梁 燕,劉龍丁,楊夢莉,李敬美,郭 磊,李 恒,鄭惠文,李 菁,施海晶

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118)

近年來,埃博拉、尼帕、高致病性禽流感等疾病的爆發(fā)與蔓延,進(jìn)一步引起了全世界衛(wèi)生組織的高度重視和公眾的廣泛關(guān)注[1-3]。尤其新型冠狀病毒肺炎更是受到了世界各國和世界衛(wèi)生組織的高度重視[4]。為了研究這些致病性強(qiáng)、傳染性高、目前尚無特異性預(yù)防和治療的傳染病的控制措施,許多國家先后建立了高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室(BSL3/4實(shí)驗(yàn)室)和高等級動物生物安全實(shí)驗(yàn)室(ABSL3/4實(shí)驗(yàn)室)[5-8]。BSL3/4實(shí)驗(yàn)室和ABSL3/4實(shí)驗(yàn)室在設(shè)計原則上基本一致,但由于動物實(shí)驗(yàn)的特殊性及其具有更高的風(fēng)險性,使得ABSL3/4實(shí)驗(yàn)室在防護(hù)要求上更高于BSL3/4實(shí)驗(yàn)室。研究人員需經(jīng)嚴(yán)格生物安全實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范培訓(xùn),熟悉ABSL-3/4實(shí)驗(yàn)室操作及緊急事故處理辦法,才能真正降低生物安全隱患,杜絕生物安全事故的發(fā)生[9-10]。

ABSL-3/4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)動物為人工感染致死性或烈性感染性病原微生物的實(shí)驗(yàn)動物,其中,恒河猴由于其體型較大、動作敏捷、攻擊性強(qiáng)、容易抓傷咬傷工作人員,從而給在ABSL-3/4實(shí)驗(yàn)室中恒河猴實(shí)驗(yàn)帶來了極高的生物安全風(fēng)險[11]。除此之外,實(shí)驗(yàn)過程中每日產(chǎn)生的飼養(yǎng)廢棄物這個易被忽略的環(huán)節(jié)亦隱藏著極大的生物安全隱患。一般來說,恒河猴生物安全籠具是通過密封、負(fù)壓、單向氣流等措施來保證人和環(huán)境的安全。恒河猴每日均產(chǎn)生排泄物,但這些帶有感染性病原微生物的排泄物極其可能通過氣溶膠傳播的方式給實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境帶來極大的風(fēng)險。因而,本文結(jié)合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所大動物生物安全實(shí)驗(yàn)室的恒河猴飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn),以指示微生物對飼養(yǎng)過程中排泄物及沖洗過程所產(chǎn)生的浮游菌氣溶膠進(jìn)行模擬檢測,同時對按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程處理后的浮游菌進(jìn)行檢測,以資對ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中恒河猴飼養(yǎng)廢棄物的清潔消毒處理操作有效性進(jìn)行評價分析。

研究選用芽孢桿菌為指示微生物,采用便攜式浮游菌采樣儀分別對靜止?fàn)顟B(tài)下、活動(飼養(yǎng))狀態(tài)下、以及指示菌感染狀態(tài)下是否按照SOP進(jìn)行清潔消毒處理的猴籠地面及沖洗排水口處進(jìn)行浮游菌采集及檢測,從而對ABSL-3中恒河猴動物實(shí)驗(yàn)室的飼養(yǎng)及清潔標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的有效性進(jìn)行評估及分析,以保證最大程度降低ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中恒河猴動物實(shí)驗(yàn)的生物安全風(fēng)險。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性恒河猴2只,1～2歲,體重2.5～3 kg,來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長類研究中心[SCXK(滇)K2017-0002],飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SYXK(滇)K2015-0006]。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)本單位動物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會審查通過(DWSP201804006),實(shí)驗(yàn)過程按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)菌培養(yǎng)皿(sartorius stedim caso Agar TSA Agar BACTairTM,lot846106);酵母培養(yǎng)皿(sartorius stedim sabouraud Agar BACTairTM,lot846304);膜收集 皿(sartoriusstedim Gelatinepisposables,批 號846106);芽孢桿菌(Bacillus arophaeusATCC9372,Microbiologics,批號0953P);細(xì)胞周期試劑盒(Cell cycle staining kit(Multisciences),批號70-CCS012);細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根,批號DP302)。Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀(德國賽多利斯公司);流式細(xì)胞儀CYTOFLEX(美國貝克曼公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)

動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所ABSL-3實(shí)驗(yàn)室恒河猴籠具中,該實(shí)驗(yàn)室符合國標(biāo)《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489—2008)和世界衛(wèi)生組織《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊》的要求。恒河猴籠具為開放式猴籠(見圖1),采用雙層設(shè)計,內(nèi)層含直飲水噴嘴,外層門為鎖扣式,配有方便裝卸的飼料盒,籠具下層設(shè)置托盤用于收納猴排泄物及廢棄物?；\具及托盤后方連接排水口,排水口近端放置一次性金屬濾籃,用于收集可能導(dǎo)致堵塞的大顆粒排泄物。恒河猴每日早晚各喂食1次,并采用沖洗裝置每日沖洗籠具。

圖1 恒河猴籠具Figure1 Cage of rhesus monkeys

1.3.2 ABSL3實(shí)驗(yàn)室恒河猴飼養(yǎng)及清潔SOP及未遵循SOP的操作方法比較

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489—2008)的規(guī)定,同時結(jié)合本ABSL3實(shí)驗(yàn)室猴籠裝置具體情況,制定了符合要求的ABSL3實(shí)驗(yàn)室恒河猴飼養(yǎng)及清潔SOP。

(1)猴籠地面鋪置吸水墊:每日于猴籠地面鋪置吸水墊,長度環(huán)繞猴籠1周,寬度約40cm,以防止飼料或排泄物直接掉落于地面上。

(2)排泄物處置:如地面吸水墊上掉落實(shí)驗(yàn)猴排泄物,取吸水紙覆蓋于排泄物上,在吸水紙上傾倒足量84消毒液原液,靜置10min后,將吸水墊卷曲包裹吸水紙,棄至廢棄物收集桶,并鋪置新的吸水墊。

(3)采用ABSL-3實(shí)驗(yàn)室沖洗裝置每日清水沖洗猴籠1次,水量調(diào)至中檔,輕柔沖洗,以所有排泄物全部沖凈至排水口濾籃處為準(zhǔn)。

(4)排水口濾籃內(nèi)截留了沖洗的固體排泄物,傾倒足量84消毒液原液于排泄物上,靜置10min后,輕取濾籃置于垃圾袋中,棄至廢棄物收集桶。

為驗(yàn)證嚴(yán)格執(zhí)行SOP對ABSL3實(shí)驗(yàn)室恒河猴飼養(yǎng)的微生物風(fēng)險控制效果,特與未遵循SOP的操作方法進(jìn)行列表對比,見表1。

表1 嚴(yán)格執(zhí)行SOP與未遵循SOP的操作方法比較Table1 Comparison of operation methods between strictly following the SOP and not following the SOP

1.3.3 采樣方案設(shè)計

共4個采集狀態(tài)(見表2)。第1個采集狀態(tài)為靜止?fàn)顟B(tài)下采樣;第2個為動態(tài)(飼養(yǎng))狀態(tài)下采樣;第3個和第4個狀態(tài)均在使用芽孢桿菌為指示微生物的狀態(tài)下,將芽孢桿菌107spores/mL分別滴至猴籠地面排泄物及沖水時排水口濾籃內(nèi)的排泄物,其中采樣狀態(tài)3為未嚴(yán)格按照飼養(yǎng)及清潔標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行的狀態(tài);采樣狀態(tài)4為嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程處理后采樣。

表2 采樣狀態(tài)表Table2 Sampling time and state

每個采集狀態(tài)的采樣均于不同時間點(diǎn)重復(fù)3次,最后取平均值進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.4 采樣方法

采用賽多利斯Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀采集環(huán)境中的浮游菌(見圖2),使用方法詳見說明書,每次采集1000L。分別內(nèi)置細(xì)菌培養(yǎng)皿、酵母培養(yǎng)皿和膜收集皿。其中,采集后細(xì)菌培養(yǎng)皿置30℃～35℃培養(yǎng)3～5d,酵母培養(yǎng)皿置20℃～25℃培養(yǎng)3～5d,后進(jìn)行菌落計數(shù);膜收集皿則在采樣完成后,將膜取出,用30mL PBS溶解,4℃過夜,后2000 r/min離心棄沉淀,上清采用50000分子量超速離心管3000r/min離心濃縮至終體積1mL。

圖2 賽多利斯Airport MD8便攜式浮游菌采樣儀Figure2 Sartorius portable plankton sampler(Airport MD8)

1.3.5 氣溶膠活細(xì)胞檢測

取濃縮的濾膜溶液,采用細(xì)胞周期試劑盒染色,具體操作參照說明書進(jìn)行:100μL濃縮濾膜液,加 入1mL DNA staining solution,及10μL permeabization solution,混勻,室溫孵育30min后,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.3.6 浮游菌PCR檢測

采用細(xì)菌組DNA提取試劑盒提取濃縮濾膜液的細(xì)菌DNA,引物序列(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,338R:5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’),使用ExTaq(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件,對數(shù)據(jù)計算均值,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 靜止?fàn)顟B(tài)下的氣溶膠檢測

在靜止?fàn)顟B(tài)下,分別對動物室門入口處及猴籠地面進(jìn)行浮游菌采集,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示在未進(jìn)行飼養(yǎng)活動的狀態(tài)下,動物室門入口及猴籠地面的活性顆粒物均較少,其中,門入口處略高;重復(fù)培養(yǎng)結(jié)果顯示,靜止?fàn)顟B(tài)下有＜5個細(xì)菌生長,但無酵母生長;同時在入口及地面的細(xì)菌DNA檢測也驗(yàn)證了上述結(jié)果。(見圖3)

圖3 ABSL-3實(shí)驗(yàn)室靜止?fàn)顟B(tài)下猴籠地面及動物室門入口處微生物檢測分析Figure3 Detection and analysis of microorganism in ABSL-3laboratory raised in the floor of the monkey cage and at the entrance of the animal chamber under the stationary state

2.2 常規(guī)活動狀態(tài)下的氣溶膠檢測

對飼養(yǎng)時猴籠地面進(jìn)行浮游菌采集,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示活性顆粒較靜止?fàn)顟B(tài)略有升高,同時細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)達(dá)約30個/皿,酵母生長數(shù)均為1個/皿。而在沖洗猴籠時,排水口濾籃處的浮游菌活性顆粒明顯增加,同時,細(xì)菌計數(shù)＞300個/皿,伴有＞10個/皿酵母生長。(見圖4)

圖4 ABSL-3實(shí)驗(yàn)室活動狀態(tài)下猴籠地面飼養(yǎng)廢棄物及沖洗時排水口濾籃處廢棄物微生物檢測分析Figure4 Microbial detection and analysis of the waste in ABSL-3laboratory raised on the ground of the monkey cage under the active condition and the waste at the filter basket of the drainage outlet during water flushing

2.3 采用芽孢桿菌指示菌后未按照或嚴(yán)格按照SOP操作的氣溶膠檢測

在人工將107spores/mL的芽孢桿菌分別滴至猴籠地面上的排泄物及沖洗時排水口濾籃內(nèi)的排泄物時,首先對未按照SOP進(jìn)行消毒處理的猴籠地面排泄物及沖洗時排水口濾籃內(nèi)的排泄物進(jìn)行浮游菌采集,流式細(xì)胞儀結(jié)果表明氣溶膠顆粒明顯上升,同時細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌核酸檢測均有大量細(xì)菌生長,并伴隨酵母生長。而當(dāng)我們嚴(yán)格按照飼養(yǎng)及清潔SOP程序?qū)锘\地面排泄物及沖洗時排水口濾籃內(nèi)的排泄物進(jìn)行處理后,結(jié)果顯示氣溶膠顆粒大大降低,同時細(xì)菌及酵母生長明顯減少,且在飼養(yǎng)過程中的猴籠地面排泄物中沒有檢測到細(xì)菌DNA。(見圖5)

圖5 ABSL-3實(shí)驗(yàn)室活動狀態(tài)下未按照SOP和嚴(yán)格執(zhí)行SOP猴籠地面飼養(yǎng)廢棄物及沖洗時排水口濾籃處廢棄物微生物檢測分析Figure5 Microbial detection and analysis of waste in ABSL-3laboratory raised on the ground of the monkey cage and at the filter basket of the drain outlet during flushing under the active state without following SOP or strictly following SOP

3 討論

高致病性微生物所致的烈性傳染病給人類的健康和生活帶來了極大的危害,研究預(yù)防和治療這些疾病的疫苗、藥物是戰(zhàn)勝疾病的重要手段,因而開展相應(yīng)的動物實(shí)驗(yàn)就顯得尤為重要了。其中,恒河猴因其與人緣關(guān)系較近,作為眾多高致病性微生物最適宜的易感動物,成為了ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中重要的實(shí)驗(yàn)動物模型之一。在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的恒河猴實(shí)驗(yàn)中,存在著較多的生物安全隱患[12],除動物逃逸、抓咬、注射以及樣本采集和解剖等諸如此類因?qū)嶒?yàn)操作可能帶來的生物安全風(fēng)險外,最容易被忽略卻又易可能導(dǎo)致較高風(fēng)險的莫過于常規(guī)飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的排泄物通過氣溶膠的方式而對人或環(huán)境所造成的高致病性微生物傳播,因而對ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中恒河猴動物排泄物的清潔處理能否真正起到消除病原微生物傳播風(fēng)險的評估就具有更加突出的意義了。

通過對靜止?fàn)顟B(tài)下ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中恒河猴動物實(shí)驗(yàn)室的浮游菌采集檢測結(jié)果分析可見,在無活動操作的情況下,無論是門入口處,還是猴籠地面,浮游菌檢測均在可控范圍之內(nèi),這個結(jié)果充分說明了整個實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的負(fù)壓狀態(tài)可以保證將污染物有效控制在猴籠屏障設(shè)施內(nèi)。而在活動狀態(tài)下,也就是飼養(yǎng)狀態(tài)時,隨著恒河猴排泄物的出現(xiàn),猴籠地面浮游菌檢測呈現(xiàn)陽性,尤其是在進(jìn)行猴籠清潔沖洗時,排水口濾籃處的浮游菌數(shù)量大幅度增加,并伴隨酵母生長,這也充分說明了恒河猴飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的浮游菌及氣溶膠確實(shí)為動物實(shí)驗(yàn)中一個非常重要的生物安全風(fēng)險點(diǎn),因而如何處理恒河猴排泄物以及這個處理是否行之有效就成為了恒河猴飼養(yǎng)及清潔操作規(guī)程的重要評價指標(biāo)了。

因而,我們進(jìn)行了重復(fù)對比試驗(yàn)來驗(yàn)證嚴(yán)格遵循執(zhí)行恒河猴飼養(yǎng)及清潔操作規(guī)程是否能夠真正有效控制通過排泄物導(dǎo)致的病原傳播風(fēng)險。對比試驗(yàn)結(jié)果顯示,嚴(yán)格按照SOP操作較未遵循SOP而言,氣溶膠顆粒大幅度降低,細(xì)菌及酵母生長明顯減少,且在吸水墊上未檢測到細(xì)菌DNA,這個結(jié)果充分說明:首先,猴籠地面吸水墊的鋪置可以將排泄物控制在一個較小的區(qū)域范圍內(nèi),因而可以有效降低氣溶膠的產(chǎn)生;其次,足量84消毒液原液的處理也是降低病原微生物氣溶膠的有效手段。

氣溶膠微粒為直接大約0.05～500mm的極小分子分泌物,作為極分散的小微粒,它可攜帶病原微生物通過吸入的方式傳播給人和環(huán)境。正因?yàn)槿绱?ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可能存在的氣溶膠傳播引起了越來越多的關(guān)注[13],越來越多的研究者們認(rèn)為氣溶膠的傳播已經(jīng)成為人類病原微生物傳播方式的頭號殺手,并致力于ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)氣溶膠感染動物模型的研究[14-15]。本研究將關(guān)注點(diǎn)置于ABSL-3實(shí)驗(yàn)室恒河猴飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的排泄物可能導(dǎo)致的氣溶膠污染,提出了ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中恒河猴飼養(yǎng)及清潔的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,并通過指示微生物的采樣對比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程在控制實(shí)驗(yàn)動物排泄物傳播風(fēng)險點(diǎn)的有效性。