華雅潔，岳遠征，楊秀蓮＊，何 卿

(1.南京林業(yè)大學，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇省環(huán)境科學研究院，江蘇省環(huán)境工程重點實驗室，江蘇 南京 210036)

海州常山（Clerodendrum trichotomumThunb.），又名臭梧桐，為馬鞭草科（Verbenaceae）赪桐屬（ClerodendrumL.），灌木或小喬木，廣泛分布于我國華北、華東、中南、西南等各省區(qū)[1]。海州常山夏季花朵潔白美麗，花期較長，秋冬亮藍色的果實懸掛于枝頭，是秋冬季節(jié)別具特色的觀果植物，有較好的觀賞性，且海州常山根系強壯，自然條件下在干旱瘠薄的砂石、石灰?guī)r山地和貧瘠的山地野生分布，栽培管理簡單，具有強的耐鹽堿、抗旱、耐瘠薄、耐陰、抗有害氣體等能力，可作為荒地與鹽堿地的生態(tài)修復樹種[2]?？傮w來說，海州常山是集觀賞與優(yōu)良抗性為一體的極具開發(fā)潛力的木本花卉。

然而，現(xiàn)在對海州常山的研究主要集中于種質資源收集[3]、快繁體系培育[4]、植物生理抗逆性[5]、藥物成分開發(fā)[6]等，對于海州常山分子生物學的研究十分匱乏，海州常山內參基因的篩選及表達尚未見有文獻發(fā)表，連對馬鞭草科植物可穩(wěn)定使用的內參基因篩選也是知之甚少。本研究對海州常山進行鹽脅迫、干旱脅迫和熱害脅迫，運用實時熒光定量PCR，并通過 GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ReFinder 軟件綜合分析，篩選出適合海州常山葉片非生物脅迫下使用的內參基因，為海州常山深入分析分子機制研究及優(yōu)良的抗性基因開發(fā)奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與脅迫處理

本實驗使用了種植于南京林業(yè)大學白馬研究教學基地（119.02° E，31.65° N）海州常山種質資源庫中鹽城種源的海州常山（鹽城種源為收集于鹽城地區(qū)的野生種，并于2015 年定植于南京林業(yè)大學白馬研究教學基地海州常山種質資源庫）。2018年采集鹽城種源種子，種子種植于珍珠巖、蛭石、泥炭和沙子（1∶1∶1∶2）的混合物中，放置在光周期14 h、溫度25/21℃（晝/夜）、光照強度180 mmol·m-2·s-1、相對濕度60%的生長箱（RDN-1 000-3，中國寧波東南儀器廠）中培養(yǎng)，待長出8 片以上真葉，取長勢大致相同的1 年生實生苗進行非生物脅迫實驗。

在進行實驗前，將幼苗放入四分之一強度的Hoagland 培養(yǎng)基中適應2 周，適應過程中，海州常山幼苗未見不適應情況，經(jīng)觀察幼苗還在繼續(xù)長葉生長，且長勢良好。在進行鹽脅迫時，將幼苗轉入含100 mmol·L-1NaCl 的Hoagland 培養(yǎng)基中；在進行干旱脅迫時，將幼苗轉入含100 mmol·L-1PEG6000 的Hoagland 培養(yǎng)基中；在進行熱害脅迫時，將幼苗置于45 ℃/35 ℃（晝/夜）的生長室內進行高溫處理。各脅迫均在處理0、2、6、12、24、48 和72 h 時采取3 個生物學重復植物葉片，葉片均采自于從上至下第 2 至第 4 對葉片，每次脅迫使用21 棵幼苗，采取過葉片的植物便不再作為實驗材料再取葉片，采取后立即將葉片放入無菌無酶的離心管中并投入液氮中，放置在-80 ℃下的超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆茫敝?RNA 提取。所有實驗處理及采樣均在上文所述人工培養(yǎng)箱中完成，盡量減少其他無關變量對實驗的影響。

1.2 RNA 提取及cDNA 合成

RNA 提取采用北京艾德萊生物有限公司的EASY spin Plus 試劑盒，用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳驗證 RNA 的完整性，使用Mettler 公司生產(chǎn)的核酸檢測儀 UV5NANO 檢測 RNA 質量及濃度。使用北京全式金公司的 EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進行反轉錄，-20 ℃保存。

1.3 候選內參基因的選擇與引物合成

根據(jù)文獻查詢植物中常用的內參基因，在海州常山轉錄組數(shù)據(jù)庫中尋找同源基因，用 NCBI 中Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能進一步確認注釋信息和比對結果，選定所需的基因。在海州常山轉錄組數(shù)據(jù)庫中尋找各候選基因的保守序列，根據(jù)基因保守序列用 Primer Premier 5.0 設計引物，再用 Oligo7 進行分析，引物設計原則參考Ding 等的方法[7]，所使用引物均在南京金斯瑞公司合成。將所設計的引物進行常規(guī) PCR，并用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照 TaKaRa公司的 Agarose Gel Extraction Kit 凝膠回收盒對PCR 產(chǎn)物進行回收，連到大腸桿菌載體上并送南京金斯瑞公司測序。將測序得到的序列與所設計的序列用 DNAMAN 進行比對，確定內參候選基因。

1.4 qRT-PCR 反應條件

使用 TakaRa 公司的 Ex TaqTM染料進行 qRTPCR，熒光定量儀型號為賽默飛公司的 plied Biosystems StepOne PCR System，所有 qRTPCR 反應進行3 次生物重復和3 次技術重復，并與無模板陰性對照平行進行。qRT-PCR 反應組分體系及反應條件如下：反應體系共計10 μL，其中，cDNA 1 μL，ROX 0.2 μL，正向引 物 0.4 μL，反向引物 0.4 μL，SYBR 染料5 μL，ddH2O 4 μL。反應程序為：95 ℃ 0.5 min，1 個循環(huán)；95 ℃0.75 min，60 ℃ 0.5 min，共計40 個循環(huán)，95 ℃0.25 min，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0.25 min，1 個循環(huán)。

1.5 內參基因特異性與擴增效率檢驗

以混合 cDNA 為模板，反應體系同上文，以 5為倍數(shù)稀釋成 5 個梯度（1、1/5、1/25、1/125、1/625），作為建立標準曲線的模板，每個點重復3 次，同時以 ddH2O 作為陰性對照模板，來檢測實驗過程中的試劑或者人為污染。計算每對引物的擴增效率（E=(10-1/slope-1) × 100%）。選擇溶解曲線呈現(xiàn)單峰，并且擴增效率在 90%～110%，陰性對照無峰的特異性引物作為最終的引物。

1.6 數(shù)據(jù)分析

內參基因穩(wěn)定性分析，利用軟件 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper，并用在線分析工具ReFinder（http://150.216.56.64/referencegene.php）綜合分析 qRT-PCR 的數(shù)據(jù)，計算候選內參基因在不同實驗條件下的表達穩(wěn)定性。

NHX1基因（Na+/H+交換基因）被認為是增強植物非生物脅迫耐受性的關鍵基因，尤其是耐鹽性[8]，選擇CtNHX1基因為驗證基因（F：CACT AACAAATCCCCAACTCAT；R：CTCAAGCTCAA AGGAAAAGAAC），并用篩選出的合適的內參基因作為參照，使用不穩(wěn)定的內參基因作為比較，驗證候選內參基因表達的穩(wěn)定性。

2 實驗結果

2.1 RNA 提取、內參基因引物特異性與擴增效率分析

樣品 RNA 的濃度使用 Mettler 公司生產(chǎn)的核酸檢測儀 UV5NANO 測定，樣本濃度均在 432～1 732 ng·mL-1之間，OD260/280值在 1.8～2.0 之間，OD260/230≥2.0，用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗 RNA 完整性，顯示至少存在2 條帶，28 S 和18 S 清晰，且 28 S/18 S ≈ 2，說明 RNA 質量達到熒光實時定量分析的要求。

共計篩選出 17 個候選內參基因，對 17 個內參基因進行熒光實時定量，基因的擴增產(chǎn)物長度為112～246 bp，溶解曲線均為單一峰，擴增產(chǎn)物特異性高，符合篩選內參基因的要求。所有候選內參基因的E值（擴增效率）范圍為 96.67%～99.68%，標準曲線的相關系數(shù)R2為 0.986～0.999，綜上所述 17 對引物的擴增效率較高（表1）。

表1 17 個候選內參基因引物及擴增效率Table 1 17 candidate internal reference gene primers and amplification efficiency

2.2 候選內參基因表達分析

基因表達水平由周期閾值（Ct）決定，Ct值與基因表達量呈反比，從圖1 中可看出：這些候選基因顯示出不同的表達水平，17 個候選參考基因的Ct值分布均在15～35 個循環(huán)之間，具體數(shù)值見表1。ACT、UBCE2和HSP70的表達量較高，且在不同樣本中表達變化范圍相對較小，表達較穩(wěn)定；SAND、PROF的表達量較低；APT、H3 和EF-1A在不同樣本中表達變化范圍相對較大，表達差異較大（圖1）。

圖1 17 個候選內參基因的Ct 值分布Fig.1 Distribution of Ct values of 17 candidate internal reference genes

2.3 脅迫下候選內參基因表達穩(wěn)定性分析

2.3.1 GeNorm 分析 GeNorm 軟件根據(jù)平均表達穩(wěn)定指數(shù)(M)確定最穩(wěn)定基因，M值的大小與基因穩(wěn)定性呈反比，M值的閾值為1.5，超過1.5 則視為不能選為內參基因。此外，GeNorm 軟件通過配對變異值（Vn/n+1）計算最優(yōu)內參基因的校準數(shù)量，若Vn/n+1值小于0.15，則所需參考基因的數(shù)量為n，否則需引入的參考基因的數(shù)量為n+1[9]。

從表2 可看出：在鹽害、干旱和熱害脅迫中，M值均小于1.5，說明符合GeNorm 軟件篩選內參基因的標準。鹽害脅迫中，RPL和AP-2基因最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.132；干旱脅迫中，ACT和AP-2表現(xiàn)最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.401；熱害脅迫下EF-1A和UBCE2最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.247。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，基因RPL和AP-2最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.767，且V2/3均小于0.15，說明選用2 個內參基因便可滿足基因標準化的要求（圖2）。

圖2 GeNorm 軟件分析的配對變異值（Vn/n + 1）Fig.2 Paired variation(Vn/n + 1) analyzed by GeNorm software

表2 GeNorm 軟件分析結果Table 2 GeNorm software analysis results

2.3.2 NormFinder 分析 NormFinder 軟件原理和GeNorm 相似[10]，通過計算穩(wěn)定值排序得出基因的穩(wěn)定性，穩(wěn)定值較大的基因，穩(wěn)定性較差。一般來說，NormFinder 軟件只計算一個最適的內參基因。在鹽害脅迫中，基因RPL最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.238，18S最不穩(wěn)定，穩(wěn)定值為1.283；干旱脅迫下，AP-2基因顯示最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.246，基因H3穩(wěn)定性表現(xiàn)較差，穩(wěn)定值為1.658；熱害脅迫下，MDH基因最穩(wěn)定，穩(wěn)定值為0.155，H3表現(xiàn)出最不穩(wěn)定的特性，穩(wěn)定值為1.841；將所有脅迫實現(xiàn)綜合來看，AP-2是最穩(wěn)定的基因，穩(wěn)定值為0.317，H3是最不穩(wěn)定的基因，穩(wěn)定值為2.252（表3）?？傮w來看，基因RPL、UBCE2、AP-2、MDH等基因在各個脅迫處理中，穩(wěn)定性均排第一、第二位，相對穩(wěn)定，H3基因穩(wěn)定性總是排在較后的位置，穩(wěn)定性較差，不適合作為海州常山內參基因使用。

表3 NormFinder 軟件分析結果Table 3 NormFinder software analysis results

2.3.3 BestKeeper 分析BestKeeper 軟件通過比較Ct值產(chǎn)生的相關系數(shù)（r）、變異系數(shù)（CV）和標準差（SD）來決定最優(yōu)的內參基因，SV和SD越小，則穩(wěn)定性較好[11]，當SD＞ 1 時，則該內參基因表達不穩(wěn)定。與NormFinder 軟件相同，BestKeeper 軟件一次只能計算一個最適的內參基因。

在海州常山鹽害脅迫處理中，基因ACT（SD=0.26，CV=為1.37）為最穩(wěn)定的基因，干旱脅迫下最穩(wěn)定的基因也是ACT（SD=0.36，CV=1.86），在熱害脅迫下最穩(wěn)的基因是AP-2（SD=0.36，CV=1.3）；綜合分析所有脅迫下數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，AP-2基因是最穩(wěn)定的基因（SD=0.64，CV=2.73）（表4）；相比較之下，基因H3在鹽害脅迫、干旱脅迫、熱害脅迫和所有脅迫數(shù)據(jù)處理中，SD和CV值都是最大的，最不穩(wěn)定。

表4 Bestkeeper 軟件分析結果Table 4 Bestkeeper software analysis results

2.3.4 ReFinder 分析 3 個軟件分析的結果有相似也有不同，所以需要使用ReFinder 軟件綜合分析，對3 個軟件得出的基因穩(wěn)定性排名值進行幾何平均值分析，幾何平均值越小則說明候選內參基因的穩(wěn)定性較高。運用ReFinder 軟件綜合分析得出（表5），鹽害脅迫下，最穩(wěn)定的基因是RPL和UBCE2，應選用這2 個基因作為內參基因；干旱脅迫下，AP-2和ACT基因是排名第1、2 位的基因，適合作為干旱脅迫下的內參基因；熱害脅迫下，MDH和EF-1A是表達最穩(wěn)定的基因。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，AP-2和UBCE2基因是排名最靠前的，而H3、EF-1A、PROF和18S基因都是排名較后的，不適合于作為海州常山脅迫的內參基因。

表5 ReFinder 軟件綜合分析結果Table 5 Results of the comprehensive ReFinder software analysis

2.3.5 篩選內參基因的鑒定 為了驗證所篩選的參考基因，采用qRT-PCR 檢測了不同非生物脅迫條件下CtNHX1基因表達（圖3）。CtNHX1基因的表達使用最穩(wěn)定的參考基因組合進行標準化，并與最不穩(wěn)定的參考基因H3進行比較。干旱脅迫，CtNHX1的表達量在0～2 h 和12～24 h 上調，其他時間內基因表達量下降。鹽脅迫，CtNHX1在0～48 h 內基因表達量上調，此后下調。熱害脅迫，0～2 h，6～12 h，CtNHX1基因表達量上調，其余時間下調。當使用篩選出的穩(wěn)定參考基因進行標準化時，基因表達水平顯示出相似的趨勢。然而，使用H3進行歸一化會導致完全不同的結果，說明所篩選的內參基因可靠，可作為海州常山非生物脅迫下的內參基因使用。

圖3 用CtNHX1 驗證在不同脅迫下篩選的內參基因穩(wěn)定性Fig.3 The stability of the internal reference genes selected under different stresses was verified by CtNHX1.

3 討論

實時熒光定量技術因靈敏度高、特異性強和可重復強，已成為檢測核酸含量和分析基因相對表達水平的最重要技術之一；然而，不同物種所適合的內參基因也不同，因此，需要根據(jù)物種選擇適合的內參基因。海州常山是一種重要的藥用植物，具有極好的耐鹽性、觀賞性和開發(fā)前景，土壤鹽漬化是一個世界性的問題，選擇合適的沿海鹽堿植物一直是恢復沿海生態(tài)的焦點[12]，篩選海州常山內參基因幫助我們在分子水平上更好地理解植物的耐鹽性及更好地開發(fā)利用植物的耐鹽性。

由于不同計算軟件的統(tǒng)計算法和分析程序導致基因穩(wěn)定性排名有所差異，不同的軟件給出了不同的結果，這是由于不同軟件篩選穩(wěn)定性考慮的算法側重點不同造成的?？傮w來說雖有差異，但基因的穩(wěn)定排名大致相同，以鹽脅迫下的內參基因篩選為例，GeNorm 和NormFinder 軟件分析RPL、UBCE2基因表達穩(wěn)定，BestKeeper 軟件卻認為ACT基因表達最穩(wěn)定，UBCE2基因穩(wěn)定性排第二；ReFinder軟件綜合分析得出，RPL、UBCE2和AP-2基因是鹽脅迫下穩(wěn)定性排名前三基因。從分析結果看，各個分析軟件的結果雖有不同，但僅僅是排名名次上有些差異，差異性不大且穩(wěn)定性值相差也不大。

ACT和AP-2在干旱脅迫下最穩(wěn)定表達，ACT在何首烏、紅麻等多個物種中被證實穩(wěn)定表達[13-14]，在葡萄非生物脅迫下，基因AP-2也被鑒定為合適的參考基因[15]。熱害脅迫下MDH和EF-1A是表達最穩(wěn)定的基因，在樟樹、黃秋葵中EF-1A被證明是最適合熱應激的參考基因[16-17]。已經(jīng)證實UBCE2和RPL基因在很多植物的非生物脅迫下是穩(wěn)定表達的[18-20]，這與海州常山葉片鹽害脅迫下的結果相吻合。綜合所有脅迫數(shù)據(jù)看，AP-2和UBCE2基因是排名最靠前的，這和在福建柏中的結果相似[21]。在本研究中，H3是最不穩(wěn)定的參考基因之一，在海州常山葉片中不適合作為內參基因使用。

為了驗證選擇的參考基因的可靠性，通過利用篩選出的內參基因對CtNHX1表達水平進行歸一化。當使用CtNHX1基因來鑒定所篩選內參基因的表達量時，CtNHX1基因在鹽害處理下48 h 時基因表達量最高，這和在短角海蓬子SbNHX1進行高鹽脅迫下的基因表達量相似[22]；在干旱脅迫處理后2 h 時基因表達量上調而后下降，在24 h 時基因表達量達到最高，而后又顯現(xiàn)下降趨勢[23]，這與海馬齒SpNHX1基因表達量具有相似的規(guī)律?？傮w結果顯示，使用本研究篩選出的內參基因及內參基因組合進行基因表達水平歸一化時，目的基因表達量具有相似的表達規(guī)律，在各種非生物脅迫處理中表達是穩(wěn)定的，而用不穩(wěn)定的H3基因進行目的基因表達水平檢測時，結果顯示目的基因表達水平與本研究用篩選出的內參基因檢測的目的基因表達水平規(guī)律明顯不同，說明實驗結果可靠。

4 結論

通過內參基因的穩(wěn)定性和有效性評估與分析，發(fā)現(xiàn)AP-2、UBCE2在海州常山葉片非生物脅迫下穩(wěn)定表達，下一步將繼續(xù)利用海州常山轉錄組學，挖掘海州常山脅迫條件下優(yōu)良的抗逆基因，研究相關基因的表達模式。這項工作為今后海州常山分子機制的研究提供基礎，也為其他馬鞭草物種分子水平的探究提供了內參基因選擇的參考。