，王海鵬 ，朱襲嘉，李盛國，蔣世宇，張琪琦

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西 桂林 54199)

結(jié)直腸癌，是腸道高發(fā)的惡行腫瘤之一，通常侵襲大腸，通常以腸壁息肉開始[1]，是男性第三大常見癌癥，女性第二常見癌癥。KRAS基因是與人類腫瘤相關(guān)的RAS基因家族的成員。因為RAS蛋白編碼為21 kD[2]，所以，KRAS也被稱為p21基因。目前，已經(jīng)有多個研究表明，在結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因的突變率最高[3]，且在女性、中高分化患者中的突變率更高[4-5]。KRAS的第二號外顯子突變存在于45%的結(jié)直腸癌中，涉及到腫瘤的發(fā)生、增殖和進(jìn)展及預(yù)后[6]。 KRAS的其他外顯子突變、NRAS等突變也占了10%的比例。 臨床研究證實(shí)，不論是西妥昔單抗、帕尼單抗，還是厄洛替尼、吉非替尼，都未能讓RAS突變的腸癌患者從EGFR靶點(diǎn)的靶向治療中受益?；诖耍狙芯糠治鼋Y(jié)直腸癌患者的KRAS基因的突變情況及其潛在突變位點(diǎn)，為結(jié)直腸癌患者診療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2020年7月于桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院確診為結(jié)直腸癌患者89例，其中有26 例KRAS突變陽性患者，將其納入突變組；63 例KRAS突變陰性患者，將其納入未突變組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；②術(shù)前檢查后 1 周內(nèi)接受根治性手術(shù)治療，淋巴清掃至腸系膜血管根部，腸系膜下動脈選擇根部離斷或保留左結(jié)腸動脈分支后離斷，直腸遠(yuǎn)切緣距腫瘤至少2 cm；③腫瘤邊緣≥5 cm行KRAS基因檢測。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有原發(fā)性直腸癌外的其他腹盆腔疾病或相關(guān)血管相關(guān)疾病(如門靜脈高壓、血管狹窄、血栓或發(fā)育變異)；②合并嚴(yán)重糖尿病、高血壓、感染者；合并腎、心、肝、肺等臟器功能嚴(yán)重障礙者及患有其他惡性腫瘤患者；③臨床資料不完整。

本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)后執(zhí)行。

1.2 方法

采用熒光定量PCRTaqman-ARMS探針法測定K-ras基因突變。①總RNA提?。簩rizol裂解組織的混合液收集至滅菌的1.5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min，吸取上清液至另一滅菌的1.5 ml EP管中，并加入200 μl氯仿，蓋緊管蓋，劇烈充分震蕩15～30 s，至乳化充分，無分相現(xiàn)象。室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min，于上清液中加入500 μl異丙醇，并蓋緊管蓋，正反顛倒EP管，混勻。室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min。最后，去除EP管，仔細(xì)觀察管底部是否有微小的白色沉淀，此即總RNA。②用75 %乙醇洗滌RNA，去除上清液，小心沿管壁加入75 %乙醇1 ml/管，輕輕上下翻動EP管，使沉淀從管壁脫落，4 ℃、12 000 r/min、離心5 min，去除上清液，以濾紙吸干管口乙醇，開蓋晾干。加入DEPC水30 μl/管，溶解RNA，用紫外分光光度計測定OD260與OD280，并計算OD260與OD280比值，篩選比值在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗。RNA濃度計算：RNA濃度(μg/μl)=(OD260×40×稀釋倍數(shù))/1 000。③配置RT-PCR反應(yīng)液及瓊脂糖凝膠：首先安裝好制膠架和梳子，然后秤取瓊脂糖1.5 g，用100 ml電泳緩沖液溶解，微波爐中加熱2 min至沸騰，取出后冷卻至50 ℃左右，加入緩沖液，調(diào)節(jié)終濃度為0.5 μg/ml，最后將加入染料的瓊脂糖凝膠傾倒入制膠架內(nèi)，室溫凝固20 min，垂直拔掉梳子，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至水平電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，使液面與凝膠面齊平，梳子孔中充滿電泳緩沖液。將擴(kuò)增產(chǎn)物按照5∶1加入6×上樣緩沖液，混勻，每孔加入5 μl進(jìn)行電泳。電泳儀參數(shù)設(shè)定為80 V、60 min，恒壓電泳，電泳過程中隨時觀察溴酚藍(lán)電泳位置，跑至凝膠邊緣立即停止電泳。④測序反應(yīng)及純化：向新的0.2 ml的EP管中加測序試液1 μl、酶解產(chǎn)物2 μl和引物2 μl 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為96 ℃、1 min循環(huán) 1 次，96 ℃、10 s，50 ℃、5 s，60 ℃、2 min循環(huán) 25 次，25 ℃、1 min循環(huán)1 次。加醋酸鈉-乙醇混合物16 ul(醋酸鈉∶乙醇=1∶15)并劇烈震蕩，避光靜置15 min后4 ℃、12 000 r/min、離心30 min，去除上清液，加預(yù)冷70 %乙醇70 μl，劇烈震蕩，4 ℃、12 000 r/min、離心15 min后去除上清液。顛倒數(shù)次混勻后4 ℃、12 000 r/min、離心5 min后去除上清液。再次加預(yù)冷70 %乙醇70 μl，顛倒數(shù)次混勻后4 ℃、12 000 r/min、離心5 min后去除上清液，室溫放置30 min讓酒精揮發(fā)干凈，加入去離子甲酰胺溶解DNA。⑤PCR儀變性：95 ℃、4 min，4 ℃、4 min。向96孔板內(nèi)移液，每孔加11 μl，避免孔內(nèi)出現(xiàn)氣泡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 突變組與未突變組一般資料均一性檢驗

突變組和未突變組的年齡分別為(57.12±8.40)歲、(58.71±9.02)歲；突變組26例，男12例，女14例；未突變組63例，男31例，女32例；突變組BMI(23.81±2.09 kg/m2)，未突變組BMI(58.71±9.02 kg/m2)；突變組病變部位：結(jié)腸癌18例，直腸癌8例；未突變組病變部位：結(jié)腸癌39例，直腸癌24例。比較突變組與未突變組臨床一般資料無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，資料有較好的可比性，見表1。

表1 一般資料均一性比較

2.2 KRAS基因突變與組織學(xué)類型的相關(guān)性分析

分析KARS基因突變與組織學(xué)類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)突變組腺癌比例(80.77%)顯著高于未突變組腺癌比例(44.44%)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。此外，分析腫瘤分化程度和KARS基因突變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高分化、中分化和低分化的程度和突變與否有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，在突變組中中分化的比例較高，見表3。

表2 兩組不同組織學(xué)類型結(jié)直腸癌組織中KRAS基因突變分析(n，%)

表3 兩組不同分化程度結(jié)直腸癌組織中KRAS基因突變分析(n，%)

3 討論

結(jié)直腸癌是腸道高發(fā)的惡性腫瘤之一，也是繼肺癌之后人類最高發(fā)的癌癥種類[7]，在世界范圍以北美洲及大洋洲地區(qū)多發(fā)，在我國東南沿海地區(qū)常見。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與很多基因相關(guān)，如KRAS基因、RAS基因等。各種基因共同或單獨(dú)作用，影響結(jié)直腸癌的進(jìn)程，如KRAS和PIK3CA雙突變與侵襲性臨床病理特征顯著相關(guān)[8]。CRC患者糞便中BRAF V600E突變及KRAS突變與腫瘤的位置、組織病理及分化程度也有顯著關(guān)系[9]。KRAS蛋白為單聚體G蛋白，其磷酸化可導(dǎo)致PI3K-PDK1-PKB和RAF-MEK-MRK1/2信號通路的激活，一般認(rèn)為KRAS突變是結(jié)直腸癌形成的早期。有研究已證實(shí)，β-catenin和Cyclin D1兩種蛋白在KRAS突變型結(jié)直腸癌樣本中的表達(dá)水平非常高，且抑制β-catenin表達(dá)后KRAS突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖也降低，這促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡[10]。也有研究表明，KRAS基因突變與性別、分化程度有關(guān)，NRAS基因突變與分化程度、腫瘤類型有關(guān)[4]。而結(jié)直腸癌中hMSH2表達(dá)缺失對KRAS基因突變也有一定影響[11]。KRAS基因突變不僅可以為診斷結(jié)直腸癌提供幫助，也會影響EGFR抑制劑在臨床上的作用，用KRAS StripAssay檢測結(jié)直腸癌患者KRAS突變是一種新型的有效方法[12]。

KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者中，約85%～90%的突變集中在第2號外顯子的12、13密碼子上[13]，其余突變中約5%發(fā)生在61密碼子上，5%發(fā)生在146外顯子上[14]。KRAS基因突變與PD-L1表達(dá)有相關(guān)性[15]。研究表明，有28.7%的CRCs存在密碼子12和13的KRAS突變，密碼子12上甘氨酸-天門冬氨酸突變(p.G12D)和密碼子13上甘氨酸-天門冬氨酸突變(p.G13D)是最常見的突變類型[16]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，KRAS基因在結(jié)直腸癌中患者的突變率為20%～50%[5]。也有相關(guān)文獻(xiàn)報告[17]，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌pTNM分期密切相關(guān)。由此可見，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，而KRAS基因突變與很多因素都有直接或間接的關(guān)系[18]。

本研究中，通過篩查結(jié)直腸癌患者，檢測出26例KRAS基因突變，提示KRAS在結(jié)直腸癌發(fā)生和進(jìn)展中的重要性。通過選取的臨床病例統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，腫瘤高、中、低分化程度及pTNM分期與KRAS突變情況有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，也有一些報告與本研究結(jié)果類似[9]。然而通過比對發(fā)現(xiàn)，KRAS突變組腺癌比例顯著高于未突變組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。相較于黏液腺癌，腺癌發(fā)生KARS基因突變的比例更高，說明KARS基因突變的患者更容易出現(xiàn)腺癌而非黏液腺癌。既往有研究證明，在許多結(jié)直腸腺瘤組織中也可以檢測到KRAS基因突變，這說明KRAS基因突變先于腫瘤發(fā)生之前，這也解釋了本研究結(jié)果的科學(xué)性。此外，本研究結(jié)果提示，腫瘤發(fā)生前的KRAS基因突變檢測，能為癌前患者作出風(fēng)險評估，起到提前預(yù)防的效用。

綜上所述，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌組織學(xué)類型和分化程度有一定相關(guān)性。本研究后續(xù)通過隨訪結(jié)直腸癌患者，對KRAS基因可能突變位點(diǎn)與突變率進(jìn)行分析，這將有助于開展臨床個體化精準(zhǔn)治療，提升患者的預(yù)后及生活質(zhì)量[19]。