李艷艷,楊鳳梅,王俊斌,陳麗雄,靳瑋華,和占龍,楊 飛,趙 遠(yuǎn)?

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650118;2.昆明市第三人民醫(yī)院胸外科,昆明 650041)

目前,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致人類死亡的最常見的病因之一,是嚴(yán)重威脅健康的頭號(hào)殺手[1]。動(dòng)物模型作為研究心血管疾病的常用方法,對(duì)于揭示發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)干預(yù)效果極為重要。在心肌損傷動(dòng)物模型的非臨床研究中,常見以大鼠、小鼠、兔、犬、小型豬等為報(bào)道多見[2]。但非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物心肌損傷模型的研究報(bào)道極其少見。由于恒河猴(Macaca mulatta)在許多生理方面與人類非常相似,因此被認(rèn)為是研究人類生理和發(fā)病機(jī)理的最有價(jià)值的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型[3]。對(duì)于心血管疾病,特別是心臟病的研究,恒河猴是人類的重要替代品。恒河猴的心臟結(jié)構(gòu)與人類非常相似,冠狀動(dòng)脈的分布與人類相似[4]。因此,恒河猴心肌損傷模型將為人類心臟疾病研究提供更好的替代方法。然而,恒河猴心肌損傷模型的一些詳細(xì)特征以及與人類心肌疾病的比較數(shù)據(jù)并無報(bào)道。

異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)是一種構(gòu)建心臟疾病動(dòng)物模型的常用藥物,通過加快心率、增強(qiáng)心肌耗氧量等引發(fā)心肌損傷,可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)許多與人類心臟病相似的代謝和形態(tài)學(xué)異常表現(xiàn),如心肌損傷壞死、纖維化及心室重構(gòu),心臟功能下降。ISO可用于藥物性心肌損傷、缺血性心肌損傷、2型心肌梗死等疾病的模擬研究[5-7]。目前皮下注射ISO誘導(dǎo)建立心肌損傷動(dòng)物模型相關(guān)的研究較多,但使用的注射劑量差別很大,且未見用于恒河猴誘導(dǎo)心肌損傷模型的相關(guān)報(bào)道。本研究的目的是在恒河猴皮下注射ISO誘導(dǎo)建立心肌損傷動(dòng)物模型,為人類心臟疾病致病機(jī)理、藥物評(píng)價(jià)等提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康恒河猴11只,普通級(jí),雄性,7～9歲,體重8～12kg,來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SCXK(滇)K2020-0005],動(dòng)物飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SYXK(滇)K2020-0008]。實(shí)驗(yàn)操作及飼養(yǎng)在本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(DWSP201810002)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循3R原則和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理要求。

1.2 主要試劑與儀器

ISO(大連美侖生物技術(shù)有限公司,MB5204-5 g);注射用生理鹽水(昆明南疆制藥有限公司,A19122606A);AST(批號(hào)140219005)、ALT(批號(hào)140120001)、LDH(批 號(hào)142719006)、CK(批 號(hào)142519011)、CK-MB(批號(hào)142619006)等生化試劑(深圳邁瑞生物);溶血?jiǎng)?批號(hào)R9538)、稀釋液(批號(hào)G0082)等血常規(guī)試劑(Sysmex);復(fù)方氯胺酮注射液(江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司,20200102)。

Apogee5300彩色多普勒超聲診斷儀(汕頭市超聲儀器研究所有限公司,中國(guó));BS-200全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,中國(guó));IE12數(shù)字式心電圖機(jī)(深圳邦健生物醫(yī)療設(shè)備股份有限公司,中國(guó));Microfuge20R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo);XT-2000i全自動(dòng)五分類動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀(Sysmex)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

實(shí)驗(yàn)恒河猴分為3組:高劑量組(H組,n=4),低劑量組(L組,n=4),對(duì)照組(C組,n=3)。模型組動(dòng)物大腿外側(cè)皮下注射ISO,H組每次注射ISO1 mL(4.6mg/kg),每天2次;L組每次注射ISO1mL(3.2mg/kg),每天2次;C組注射生理鹽水1mL,每天1次。連續(xù)注射5周。

1.3.2 臨床觀察

注射ISO后每天觀察記錄動(dòng)物飲食,精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛色、糞便、死亡等情況。

1.3.3 心臟彩超檢查

分別于注射后第1、3、5、7天及第2、3、4、5周對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行彩色多普勒超聲影像檢查,將探頭放置在胸骨左緣心臟區(qū)域,M型超聲束經(jīng)過二尖瓣腱索,與室間隔、左室后壁保持垂直,頻率為2.5MHz。分別測(cè)量左室舒張末期的室間隔厚度(IVSTd)、左室內(nèi)徑(LVEDD)、左室后壁厚度(LVPWTd),收縮末期的室間隔厚度(IVSTs)、左室內(nèi)徑(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWTs)、及左心室短軸縮短率(FS,%)、射血分?jǐn)?shù)(EF,%)、左心室質(zhì)量(LVM,g)等心功能指標(biāo)。

1.3.4 血液生化學(xué)檢測(cè)

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對(duì)所有動(dòng)物采集全血,分離血清,進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amiotransferase,ALT)、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酸肌酶(creatine kinase,CK)、肌酸肌酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)等指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.5 血常規(guī)檢測(cè)

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對(duì)所有動(dòng)物采集全血,進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),計(jì)算血小板/淋巴細(xì)胞比值(PLR)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(NLR)。

1.3.6 心電圖檢測(cè)

分別于注射后第1、3、5、7天及第2～5周對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行心電圖檢查,記錄心電圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析進(jìn)行組間比較,P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果

恒河猴注射異丙腎上腺素后,飲水增加,呼吸頻率加快,前期活動(dòng)減少,后期恢復(fù)正常;精神狀態(tài)未發(fā)生明顯改變,毛色、糞便正常,無死亡等情況。

2.2 心臟彩超結(jié)果

心臟超聲可以清晰顯示恒河猴心臟結(jié)構(gòu)。由心臟彩超可見,給藥前心臟收縮節(jié)律正常,收縮有力,給藥后逐漸出現(xiàn)左室后壁收縮無力、活動(dòng)減弱(如圖1A～1C);高、低劑量組左室內(nèi)徑在給藥后的前1周出現(xiàn)增大的變化趨勢(shì)。室間隔厚度增寬;高劑量組左室后壁厚度在給藥3d后出現(xiàn)明顯的增寬。左心功能指標(biāo)EF和FS降低。見圖2A～2I。

圖1 心臟彩超結(jié)果Figure1 Results of echocardiography

圖2 ISO對(duì)恒河猴左心室壁厚度及左心功能的影響Figure2 Effect of ISO on left ventricular wall thickness and left ventricular function in rhesus monkeys

2.3 血液生化學(xué)結(jié)果

對(duì)給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血清AST、ALT、LDH、CK、CK-MB檢測(cè)發(fā)現(xiàn),H組AST、ALT、LDH、CK在第1天出現(xiàn)升高,第3天達(dá)到最高值,CK-MB在第1天即出現(xiàn)最高值,而后逐漸下降恢復(fù)至給藥前水平;H組AST在第3天顯著高于C組;H組ALT在第1天、第3天顯著高于L組;H組LDH在第1、3、5天顯著高于C組,第3、7天顯著高于L組,L組LDH在第5周顯著高于C組(P＜0.05)。見圖3A～3E。

圖3 ISO對(duì)恒河猴血液生化指標(biāo)的影響Figure3 Effect of ISO on blood biochemical indexes of rhesus monkeys

2.4 血液常規(guī)結(jié)果

計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的血小板/淋巴細(xì)胞比值(PLR)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(NLR)得出,H組在給藥第1天PLR、NLR即出現(xiàn)明顯升高,PLR在第5天出現(xiàn)最高值,NLR在第1天出現(xiàn)最高值;L組PLR、NLR變化趨勢(shì)不明顯。見圖4A、4B。

圖4 ISO對(duì)恒河猴血液生理指標(biāo)的影響Figure4 Effect of ISO on the blood physiological indexes of rhesus monkeys

2.5 心電圖結(jié)果

實(shí)驗(yàn)前為正常心電圖,給藥后至第5周,持續(xù)出現(xiàn)T波、ST段不同程度改變,主要表現(xiàn):ST段改變(II,III,avF,V4-V6導(dǎo)聯(lián)輕度下移),T波改變(I,avL,V1-V6導(dǎo)聯(lián)平坦,倒置,負(fù)正雙向)等,見圖5。

圖5 ISO對(duì)恒河猴心電圖的影響Figure5 Effect of ISO on the electrocardiogram of rhesus monkeys

3 討論

ISO是非選擇性β-腎上腺素受體激動(dòng)劑,研究者普遍認(rèn)可其具有誘發(fā)心室重構(gòu)的作用,并得到廣泛應(yīng)用。炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、自噬和凋亡等機(jī)制的相互聯(lián)系、影響,直接和間接造成ISO性心肌損傷。ISO常用于建立病理性心肌損傷、心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8]。此法操作簡(jiǎn)單、模型穩(wěn)定、成本低,已成為大鼠心肌肥大動(dòng)物模型建立的常用方案之一[9]。目前,有關(guān)恒河猴心肌損傷模型建立的報(bào)道較少。為探討不同劑量對(duì)恒河猴心肌損傷模型構(gòu)建的影響,本研究通過采用皮下注射高、低劑量的ISO誘導(dǎo)建立恒河猴心肌損傷模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種劑量ISO處理后,恒河猴心臟均出現(xiàn)不同程度的損傷,但高劑量組各種指標(biāo)變化更為明顯。高劑量組在處理后的1周內(nèi)出現(xiàn)心肌收縮活動(dòng)減弱及心電圖異常情況。另外,高、低劑量組恒河猴心臟IVSTd、IVSTs、LVEDD、LVESD、LVPWTd、LVPWTs表現(xiàn)為不同程度的增加,心功能指標(biāo)EF、FS降低,高劑量組LVM在處理2周后出現(xiàn)明顯增加。

AST主要存在于心肌中,機(jī)體健康狀態(tài)下,血清中AST水平較低。細(xì)胞損傷時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,AST從胞漿內(nèi)釋放入血液。同時(shí),炎癥因子釋放,心肌損傷進(jìn)一步加劇[10]。ISO通過影響Ca2+通道,導(dǎo)致心肌收縮變強(qiáng),需氧量增加,進(jìn)而引起DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)等細(xì)胞組分氧化,直接損傷心肌[8]。血清心肌酶CK-MB、LDH的水平可反映心肌損傷情況[11]。CK同工酶的CK-MB,主要存在于心肌細(xì)胞質(zhì)中,能催化能量轉(zhuǎn)化,為肌肉收縮提供直接的能量來源[12-13]。當(dāng)ISO致使脂質(zhì)膜破壞,大量CK-MB釋放進(jìn)入血液,而血清中CK-MB含量與心肌損傷程度正相關(guān),能敏感反映心肌損傷的程度[14]。LDH廣泛分布在各種組織的細(xì)胞質(zhì)中,以心、腎、骨骼肌最為豐富。當(dāng)少量心肌細(xì)胞膜發(fā)生破壞,或心肌組織損傷、壞死時(shí),血清中LDH活性即可升高[15]。本研究中,高劑量組AST、CK-MB、LDH等指標(biāo)均在處理后1～5d內(nèi)出現(xiàn)明顯增加,較低劑量組更早出現(xiàn)變化。該變化規(guī)律反映出高劑量組能更好的誘導(dǎo)恒河猴出現(xiàn)心肌損傷樣的血液學(xué)指標(biāo)變化。

近年,NLR與各種心血管疾病的臨床結(jié)局相關(guān)性已得到證實(shí)。其作為一種全身性炎性標(biāo)志物即可直觀反映炎癥情況,又能反映免疫水平,更穩(wěn)定地反映機(jī)體的炎癥狀態(tài)。中性粒細(xì)胞釋放氧自由基,激活產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),使血小板聚集率增加,導(dǎo)致血液持續(xù)高凝狀態(tài)[16],增加心肌損傷面積。同時(shí),作為心肌細(xì)胞損傷的主要途徑,參與缺氧損傷、蛋白水解酶和其他炎癥過程[17-18]。國(guó)外一項(xiàng)研究報(bào)告,PLR是綜合血液凝聚與炎癥通路于一體的炎癥指標(biāo),是多種疾病狀態(tài)下出現(xiàn)不良心血管事件的危險(xiǎn)因素[19]。另有文獻(xiàn)報(bào)道,心肌損傷患者的PLR值顯著高于無心肌損傷患者[20]。本研究中,H組在給藥第1天PLR、NLR即出現(xiàn)明顯升高,PLR在第5天出現(xiàn)最高值,NLR在第1天出現(xiàn)最高值;L組PLR、NLR變化趨勢(shì)不明顯。PLR、NLR與CK-MB、LDH等指標(biāo)變化規(guī)律一致,推測(cè)高劑量組較低劑量組出現(xiàn)更為嚴(yán)重的心肌損傷。

心電圖是應(yīng)用心電圖機(jī)在體表記錄心臟每個(gè)心動(dòng)周期產(chǎn)生的電活動(dòng)變化圖形的技術(shù),是臨床上篩查和診斷心律失常和心血管疾病的最常用的檢查技術(shù)之一,具有非侵入性、較強(qiáng)抗干擾能力、記錄清晰、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)點(diǎn)。心電圖結(jié)果顯示,給藥后至第5周,持續(xù)出現(xiàn)T波、ST段不同程度的改變,給藥初期(1～5d),ST段壓低,這與心肌缺血和心肌損傷有關(guān),1周后出現(xiàn)ST段抬高,T波倒置,I、avL、V1-V6導(dǎo)聯(lián)、倒置,呈負(fù)正雙向(見圖5)。從心電圖特征性表現(xiàn)可以初步判斷為心肌損傷。

本文對(duì)不同劑量ISO誘導(dǎo)恒河猴心肌損傷模型進(jìn)行初步探討,通過觀察恒河猴心臟彩超、心電圖的變化、以及AST、ALT及炎癥因子LDH、CK、CKMB、PLR、NLR等指標(biāo)水平的變化,高劑量的ISO可成功誘導(dǎo)恒河猴心肌損傷;心臟超聲、心電圖及血液學(xué)的指標(biāo)可作為恒河猴無創(chuàng)心臟損傷模型綜合評(píng)價(jià)的依據(jù)。