面積與大孔樹脂接觸量也越大，大孔吸附越容易趨于飽和，會降低吸附率；當(dāng)上樣體積較小時，樹脂的利用率比較低。綜合考慮兩者，選擇60 mL 作為上樣體積最為合適。

圖3 上樣體積對竹葉總黃酮吸附效果的影響Figure 3 Influence of loading volume on adsorption effect

2.1.3 洗脫體積分?jǐn)?shù)對竹葉總黃酮解吸率的影響 乙醇溶劑具有安全、廉價、易回收等優(yōu)點，因此用其做實驗最佳。由圖4 顯示，竹葉黃酮解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增高后降低，當(dāng)使用70%乙醇洗脫時，竹葉黃酮的解吸率最高，為77.0%；若乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，則竹葉黃酮的解吸率呈下降趨勢?？紤]到在實際工業(yè)生產(chǎn)中乙醇濃度過小會導(dǎo)致解吸不完全；乙醇濃度過大導(dǎo)致會雜質(zhì)過多，因而采用70%乙醇洗脫效果最好。

圖4 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對竹葉總黃酮解吸率的影響Figure 4 Influence of volume fraction of eluent on desorption rate

2.1.4 洗脫體積對竹葉黃酮解吸率的影響 按照最優(yōu)上樣條件進行吸附，用100 mL70%乙醇洗脫劑以2 BV·h-1的流速進行洗脫，結(jié)果如圖5。由圖5 可知，當(dāng)70%乙醇的洗脫體積在10～20 mL 時，竹葉黃酮的解吸率隨著洗脫劑洗脫體積的增加迅速增加，繼續(xù)增加洗脫劑的洗脫體積則竹葉黃酮的解吸率呈現(xiàn)斷崖式減小，表明大部分竹葉黃酮在洗脫劑的洗脫體積為10～ 20 mL 時被洗脫。當(dāng)洗脫劑的洗脫體積達到60 mL 時，其后的解吸率則幾乎不再變化，且總解吸率達到99.46%，幾乎解吸完全。綜合考慮洗脫液的利用率及生產(chǎn)效率，選擇60 mL70%乙醇為最佳洗脫體積。

圖5 洗脫體積對竹葉總黃酮解吸率的影響Figure 5 Influence of elution volume on desorption rate

2.1.5 不同洗脫流速對竹葉黃酮洗脫效果的影響 由圖6 可知，竹葉黃酮的解吸率隨著洗脫流速的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)洗脫流速從1 BV·h-1增加到3 BV·h-1，AB-8 大孔樹脂吸附的竹葉黃酮的解吸率隨之升高；在洗脫流速超過3 BV·h-1時，竹葉黃酮的解吸率隨之減小?？傮w來說，不同洗脫流速對解吸效果的影響不大，3 BV·h-1為最適合洗脫流速。

圖6 不同洗脫流速對竹葉總黃酮洗脫效果的影響Figure 6 Influence of different elution flow rates on elution

2.2 A B-8 大孔樹脂純化竹葉黃酮工藝驗證實驗

采用AB-8 大孔樹脂純化竹葉黃酮，考察各因素對吸附-解吸性能的影響，由此得到的最佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1、上樣流速為2 BV·h-1、上樣體積為60 mL；洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%、洗脫體積為60 mL、洗脫流速為3 BV·h-1。在此條件下對竹葉黃酮進行純化，將收集到的洗脫液濃縮干燥，測得其純度由28.39%提高至77.42%，約為純化前的2.7 倍，純化效果顯著?；厥章蕿?01.27%，可能存在其他黃酮類物質(zhì)的干擾。

2.3 竹葉黃酮清除DPPH 自由基能力的測定

竹葉黃酮純化前后都對DPPH 自由基有明顯的消除作用，其清除能力隨著竹葉黃酮濃度的升高而增強（如圖7），在0.2～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，初樣品對DPPH 自由基的清除能力比純化后的稍弱，隨著濃度的不斷升高，其消除能力仍與純化后的竹葉黃酮存在著不小的差異。綜合測定結(jié)果分析，在竹葉黃酮質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1時，初樣品的清除率到達了93.52%，而純化后供試品的清除率達到了96.68%，具有非常優(yōu)異的清除作用。從總體上看，上樣液中總黃酮含量越高，其抗氧化效果越好。以上結(jié)果說明經(jīng)過純化工藝過后的竹葉黃酮提取液相比粗提物具有更好的抗氧化活性，為進一步研究提供了參考。

圖7 竹葉黃酮對DPPH 自由基的清除能力Figure 7 Scavenging ability of BLF to DPPH

2.4 竹葉黃酮清除·OH 能力的測定

由圖8 可知，純化前后的竹葉黃酮對·OH 的清除效果與對DPPH 自由基的清除效果相似，對·OH 的清除率均隨著竹葉黃酮質(zhì)量濃度的升高而增強。純化后竹葉黃酮對·OH 的清除能力普遍高于純化前，而且二者隨著質(zhì)量濃度的增加，其對·OH 的清除能力差異越來越大，在濃度為1.0 mg·mL-1時，純化后竹葉黃酮的·OH 清除率達到了29.41%。從·OH 清除能力測定結(jié)果顯示，竹葉黃酮的粗提物含較多雜質(zhì)，因而對·OH 的清除效果相對較弱一些，AB-8 樹脂純化工藝進一步提高了竹葉黃酮的純度，并增強了其對·OH 的清除能力。

圖8 竹葉黃酮對·OH 的清除能力Figure 8 Scavenging ability of BLF to hydroxyl radical

3 結(jié)論與討論

本研究采用AB-8 大孔樹脂吸附法對竹葉黃酮進行純化，探討了AB-8 大孔樹脂的吸附及解吸的動力學(xué)特性，并對其動態(tài)吸附-解吸的工藝進行了優(yōu)化，確定了竹葉黃酮柱層析純化的最佳工藝條件為：上樣液質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1、上樣體積為60 mL、上樣流速為2 BV·h-1條件下上柱吸附；乙醇洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為70%、洗脫體積為60 mL、洗脫流速為3 BV·h-1的條件下進行洗脫。在此工藝條件下對竹葉黃酮進行純化，其純度由28.39%提高到77.42%，約為純化前的2.7 倍，竹葉黃酮對DPPH 自由基以及·OH 都具有較好的清除作用，其抗氧化活性隨著樣品濃度的增加而增強。通過研究得知，純化后得到的竹葉黃酮清除能力普遍較純化前強。該方法操作簡單，使用單一樹脂對竹葉黃酮進行純化，與混合樹脂相比，簡化了操作流程。

增加對樹脂的動態(tài)吸附和解吸行為的了解，相比較樹脂的靜態(tài)吸附，更具有研究意義。后續(xù)的抗氧化實驗為該純化工藝的延伸，再次驗證了純化工藝的可行性，表明該實驗可為竹葉黃酮進一步產(chǎn)業(yè)化提供參考依據(jù)。此外，本研究僅從總黃酮含量的角度研究，存在一定的干擾，后續(xù)實驗可以黃酮碳苷含量為檢測指標(biāo)進行深入研究。大孔樹脂對竹葉黃酮的純化存在一定的局限性，可結(jié)合其他柱色譜進行二次純化。