余 松，侯能易，嚴 力，王 康，潘 燕，趙應濤，王 越，曹欽興，謝 偉，旦真甲，龐明輝,,c

(1.西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000； 2. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.胃腸外科，b.消化內(nèi)科，c.老年綜合外科，四川 成都 610072；3.電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都 611731)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasms，NENs)可出現(xiàn)在機體多個部位，其發(fā)病率也呈上升趨勢[1]。大多數(shù)腫瘤生長緩慢，多發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)不典型，常常于體檢時發(fā)現(xiàn)。因其具有較高的惡性潛能，在初次診斷時約有25%發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]，遠處轉(zhuǎn)移患者的中位生存期約為2～5年[3]。因此，探索早期診斷指標、預后指標仍然是NENs防治不可忽視的環(huán)節(jié)。環(huán)氧化酶2(cycloxygenase-2，COX-2)是一種誘導性蛋白酶，在多種實體性腫瘤中檢測到COX-2及其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)的表達量升高[4]，提示其在腫瘤形成過程中有著一定的促進作用[5～7]，并在腫瘤周圍微環(huán)境中具有炎癥調(diào)節(jié)的作用。MMP-9可參與細胞基底膜的修復與重建、組織修復等，與多種蛋白一起完成許多重要的生物合成過程。在胰腺癌、肺癌、肝癌等惡性程度高的腫瘤中檢測到MMP-9的表達量升高[8～10]，進一步研究發(fā)現(xiàn)其對腫瘤負荷、分期評估以及預后預測的評估具有指導作用。COX-2、MMP-9與胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastrointestinal neuroendocrine neoplasms，GI-NENs)發(fā)生發(fā)展及其預后的關系尚有待進一步研究。本研究采用免疫組化的方法檢測175例GI-NENs患者中COX-2、MMP-9的表達情況，分析其臨床病理資料及生存數(shù)據(jù)，探討COX-2、MMP-9在GI-NENs診治中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2016年11月至2020年8月經(jīng)四川省人民醫(yī)院診治的175例GI-NENs患者的臨床病理資料。所有患者均經(jīng)內(nèi)鏡或者手術病理診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，未行術前放化療等；病理組織均來自本院病理科的石蠟切片。根據(jù)病理的增殖程度及分化程度，分為NET G1 110例、NET G2 25例、NET G3 3例、NEC 21例和MiNEN 16例。分級標準參照2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)消化系統(tǒng)腫瘤分類[11]。

1.2 方法石蠟包埋的腫瘤組織切片，經(jīng)脫蠟，酒精梯度水化處理，檸檬酸鹽緩沖液(0.01M pH 6.0)進行抗原修復處理，山羊血清封閉，一抗孵育(COX2兔抗人單克隆抗體，1∶100(濃度)，ZA-0515)，4 ℃過夜，添加二抗(山羊抗兔工作液，SP-9001)，37 ℃ 30 min，DAB顯色試劑顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。

1.3 免疫組織化結(jié)果判讀經(jīng)免疫組化處理好的切片先在100倍的顯微鏡下觀察總體染色情況，然后在400倍顯微圖像下采集3個視野。圖像采集后，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測算每個視野下的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，再測算每個視野下的平均光密度(Mean density，MD)，再得出3個視野下圖像的MD的平均值，由此得出每例樣本中COX-2、MMP-9的平均的相對表達量。

1.4 隨訪患者的聯(lián)系方式通過病案首頁、住院患者隨訪群等方式查詢到，通過電話、微信、門診隨訪等方式進行隨訪，隨訪時間截至2021年6月。從疾病初次確診時間至當前隨訪或患者死亡的時間定義為總生存時間。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。Kaplan-Meier生存曲線、Cox回歸進行生存分析；組間生存分析比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤切片中MMP、COX-2的表達情況COX-2(圖1a～e)、MMP-9(圖2a～d)主要在細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)表達，染色黃色或棕黃色細胞代表陽性，染色藍色細胞代表陰性，底物呈現(xiàn)白色。

圖1 COX-2在GI-NENs中的表達情況 (免疫組化染色×400)a:NET-G1 b:NET-G2 c:NET-G3 d:NEC e:MiNEN

圖2 MMP-9在GI-NENs中的表達情況 (免疫組化染色×400) a:NET-G1 b:NET-G2 c:NEC d:MiNEN

2.2 不同臨床病理特征GI-NENs患者COX-2的表達比較不同腫瘤位置、腫瘤最大直徑、TNM分期、病理分期、是否遠處轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移的患者COX-2表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；性別、年齡與其COX-2的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征GI-NENs患者COX-2的表達比較

2.3 不同臨床病理特征GI-NENs患者MMP-9的表達比較60例GI-NENs患者MMP-9的表達在性別、年齡、腫瘤直徑大小、位置、TNM分期、是否遠處轉(zhuǎn)移以及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征GI-NENs患者MMP-9的表達比較

2.4 COX-2表達情況與GI-NENs患者生存的關系

175例GI-NENs患者的隨訪時間為1～53個月，中位隨訪時間21月。其中GI-NETs、NEC和MiNEN的中位生存時間分別是23、9和18月。利用Kaplan-Meier行單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移與生存預后較差相關(P<0.001)(圖3 a～d)。進一步多因素Cox回歸分析，提示病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移是患者生存預后差的因素(見表3)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示高表達COX-2患者生存情況明顯較低表達患者差，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖3e)。

圖3 175例 GI-NENs患者的生存分析 a:病理分級; b:TNM分期; c:有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; d:有無遠處轉(zhuǎn)移； e：不同COX-2表達情況下的生存分析

表3 GI-NENs患者總生存率的COX多因素分析

3 討論

NENs生長緩慢，但生物學行為不一，約有1/4在初次診斷發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶多位于肝臟[12]。大部分GI-NETs的發(fā)現(xiàn)主要依靠胃腸鏡篩查，并且預后較好；然而，NEC和MiNEN其惡性程度較高，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，總體預后較NET差。近年來隨著臨床醫(yī)師的重視，更多的患者被發(fā)現(xiàn)，但其侵襲機制以及預后因素的研究較少，尋找有效的治療靶點以及精準的預后預測因素，對GI-NENs的診療有著重要的意義。

MMP-9是一種金屬基質(zhì)蛋白酶。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中MMP-9的表達量上調(diào)，與腫瘤的分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關，提示可能參與腫瘤的侵襲、經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移過程[13]。同樣在胰腺癌、肺癌以及肝癌組織中也檢測到MMP-9的高表達[8～10]。本研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-9在GI-NENs的表達，與腫瘤病理分級、腫瘤部位、TNM分期、遠處以及淋巴轉(zhuǎn)移等因素均無相關性。這與大部分MMP-9與腫瘤的關系研究中有一定差異，分析原因可能是NENs高度的異質(zhì)性是主要原因，其次樣本量不足，NET病理分級中缺少NET-G3的患者，樣本不具有代表性，可能也是其中原因之一。

COX-2是機體合成前列腺素過程中的誘導性限速酶[14]，基因位于1號染色體q25.2～25.3，正常生理狀態(tài)下的組織中很少表達[15]。有研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、大腸癌、胰腺癌以及乳腺癌等腫瘤組織中檢測到COX-2表達量增加[5，7，16]。深入研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可通過影響生長周期、促進血管生長、破壞免疫細胞等機制，直接或間接地促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時在腫瘤組織的基因檢測中發(fā)現(xiàn)COX-2是腫瘤肝臟轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移以及腦轉(zhuǎn)移的關鍵轉(zhuǎn)移進展基因之一[17]。本研究檢測到GI-NENs不同病理分級中COX-2表達有差異，在GI-NETs中，分級越高，表達量也升高，可能提示與腫瘤的進展有關系。同時，還發(fā)現(xiàn)COX-2在腫瘤分期晚、淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達高，生存分析提示高表達COX-2的患者其生存差。

在受到細胞內(nèi)外多種因素影響下，如細胞因子、癌基因、內(nèi)皮素等，COX-2可選擇性表達上調(diào)。在生成前列腺素E-2(PGE-2)過程中，會產(chǎn)生大量氧自由基、活性氧，這些物質(zhì)通過過氧化反應催化前致癌物質(zhì)生成多環(huán)芳烴類以及黃曲霉等多種致癌物質(zhì)，直接致使遺傳信息的損害，造成細胞抑癌作用失調(diào)，這可能是COX-2促進腫瘤發(fā)生的一種機制。在胰腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑可使COX-2表達上調(diào)的癌細胞侵襲性顯著降低，提示COX-2表達的上調(diào)可降低鈣粘蛋白活性從而降低細胞間粘附反應，腫瘤細胞的浸潤能力得到加強，有利于腫瘤細胞穿過胞外基質(zhì)，更有機會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移的GI-NENs中，COX-2表達量高于陰性組，可見在GI-NENs的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用，但其具體參與腫瘤轉(zhuǎn)移途徑中的機制有待后續(xù)研究。此外，COX-2還能通過激活HER-2酪氨酸激酶受體，促進腫瘤組織中高表達VEGF，參與腫瘤組織中血管的生長以及腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移等過程[18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，COX-2在TNM分期較晚腫瘤中高表達，提示其參與了GI-NENs的發(fā)展侵襲。PGE2同樣也參與了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。PGE2可促進腫瘤血管的生成，同時抑制機體的免疫功能，在評估腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移方面有積極的作用[19]。COX-2在NENs中的研究相對較少，檢測方法以及樣本量都是影響研究的因素，還有更多的功能和調(diào)控機制待明確。

大量研究證實，COX-2抑制劑可使肺、乳房、結(jié)腸和前列腺等器官癌癥風險降低約68%，同時非甾體類抗炎藥還可提高腫瘤對放療以及化療的敏感性，可能為癌癥的預防及治療提供幫助[20]。國外學者發(fā)現(xiàn)，C0X-2抑制劑一方面通過抑制COX-2的表達，從而降低了PGE-2對促凋亡因子PPARγ的抑制作用[21]，另一方面還可通過刺激COX-2表達，誘導促凋亡因子PPARγ的表達[22]。COX-2可作為激素治療、MicroRNA治療的靶點以及作為放化療的輔助用藥，為腫瘤的防治提供了新的方向。

綜上所述，COX-2的表達與GI-NENs的病理分級、TNM分期相關，病理分級越高，分期越晚，其表達量越高，提示COX-2高表達可能與GI-NENs的發(fā)展侵襲有關系。GI-NENs的預后與病理分級、分期、遠處轉(zhuǎn)移和COX-2高表達有關系，可預測患者的預后情況。本研究中NET-G3的患者較少，原因可能受既往免疫組化的影響以及本研究樣本量的不足。同時隨著NENs分級的進一步細化，有必要將病理切片二次評估腫瘤的分級狀態(tài)。由于NEC、MiNEN的細胞來源以及驅(qū)動基因和NETs存在明顯差異，COX-2在異質(zhì)性高的不同病理分級中的作用仍有待深入研究。