楊奇濤,吳殷囡,汪玉馨,孟長虹,宗衛(wèi)峰,陸益紅,史清水?

(1.中國藥科大學,南京 211198;2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,南京 210019;3.徐州醫(yī)科大學藥物分析教研室,江蘇 徐州 221004)

類過敏反應的臨床表現(xiàn)有皮疹、瘙癢、蕁麻疹、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、胸悶、呼吸困難、血壓下降以及過敏性休克等,與I型過敏反應相似,容易混淆,其發(fā)生于首次給藥后30min內(nèi),無需IgE介導[1-2]。骨肽類制劑為多組分生化藥,以豬或牛的四肢骨提取物制成,或與全蝎提取物混合制成復方骨肽制劑,成分包括活性肽、肽類活性因子、有機鈣、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素、氨基酸等[3-4]。臨床該制劑主要通過靜脈注射或肌肉注射給藥,用于骨折、骨關節(jié)炎、風濕、類風濕關節(jié)炎等疾病的治療[5-6]。國家藥品不良反應監(jiān)測中心在《藥品不良反應信息通報》中對骨肽和復方骨肽注射劑的安全問題進行了通報[7]。近年來,對骨肽類注射劑不良反應病例分析發(fā)現(xiàn),其不良反應的臨床表現(xiàn)有過敏性休克、皮疹、瘙癢、胸悶、心慌、呼吸困難、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、等過敏性反應,還包括消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的損害[8]。骨肽類注射劑的不良反應中,給藥30min內(nèi)發(fā)生的不良反應占比較多(40%以上)[9]。由于前期本課題組采用全身主動過敏實驗法對骨肽類注射劑的過敏反應進行評估,結果均為陰性,故在本研究進一步采用類過敏相關模型考察骨肽類注射劑與類過敏反應的相關性,對骨肽類制劑的臨床安全用藥及其不良反應的闡述和發(fā)生機制研究具有重要意義。

類過敏反應機制在體內(nèi)較為復雜,可能與補體系統(tǒng)或膜表面受體介導肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒釋放活性物質(zhì),導致毛細血管通透性增加有關[10]。在此基礎上,細胞脫顆粒實驗、大鼠藍斑皮膚實驗、小鼠耳廓藍染實驗等方法在類過敏反應研究中有相關報道[11-13]。其中小鼠耳廓藍染實驗由類過敏物質(zhì)與伊文思藍(evans blue,EB)混合經(jīng)靜脈注射入體內(nèi)后,EB迅速與血漿蛋白結合,在類過敏相關物質(zhì)影響下,體內(nèi)毛細血管通透性增加,導致EB隨血漿蛋白滲出血管,表現(xiàn)為小鼠耳廓藍染[14],該檢測法操作簡便,但在陽性藥物選擇與劑量、實驗方法及評價指標未有明確的標準,因此,本課題通過陽性藥篩選,建立了適宜的陽性模型,并將其用于骨肽類注射劑的類過敏反應評價研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠246只,體重20～22g,5～6周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。動物飼養(yǎng)于江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院屏障系統(tǒng)內(nèi)[SYXK(蘇)2019-0047],本研究經(jīng)江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院實驗動物福利倫理審查委員會審批(JSIFDC2020-04),實驗動物按3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

骨肽注射液(企業(yè)A、B、C)、復方骨肽注射液(企業(yè)A、D)、骨肽氯化鈉注射液(企業(yè)E)、注射用骨肽(企業(yè)E、F)、注射用骨瓜提取物(企業(yè)G、H)、骨瓜提取物注射液(企業(yè)I、H);磷酸組胺(中國食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,批號:150510-201313);組胺(北京百靈威科技有限公司,批號:LK90T46);組胺二鹽酸鹽(德國LGC公司,批號:G165368);0.9%氯化鈉溶液(中國大冢制藥有限公司、批號:8J95D4);伊文思藍(上海Sigma-Aldrich公司,批號:MKCF0851);甲酰胺(上海Sigma-Aldrich公司,批號:94024020)。

XP6型/XS205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);Synergy H1多功能酶標儀(美國博騰Bio Tek公司);XiangYi L-550低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及給藥

(1)溶液配制

天平稱取EB2g,溶解于100mL0.9%氯化鈉溶液,超聲10～15min,直至充分溶解,然后用0.22 μm濾膜過濾得到2% EB溶液,用于配制含EB的各組藥液。

陰性對照組:含0.16% EB的0.9%氯化鈉溶液。

陽性對照組:高劑量組:(1)組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,配制成濃度為1mg/mL(含0.16%EB)的溶液;(2)磷酸組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制含組胺1mg/mL(含0.16% EB)的溶液;(3)組胺鹽酸鹽:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制成含組胺1 mg/mL(含0.16% EB)的溶液;低劑量組:(1)組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,配制成濃度為0.5mg/mL(含0.16% EB)的溶液;(2)磷酸組胺:以0.9%氯化鈉溶液為溶劑,按照分子量折算,配制為含組胺0.5mg/mL(含0.16% EB)的溶液。

樣品組:高劑量組:骨肽類注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為5mg/mL(含0.16%EB)的藥液。中劑量組:骨肽類注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為2.5mg/mL(含0.16%EB)的藥液。低劑量組:骨肽類注射劑按照其規(guī)格用0.9%氯化鈉溶液配制為1mg/mL(含0.16%EB)的藥液。骨肽氯化鈉注射液的原液濃度為1 mg/mL故實驗中設置了1mg/mL與0.5mg/mL兩個劑量組。

(2)實驗分組

小鼠按照體重隨機分組,每組6只,每只小鼠尾靜脈給予0.5mL藥液。陰性對照組給予0.9%氯化鈉溶液(含0.16% EB);陽性對照組,分別給予高劑量及低劑量的組胺(含0.16% EB)、磷酸組胺(含0.16% EB)、組胺鹽酸鹽(含0.16% EB);樣品組,分別給予相應的高、中、低劑量含0.16% EB的樣品溶液。

1.3.2 實驗指標選擇

(1)小鼠耳廓藍染率測定

給藥30min后處死小鼠。觀察并記錄各組出現(xiàn)耳廓藍染色的動物數(shù)量,計算各組耳廓藍染的發(fā)生率。

(2)小鼠耳廓EB滲出量測定

EB標準曲線配制:將10mg EB溶于10mL甲酰胺中,配制得濃度為1mg/mL的備用溶液。取200μL備用溶液用20mL甲酰胺稀釋得到濃度為10μg/mL的工作液。

觀察并記錄小鼠的耳廓藍染情況后,處死并立即沿耳根部剪去雙耳后,剪成小塊,用2mL甲酰胺浸沒,室溫浸泡48h,提取耳廓中滲出EB染料,各組雙耳EB滲出量及升高率的測定:浸泡48h后離心15min,轉(zhuǎn)速為3000r/min。在96孔培養(yǎng)板中加入200μL各組上清液,以等量甲酰胺作為空白對照,用酶標儀在620nm下測定吸光度(A)值。根據(jù)標準曲線計算EB含量,將其換算2mL甲酰胺中所含有EB染料的總滲出量,并計算EB升高率。EB升高率=(給藥組EB含量-陰性對照組EB含量)/陰性對照組EB含量×100%。

本實驗中設定的類過敏反應判斷標準如下:a:耳廓藍染發(fā)生率≥30%;b:耳廓EB升高率≥50%。以上2項條件均符合時,類過敏反應判斷為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism5軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析采用平均數(shù)±標準差(±s)表示各組實驗數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 陽性模型的建立

利用3種組胺標準品(磷酸組胺、組胺、組胺鹽酸鹽)建立陽性模型,結果見表1。結果發(fā)現(xiàn)各組高低劑量陽性對照組藍染發(fā)生率均為100%,同時其EB滲出量相比陰性對照組都明顯升高且升高率大于50%,類過敏反應均判定為陽性(圖1)?？紤]到實驗過程中靜脈注射高劑量組胺鹽酸鹽,30min內(nèi)小鼠存在呼吸加快、輕微抽搐等情況,無法判定類過敏的產(chǎn)生是否由組胺鹽酸鹽引起,因此在低劑量考察時,未將其納入考察對象。比較了低劑量組胺與磷酸組胺的類過敏結果發(fā)現(xiàn),磷酸組胺的藍染情況與EB升高率更為明顯,且低劑量下的EB升高率與其高劑量組相差不大。綜上,后期選擇低劑量的磷酸組胺作為骨肽類注射劑類過敏考察的陽性對照模型藥物。

圖1 陽性模型典型耳廓藍染圖(高劑量組)Figure1 Typical ear blue staining of positive model(High-dose group)

表1 不同劑量的陽性對照的耳廓藍染結果(n=6)Table1 Ear blue staining results of different doses of positive control

2.2 骨肽類注射液類過敏反應的考察

根據(jù)骨肽注射液及復方骨肽注射液的臨床用藥濃度,設置高劑量組藥液濃度為5mg/mL;中劑量組藥液濃度為2.5mg/mL;低劑量組藥液濃度為1 mg/mL。綜合比較了骨肽類注射液在小鼠耳廓藍染實驗中觀察記錄的耳廓藍染發(fā)生率及計算所得的EB升高率(見表2)。高劑量(5mg/mL)下,不同企業(yè)間骨肽類注射液引起的類過敏反應具有一定差異,企業(yè)B骨肽注射液的EB升高率大于50%,企業(yè)A骨肽注射液和復方骨肽注射液、企業(yè)D復方骨肽注射液的EB升高率大于50%且大于陽性對照組,以上各組藍染發(fā)生率均大于30%,故類過敏反應均呈陽性;企業(yè)C骨肽注射液EB升高率低于50%且無藍染發(fā)生,類過敏反應呈陰性。中劑量(2.5mg/mL)下,企業(yè)A骨肽注射液和復方骨肽注射液、企業(yè)B骨肽注射液、企業(yè)D復方骨肽注射液的EB升高率相均大于50%,同時藍染發(fā)生率也大于30%,上述企業(yè)的制劑類過敏反應仍呈陽性;其余骨肽類注射液結果判定為陰性。在低劑量(1mg/mL)下,上述部分制劑小鼠藍染實驗結果雖然EB升高率大于50%,藍染發(fā)生率均低于30%,各組結果判定均呈陰性。(見圖2、圖3)。

圖2 不同企業(yè)的骨肽類注射液耳廓藍染實驗EB升高率Figure2 Rising rate of EB in ear blue staining experiment of osteopeptide injections from different companies

表2 不同企業(yè)的骨肽類注射液的耳廓藍染結果(n=6)Table2 Results of ear blue staining experiments of osteopeptide injections from different companies

圖3 不同企業(yè)的骨肽注射液典型耳廓藍染圖(高劑量組)Figure3 Typical ear blue staining pictures of osteopeptide injections from different companies(High-dose group)

2.3 其他骨肽類注射劑類過敏反應的考察

骨肽注射液與復方骨肽注射液是臨床上使用較多的骨肽類注射劑,除此之外還有多種其他的骨肽類注射劑,因此我們還利用小鼠耳廓藍染模型考察了骨肽氯化鈉注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液及注射用骨瓜提取物的類過敏反應(見表3)。高劑量下,除了企業(yè)E的骨肽氯化鈉注射液與企業(yè)I的骨瓜提取物注射液,其余5個骨肽類注射劑EB升高率均大于50%,且藍染發(fā)生率大于30%,其中企業(yè)G、H的注射用骨瓜提取物與企業(yè)F的注射用骨肽EB升高率明顯高于陽性對照組,故類過敏反應呈陽性。中劑量下,企業(yè)G、H的注射用骨瓜提取物與企業(yè)H的骨瓜提取物注射液EB升高率均大于50%,且藍染發(fā)生率大于30%,類過敏反應判斷仍為陽性,其余四組判定結果為陰性。在低劑量下,上述部分制劑小EB升高率雖然大于50%,但各組的藍染發(fā)生率均低于30%,因此結果判定均呈陰性。(見圖4、圖5)。

圖4 不同企業(yè)的其他骨肽類注射劑耳廓藍染實驗EB升高率Figure4 Rising rate of EB in ear blue staining experiment of other osteopeptide injections from different companies

圖5 不同企業(yè)的其他骨肽類注射劑典型耳廓藍染圖(高劑量組)Figure5 Typical ear blue staining pictures of other osteopeptide injections from different companies(High-dose group)

表3 不同企業(yè)的其他骨肽類注射劑的耳廓藍染結果(n=6)Table3 Results of ear blue staining experiments of other osteopeptide injections from different companies

3 討論

根據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示[9,15],大部分的類過敏反應于給藥30min內(nèi)發(fā)生,故小鼠耳廓藍染實驗中,將給藥時間設為30min,觀察耳廓藍染情況,以與臨床不良反應相關。同時本研究分析了制劑臨床用藥濃度與動物實驗濃度的相關性。

骨肽注射液與復方骨肽注射液是常用的骨肽類注射劑,臨床上常作為骨折、骨關節(jié)炎、風濕、類風濕關節(jié)炎等疾病的治療或輔助治療藥物。骨肽注射液(臨床用藥劑量為1.67mg/kg)給藥濃度由高到低折算后分別為臨床用藥劑量的8.33倍、4.17倍、1.67倍;復方骨肽注射液(臨床用藥劑量為2.5 mg/kg)的給藥濃度由高到低依次為臨床用藥濃度的5.5倍、2.75倍、1.1倍。結果表明,高、中劑量下,僅1批骨肽注射液呈陰性反應;低劑量下均呈陰性反應,藍染發(fā)生率均低于30%,但有2批骨肽注射液的EB升高率大于50%。

為了更好地評價骨肽類注射劑的類過敏反應相關性,利用小鼠耳廓藍染模型對其他骨肽類注射劑(骨肽氯化鈉注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物)進行類過敏評價。注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物的臨床劑量都為1.67mg/kg,其給藥濃度由高到低折算后分別為臨床用藥劑量的8.33倍、4.17倍、1.67倍,與骨肽注射液的實驗結果相似,在高、中劑量下多數(shù)給藥組存在不同程度的類過敏陽性情況,而在低劑量下類過敏反應均判定為陰性;而骨肽氯化鈉注射液在原液濃度下類過敏反應呈陰性。

結合近年對藥物的類過敏研究[16],在1倍臨床用藥劑量下,清開靈注射液、生脈注射液、魚腥草注射液等均未呈現(xiàn)陽性反應,但清開靈注射液在2倍臨床劑量下、生脈注射液在1.67倍臨床劑量有輕微的類過敏陽性反應。骨肽注射液、注射用骨肽、骨瓜提取物注射液、注射用骨瓜提取物在臨床劑量的4.17倍與復方骨肽注射液在臨床劑量的2.75倍即呈有不同程度的陽性反應,故骨肽類注射劑可能存在類過敏風險。此外,類過敏反應具有明顯的量效關系,單位時間內(nèi)給予的藥物濃度越高,類過敏發(fā)生的可能性越高,且程度逐漸加重[17-18];而骨肽類注射劑的類過敏反應也存在一定的量效關系,與之相符。因此骨肽類注射劑在臨床用藥時應注意用藥濃度以及需要觀察患者用藥后的身體情況。

骨肽類注射劑的臨床不良反應多發(fā)生于給藥后30min,而在患者持續(xù)給藥期間也會出現(xiàn)過敏樣反應[9]。此外,胡青[19]發(fā)現(xiàn)骨肽類注射劑的臨床不良反應與患者的給藥量、基礎病史、過敏史等諸多因素相關,故骨肽類注射劑的過敏樣反應可能與類過敏反應與過敏反應均有關。本研究采用小鼠耳廓藍染模型,通過觀察小鼠首次給予骨肽類注射劑后的耳廓藍染情況,考察骨肽類注射劑的類過敏反應,而對于骨肽注射劑的過敏反應需要采用相關模型進一步考察。綜上,骨肽類注射劑的類過敏評估對其不良反應研究具有重要意義,也為臨床用藥給藥濃度的選擇、速度的控制,用藥安全的保障提供參考和依據(jù)。