溫翔宇,張軍宏,朱存良

(1.甘肅省定西市人民醫(yī)院麻醉科,甘肅 定西 743000;2.甘肅省定西市人民醫(yī)院泌尿外科,甘肅 定西 743000;3.湖南省婁底市中心醫(yī)院,湖南 婁底 417000)

小膠質(zhì)(microglia cells,MG)細胞可調(diào)節(jié)大腦發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復,被稱為大腦巨噬細胞[1]。MG也是神經(jīng)炎癥反應關鍵介質(zhì),缺血、缺氧或炎癥刺激狀態(tài)下激活MG,可清除壞死組織并發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但MG過度活化及死亡會釋放大量炎性介質(zhì),并導致神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆損傷[2-3]。探究MG活化及其活化后炎癥反應機制,對神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療具有一定臨床意義。近來研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關因子2(transcription factor NF-E2 related factor2,NRF2)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1)通路可參與機體抗氧化應激反應,并能通過抑制下游炎癥通路高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路表達來發(fā)揮抗炎反應,進而參與多種疾病生理過程[4-5]。但NRF2/HO-1/HMGB1通路參與MG炎癥反應過程的研究較少。目前臨床常用麻醉劑-七氟醚能夠促進MG活化,并抑制炎癥反應來緩解創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦損傷進程[6],但有研究顯示七氟醚能夠誘導MG活化并促進其炎癥反應[7]。因此對七氟醚的作用仍存在爭議。本研究體外培養(yǎng)MG,并給予缺氧及七氟醚處理,以期驗證七氟醚對MG活化及炎癥反應的調(diào)控作用,并從NRF2/HO-1/HMGB1通路闡明其調(diào)控炎癥反應的分子生物學機制,為神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞

BV-2小鼠MG細胞(貨號:YCL-0493,武漢益普生物科技有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(批號:H20040772,美國Abbott公司);NRF2、HO-1、HMGB1、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)等抗體(貨號:ab156883、ab189491、ab32536、ab79523、ab239882、ab234437,美國abcam)。麻醉氣體監(jiān)測儀(型號:Capnomac Datex AS/3,芬蘭Datex.Ohmeda公司);光學顯微鏡(型號:SMZ745,日本尼康公司);化學發(fā)光儀(型號:GIS-500,杭州米歐儀器公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞復蘇與培養(yǎng)

取BV-2小鼠MG細胞進行常規(guī)復蘇后,置于5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每2d更換1次培養(yǎng)基,5d后傳代進行后續(xù)試驗。

1.3.2 細胞分組與處理

取細胞制備成每升5×108個的細胞懸液接種至96孔板上,每孔100μL,用無血清培養(yǎng)基孵育6～12h,貼壁同步化后換用含血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并進行如下分組處理:(1)置于缺氧培養(yǎng)箱(37℃、95% N2、5% CO2混合氣體)中進行培養(yǎng),并設置缺氧不同時間(0、2、4、6、8、12h)組,各組均在缺氧條件下處理后,置于倒置顯微鏡下觀察細胞活化形態(tài),并檢測細胞活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達水平,選出最佳缺氧時間8h;(2)設置七氟醚不同濃度(0、2%、4%、6%)組,并置于兩側(cè)各有一小孔的密閉容器中,一側(cè)小孔接麻醉機,輸入氧氣(2mL/min)和七氟醚,另一側(cè)小孔端接麻醉氣體監(jiān)測儀測定七氟醚濃度達0、2%、4%、6%后,維持30min后,置于缺氧培養(yǎng)箱中缺氧8h,檢測細胞活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達水平;(3)設置正常對照組、缺氧誘導組、6%七氟醚組、SnPP組[NRF2/HO-1通路抑制劑-錫原卟啉(Sn-protoporphyrin,SnPP)]、6%七氟醚+SnPP組;除正常對照組外,其余各組均置于缺氧條件下培養(yǎng)8 h;6%七氟醚組在缺氧前給予6%七氟醚處理30 min;SnPP組在缺氧處理前參照文獻[8]向培養(yǎng)基中加入終濃度為5μmol/L的SnPP;6%七氟醚+SnPP組加入SnPP并進行6%七氟醚處理30min后進行缺氧誘導。檢測細胞活化比例及相關蛋白表達水平。

1.3.3 活化細胞比例檢測

收集1.3.2項下各組細胞,置倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。每組取3個不同視野計數(shù),重復3次。MG活化細胞比例=(多極型細胞數(shù)量+紡錘樣雙極細胞數(shù)量)/總細胞數(shù)量×100%。

1.3.4 Western blot法檢測細胞蛋白表達

收集1.3.2項下的各組細胞,加入細胞裂解液抽提總蛋白后,采用二喹啉甲酸法檢測總蛋白濃度;將變性后的蛋白樣品行電泳及轉(zhuǎn)膜反應后;脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯膜2h后,加入一抗(NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65抗體,稀釋倍數(shù)為1∶1000,內(nèi)參抗體為GAPDH,稀釋倍數(shù)為1∶2000),在4℃下孵育過夜;次日,加入稀釋5000倍的二抗于室溫下孵育1h。顯影曝光后,化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS24.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組比較行t檢驗;多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧不同時間對細胞形態(tài)、活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β表達的影響

缺氧0h時MG呈圓形或者橢圓形,隨缺氧時間延長,MG體積增大,出現(xiàn)多極或兩極延長,分支樣或紡錘樣改變的細胞逐漸增多。與缺氧0h相比,缺氧2、4、6、8、12h活化細胞比例、HMGB1、IL-1β蛋白表達增多(P＜0.05);NRF2、HO-1蛋白表達在缺氧2h時迅速升高,4h時迅速下降,并在8～12 h時下降至最低水平(P＜0.05)。缺氧8h后活化細胞比例最多,8h與12h相比,上述指標變化差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見圖1～3。

圖1 不同缺氧時間下MG形態(tài)變化圖Figure1 Morphological changes of MG under different hypoxia time

圖2 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達免疫印跡圖

圖3 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β表達及活化細胞比例比較Figure3 Comparison of expression levels of NRF2,HO-1,HMGB1,IL-1β and activated cell proportion in each group

2.2 七氟醚不同濃度處理對MG活化比例及NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達的影響

七氟醚濃度為0時,MG體積增大,細胞分支樣或紡錘樣改變的細胞較多。與0七氟醚處理組相比,2%、4%、6%七氟醚處理組活化細胞比例、HMGB1、IL-1β蛋白表達減少(P＜0.05),NRF2、HO-1蛋白表達升高(P＜0.05),且呈劑量依賴性,見圖4～7。

圖4 各組MG形態(tài)變化圖Figure4 Morphological changes of MG in each group

圖5 各組MG活化細胞比例比較(±s,n=6)Figure5 Comparison of MG activated cell proportion in each group

圖6 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達免疫印跡圖Figure6 Western blot of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β expression in each group

圖7 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達比較(±s,n=6)Figure7 Comparison of protein expression of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β in each group

2.3 6%七氟醚與SnPP聯(lián)合應用后對MG活化、NRF2、HO-1、HMGB1及相關蛋白表達的影響

與正常對照組比較,缺氧誘導組活化細胞比例、HMGB1、IL-1β、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達升高,NRF2、HO-1蛋白表達降低(P＜0.05)。6%七氟醚組上述指標變化與缺氧誘導組相反(P＜0.05);SnPP組上述指標變化與缺氧誘導組一致且比缺氧誘導組變化更明顯(P＜0.05)。6%七氟醚+SnPP組上述指標變化與6%七氟醚組相反(P＜0.05),見圖8～11。

圖8 各組MG形態(tài)變化圖Figure8 Morphological changes of MG

圖9 各組MG活化細胞比例比較(±s,n=6)Figure9 Comparison of the proportion of MG activated cells in each group

圖10 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達免疫印跡圖Figure10 Western blot of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β expression in each group

圖11 各組細胞NRF2、HO-1、HMGB1、IL-1β蛋白表達比較(±s,n=6)Figure11 Comparison of relative protein expression levels of NRF2,HO-1,HMGB1and IL-1β in each group

3 討論

MG過度活化介導的炎癥反應,是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[9]。缺血缺氧、炎癥、感染等病理刺激均可激活MG,使MG由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)而表現(xiàn)出促炎功能[10]。本研究于37℃、5% CO2條件下模擬MG缺氧條件,發(fā)現(xiàn)缺氧(0、2、4、6、8、12h)條件下,MG出現(xiàn)分枝樣或紡錘樣改變,且MG活化細胞比例及促炎因子IL-1β釋放在缺氧(2、4、6、8h)內(nèi)隨著缺氧時間的延長而升高,并在8～12h內(nèi)稍有下降,與參考文獻[11]MG活化狀態(tài)下的形態(tài)改變及參考文獻[12]缺氧條件IL-1β的水平變化一致,表明缺氧8h可穩(wěn)定建立MG過度活化及炎癥反應模型。近來研究發(fā)現(xiàn),NRF2/HO-1/HMGB1通路是參與機體氧化及炎癥反應的經(jīng)典通路之一,Yu等[13]發(fā)現(xiàn)敲除NRF2基因后,NRF2下游靶基因HO-1介導的抗氧化反應減弱,NRF2調(diào)控的炎癥復合體-NOD樣受體蛋白3(NLRP3)激活,促進HMGB1/NF-κB調(diào)控的炎癥通路活化,從而加重膿毒癥小鼠肺組織炎癥損傷進程。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中核因子NRF2的核易位可誘導HO-1表達,而用HO-1抑制劑SnPP能逆轉(zhuǎn)NRF2/HO-1途徑的激活,使脂多糖誘導的巨噬細胞中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移增多,促進巨噬細胞釋放大量的促炎介質(zhì)HMGB1、IL-1β等而加重炎癥反應,提示NRF2/HO-1/HMGB1途徑可能是炎癥反應的重要途徑之一。但MG過度活化介導的炎癥反應過程中是否有NRF2/HO-1/HMGB1途徑的參與,還不甚明確。本研究結果顯示,隨著缺氧時間的延長,NRF2、HO-1蛋白表達持續(xù)降低,而促炎介質(zhì)HMGB1的釋放也逐漸升高,且NRF2、HO-1及HMGB1水平均于缺氧8h時處于穩(wěn)定狀態(tài),表明NRF2/HO-1/HMGB1途徑參與缺氧誘導的MG活化及炎癥反應過程。

近年來MG介導的慢性神經(jīng)炎癥反應越來越受到臨床及患者的重視[14]。尋找特異性抑制MG過度活化及炎癥反應的藥物,來緩解和治療神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病,也是廣大學者研究的重要任務[15]。七氟醚為臨床常用麻醉藥,能夠通過抑制炎癥反應及氧化應激損傷緩解腦、腎、肺等多個臟器的缺血灌注損傷[16],且張國棟等[6]及趙丹等[17]研究發(fā)現(xiàn)七氟醚能通過抑制腦缺血再灌注誘發(fā)的MG活化,來抑制大鼠腦組織炎癥及氧化應激損傷而保護腦神經(jīng),提示七氟醚可能是抑制MG活化的有效藥物之一。但陳穎等[7]及趙敏等[18]離體培養(yǎng)MG后研究結果顯示七氟醚能誘導MG活化并促進炎癥反應及Dang等[19]在體研究顯示七氟醚能促進MG活化,與張國棟等[6]及趙丹等[17]七氟醚研究機制相反。七氟醚是促進還是抑制MG活化及炎癥反應的機制仍存在爭議。

本研究用缺氧處理8h模擬MG活化及炎癥反應狀態(tài)后,用七氟醚不同濃度(2%、4%、6%)進行干預發(fā)現(xiàn),隨七氟醚濃度升高,MG分枝樣或紡錘樣等活化狀態(tài)改變明顯減輕,MG活化細胞比例及IL-1β釋放也呈劑量依賴性降低且均顯著低于0七氟醚處理組,提示七氟醚能夠抑制缺氧條件下MG活化及炎癥反應,這與Yu等[20]七氟醚抑制脂多糖誘導的MG活化發(fā)揮抗炎反應機制一致,推測可能七氟醚處理濃度及干預時間不同,對MG的影響也不同所致。本研究還發(fā)現(xiàn),隨七氟醚濃度升高,細胞中NRF2、HO-1蛋白表達逐漸升高,HMGB1表達逐漸降低,預示七氟醚抑制缺氧誘導的MG活化及炎癥反應作用,可能是通過促進NRF2/HO-1活化,抑制HMGB1表達來實現(xiàn)的。為證明這一結論,本研究用SnPP抑制NRF2/HO-1通路后,發(fā)現(xiàn)SnPP組隨著NRF2及HO-1蛋白表達的降低,HMGB1促炎介質(zhì)表達顯著升高及NF-κB炎癥途徑活化的同時,MG活化細胞比例及IL-1β釋放也進一步高于缺氧誘導組,提示抑制NRF2/HO-1活化,可促進HMGB1/NFκB介導的炎癥因子釋放,進而促進MG活化及炎癥反應。進一步分析發(fā)現(xiàn),七氟醚對MG活化及炎癥反應進程的抑制作用可被SnPP逆轉(zhuǎn),表明七氟醚的上述作用與促進NRF2/HO-1途徑活化,抑制HMGB1/NF-κB炎癥途徑活化有關。

綜上所述,七氟醚可通過促進NRF2/HO-1途徑活化,抑制HMGB1/NF-κB炎癥途徑活化,減輕缺氧誘導的MG活化及炎癥反應進程,為闡明MG活化及炎癥反應的可能機制提供一定理論依據(jù)。但本研究還存在一定的不足,MG活化及炎癥反應的分子機制復雜,NRF2/HO-1/HMGB1可能只是其中的一條調(diào)控機制,對于其他可能的分子機制還有待進一步驗證。