凍楊美，林德貴，晏 磊，周德剛，潘貴珍，田朋飛，楊絨娟

(1.國家獸用藥品工程技術研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471003；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100083；3.洛陽樂寵健康科技有限公司，河南洛陽 471003)

近年來，隨著全球氣候變暖和環(huán)境變化，蜱及蜱媒病的發(fā)生率逐年升高[1]。蜱是專性吸血的外寄生蟲，蜱媒病是由蜱蟲攜帶病原后叮咬吸血而傳播的疾病，蜱媒病不僅是自然疫源性疾病，也是人畜共患病，如全球范圍內(nèi)廣泛流行的萊姆病、巴貝斯蟲病、人單核細胞埃里克體病以及歐洲和中東地區(qū)的地中海斑點熱[2-4]。近年蜱及蜱媒病已引起大家廣泛關注[5-7]。2017年發(fā)現(xiàn)蜱傳播的疾病又新增一種阿龍山病毒[8]，并從86名具有臨床癥狀的患者體內(nèi)檢測到該病毒。中國疾病預防控制中心發(fā)表的2018年全國蜱類監(jiān)測報告顯示[9]，犬類感染蜱指數(shù)僅次于牛和羊，因此寵物感染蜱情況不容小覷，蜱媒病的防控具有重要的公共衛(wèi)生意義。

據(jù)此，洛陽惠中獸藥有限公司研制了一款用于預防和控制犬蜱蟲和跳蚤感染的外用滴劑，為非潑羅尼和甲氧普烯的復方制劑，2020年獲得二類新獸藥證書。復方非潑羅尼滴劑最早由梅里亞有限公司開發(fā)，目前國外已有報道復方非潑羅尼滴劑對犬蜱蟲的殺滅效果，本研究采用洛陽惠中獸藥有限公司提供的復方非潑羅尼滴劑，通過廣泛收集南北地區(qū)自然感染蜱患犬進行臨床效果評價，以期驗證國產(chǎn)復方非潑羅尼滴劑的臨床使用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 動物的入選標準：經(jīng)臨床檢查和實驗室診斷確定感染蜱蟲的犬，且近6個月未接受過針對蜱蟲等外寄生蟲的藥物治療；試驗犬在試驗前感染蜱蟲數(shù)量≥1只，品種和性別不限，年齡8周齡或以上。試驗用動物來源于北京市中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院、中農(nóng)大我愛動物醫(yī)院和海南省小動物保護協(xié)會海口市動物醫(yī)院接診的臨床病例。

1.1.2 試驗藥物 ①復方非潑羅尼滴劑。規(guī)格：1 mL(100 mg非潑羅尼+90 mg甲氧普烯)；包裝：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；洛陽惠中獸藥有限公司。②福萊恩增效滴劑。規(guī)格：1 mL(100 mg非潑羅尼+90 mg甲氧普烯)；包裝：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；法國梅里亞集團。

1.1.3 主要儀器 生物顯微鏡(XSZ-N107CCD)，德國Novel公司；3M聽診器(5620)，美國3M公司；四通道正倒數(shù)計時器(PS-396)，深圳追日電子科技有限公司；電子臺稱(TCS-01R)，廈門佰倫斯電子科技有限公司；電子體溫計(MC-347)，歐姆龍(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 試驗分為A、B兩組，A組為試驗組(復方非潑羅尼滴劑)，B組為對照藥物組(福萊恩增效滴劑)。共收集試驗犬120只，其中北京市60只，A組30只，B組30只；?？谑?0只，A組30只，B組30只，北京市和海口市入選的試驗犬隨機分到A組和B組。

1.2.2 給藥方案 給藥前稱量動物體重，按照體重范圍選擇藥物規(guī)格，撥開犬肩胛骨間的毛發(fā)，將滴劑沿脊柱向后滴于皮膚上，自然風干，至完全吸收，給藥1次。體重10 kg以下的犬使用0.67 mL；體重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL；體重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；體重大于40 kg的犬,每增加10 kg，則使用2.68 mL加0.67 mL,依次類推。用藥后嚴格遵醫(yī)囑，試驗犬不能洗澡，直至試驗結(jié)束。

1.2.3 試驗周期 受試藥物和對照藥物的試驗周期均為35 d，分別在用藥當天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d隨訪1次，觀察相應指標。

1.2.4 臨床觀察 用藥后密切觀察試驗犬的精神狀態(tài)、體溫、呼吸、心搏等常規(guī)指標，記錄藥物對試驗犬造成的不良反應及副作用。

1.2.5 體外寄生蟲檢查 在用藥當天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d，觀察體表蜱蟲感染的情況，并記錄每只試驗犬感染蜱蟲數(shù)量。具體操作方法：評估過程兩人同時操作，把犬從籠子里提出置于檢查臺上，一人一側(cè)，逆著毛發(fā)生長方向梳理，使皮膚裸露，系統(tǒng)全面地檢查頭部、背部、腹部及四肢，具體包括犬面部、頸部、體側(cè)、腹股溝、四肢等24處部位。對收集的蜱蟲進行顯微鏡形態(tài)學鑒定。

1.2.6 臨床癥狀評分標準 在用藥當天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d對病犬皮膚進行檢查。記錄動物皮膚病灶部位與分布情況，并按照臨床局部皮膚檢查指標評分標準對皮膚紅疹和皮膚瘙癢程度進行分級，評價用藥后臨床癥狀的消失和轉(zhuǎn)歸情況。分級標準如下。

皮膚紅疹程度分為5個等級：無紅疹或已退化(0),紅疹數(shù)1個/4 cm2～5個/4 cm2或面積4 cm2～7 cm2(1),紅疹數(shù)6個/4 cm2～10個/4 cm2或面積8 cm2～15 cm2(2),紅疹數(shù)11個/4 cm2～15個/4 cm2或面積16cm2～20 cm2(3),紅疹數(shù)超過16個/4 cm2或面積超過20 cm2(4)；皮膚瘙癢程度分為5個等級：無(0),偶發(fā)1次/10 min～5次/10 min(1),頻發(fā)6次/10 min～10次/10 min(2),常發(fā)11次/10 min～15次/10 min(3),高發(fā)>15次/10 min(4)。

1.2.7 藥物療效評價標準 按下列公式分別計算每組動物每種蟲體的轉(zhuǎn)陰率、減少率，并計算總的蟲體轉(zhuǎn)陰率、減少率，評估各組藥效。

蟲體轉(zhuǎn)陰率(%)=蟲體轉(zhuǎn)陰動物數(shù)/試驗動物數(shù)×100

蟲體減少率(%)=驅(qū)蟲前蟲體數(shù)-驅(qū)蟲后蟲體數(shù)/驅(qū)蟲前蟲體數(shù)×100

有效：用藥治療期間和用藥結(jié)束后，皮膚(或耳部)的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率≥90%，患部無瘙癢，無紅疹、皮屑或試驗動物自我啃咬的損傷。

無效：用藥治療期間和用藥結(jié)束后，皮膚(或耳部)的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率<90%，患部仍有瘙癢，紅疹、皮屑等，試驗動物自我啃咬的損傷明顯存在。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

復方非潑羅尼滴劑組和福萊恩增效滴劑組的試驗犬在用藥前后試驗犬的精神狀態(tài)、飲水食欲、活動性、體溫、呼吸、心搏均無異常，說明試驗犬對這兩種藥物的耐受性均很好。

2.2 體外寄生蟲檢查

北京市從60只蜱蟲感染病例犬身上共收集到83只蜱蟲樣本，經(jīng)鑒定79只為血紅扇頭蜱，4只為長角血蜱。?？谑袕?0只蜱蟲感染病例犬身上共收集到72只蜱蟲樣本，經(jīng)鑒定均為血紅扇頭蜱。從表1中可以看出，在南北方不同地區(qū)進行治療蜱蟲感染的兩組試驗犬，在用藥后蜱蟲數(shù)量均得到有效控制，且不同地區(qū)、不同組別在用藥后各時間點蜱蟲數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，給藥后1 d蜱蟲數(shù)量迅速下降，給藥后3 d兩個用藥組蜱蟲數(shù)量都下降至零，復方非潑羅尼滴劑組至少可持續(xù)維持到第28天。

表1 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后蜱蟲數(shù)量變化Table 1 Changes in the number of ticks in cases of tick infection in different regions after medication

2.3 皮膚臨床癥狀評分數(shù)據(jù)分析

蜱蟲感染病例犬在用藥后不同時間點進行臨床局部皮膚檢查，兩組患犬的皮膚病灶主要分布在頸部、腹部，少量分布在背部及四肢，各時間點體表紅疹程度、瘙癢程度平均評分結(jié)果見表2和表3，用藥后兩組犬皮膚紅疹癥狀和瘙癢癥狀均得到明顯好轉(zhuǎn)，不同組別、不同地區(qū)患犬用藥后7 d紅疹基本消失，用藥后4 d瘙癢癥狀基本消失，A組和B組之間無顯著差異(P>0.05)，可見復方非潑羅尼滴劑可顯著緩解、治療局部瘙癢與紅疹癥狀。

表2 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后皮膚紅疹程度評分變化Table 2 Changes in skin erythema scores of tick infection cases in different regions after medication

表3 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后皮膚瘙癢程度評分變化Table 3 Changes in skin pruritus scores of tick infection cases in different regions after medication

2.4 療效評價結(jié)果

北京市A組患犬綜合體表蟲體檢查結(jié)果和局部皮膚檢查結(jié)果，在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和83.3%，蟲體平均減少率分別為100%和94.8%，第35天有6只患犬復發(fā)瘙癢、紅疹等癥狀；B組在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為96.7%和96.7%，蟲體平均減少率分別為99.2%和99.2%，第28天僅有1只患犬復發(fā)瘙癢、紅疹。

海南市A組患犬綜合體表蟲體檢查結(jié)果和局部皮膚檢查結(jié)果，在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和100%，蟲體平均減少率分別為100%和100%，患部無瘙癢、紅疹等癥狀；B組在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和96.7%，蟲體平均減少率分別為100%和98.9%，第35天僅有1只患犬復發(fā)瘙癢、紅疹。

根據(jù)療效判定標準，試驗藥物和對照藥物在用藥后第28天和第35天，皮膚的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率均>90%，且90%以上患犬無瘙癢，無紅疹、皮屑，亦未見試驗動物有自我啃咬現(xiàn)象，可見復方非潑羅尼滴劑對治療犬蜱蟲病效果顯著。

3 討論

為科學、公正地評價在田間條件下受試藥物對目標適應癥的臨床治療效果，本研究根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告1425號《寵物用抗體外寄生蟲藥物藥效評價田間試驗指導原則》，考察了復方非潑羅尼滴劑對犬蜱蟲病的臨床治療效果，旨在評價臨床應用的有效性和安全性。

復方非潑羅尼滴劑有效成分為非潑羅尼(10%m/v)和甲氧普烯(9%，m/v)，非潑羅尼作為殺成蟲劑作用于蜱和跳蚤成蟲，甲氧普烯作為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑作用于跳蚤卵和幼蟲，二者協(xié)同發(fā)揮增效作用。復方非潑羅尼滴劑對兩種蟲體的臨床效力驗證試驗分階段進行，因此本研究重點回顧性分析了對蜱蟲的殺滅作用。非潑羅尼為新型苯基吡唑類殺蟲劑，與傳統(tǒng)殺蟲劑(有機磷類、擬除蟲酯類、氨基甲酸酯類)相比，具有廣譜、高效、毒副作用小、半衰期長以及對非靶標動物安全的優(yōu)點[10]，且藥物結(jié)構新穎、活性高、作用機制獨特，屬新一代高技術殺蟲劑。非潑羅尼為γ-氨基丁酸(GABA-A)受體拮抗劑，參與GABA-A受體周圍生物膜活性[11]，通過非競爭性抑制GABA誘導的靶向氯離子通道，導致蟲體神經(jīng)元和肌肉過度興奮而死亡，可在24 h內(nèi)殺死寵物體表成年蜱蟲、跳蚤。雖然非潑羅尼對昆蟲和哺乳動物的作用機制相同，但由于其對昆蟲GABA受體的親和力明顯高于哺乳動物，應用時對哺乳動物具有較高的安全性，在本研究期間未見任何不良反應。且文獻報道非潑羅尼對昆蟲GABA受體的親和力為哺乳動物的500倍[12]，可見此藥安全性高。

蜱蟲是危害犬健康的重要外寄生蟲，寄生于犬體表的蜱主要有血紅扇頭蜱、長角血蜱和鐮形扇頭蜱。本研究從北京市、?？谑袑櫸镝t(yī)院共收集155只蜱蟲，經(jīng)鑒定151只為血紅扇頭蜱，4只為長角血蜱，表明血紅扇頭蜱是危害我國犬的主要蜱種，與報道結(jié)果一致[13]。我國蜱蟲種群分布特點以長角血蜱為主[14]，故應高度重視對血紅扇頭蜱和長角血蜱的防控。蜱的分布受多種因素影響，溫度和濕度是決定蜱發(fā)育和存活的關鍵因素[15-16]，而我國各地氣候和地域地理條件的不同，可能會對蜱蟲的滋生與繁殖有一定影響，因此驗證復方非潑羅尼藥效的同時兼顧考察不同地區(qū)蜱蟲對該藥的敏感性，根據(jù)指導原則設計在南方(海口市)和北方(北京市)各選擇一片區(qū)域進行藥效評價試驗。試驗結(jié)果表明復方非潑羅尼滴劑對不同地區(qū)蜱蟲的驅(qū)殺效果無明顯差異，給藥后2 d，患犬體表蜱蟲數(shù)量迅速下降，用藥后3 d即可完全殺滅，且藥效可維持28 d，蟲體平均減少率可達100%，且試驗藥物與對照藥物無顯著差異，與文獻[17-18]結(jié)果一致。通過臨床試驗比較沙羅拉納與非潑羅尼的殺蜱效果，用藥30 d內(nèi)兩種藥物均可高效殺滅蜱蟲，蟲體減少率達到94.1%[19]，與本研究在北京市試驗結(jié)果(蟲體減少率94.8%)基本一致。用3種濃度的非潑羅尼(0.025%、0.05%、0.1%，m/v)研究其對蜱蟲的殺滅效果，結(jié)果證實3種濃度對蜱蟲的殺滅率均大于99%[20]。給藥42 h后沐浴，反復侵染蟲體，殺蟲率依然能達到98.52%[21]，且光照、沐浴不會影響其殺蟲效果[22]。本研究為更加科學、直觀地反映藥效，除通過定期檢查統(tǒng)計體外寄生蟲減少率外，同時借助臨床癥狀指標皮膚瘙癢和皮膚紅疹程度評分進行評價，由統(tǒng)計結(jié)果可以看出該藥藥效確切且效力持久。

復方非潑羅尼滴劑對我國南北方蜱蟲病均具有較好治療效果，用藥1次可維持28 d，蟲體平均減少率可高達100%，按推薦劑量使用有效性強、安全性高，可以用于我國不同地區(qū)犬蜱蟲病的預防和治療。臨床推薦使用方法：外用，撥開犬肩胛骨間的毛發(fā)，將滴劑沿脊柱向后滴于皮膚上，自然風干；體重10 kg以下的犬使用0.67 mL，體重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL，體重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；體重40 kg以上的犬使用2.68 mL加上體重超出部分對應的劑量，28 d用藥1次。