吳雙雙 孫鳳靈 秦 霞 文香月 張亞敏 徐小妹 盧雪花 李麗莎 林文津 徐榕青

福建省醫(yī)學科學研究院/福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建 福州 350001

澤瀉始載于《神農本草經》，性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效，主要用于高脂血癥、小便不利、泄瀉尿少、水腫脹滿、痰飲眩暈等[1]。澤瀉為常見大宗中藥材，其中產于福建建甌、建陽等地的澤瀉習稱“建澤瀉”。三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降血脂、降血糖、抗癌、抗菌等一系列藥理活性，是澤瀉發(fā)揮藥效的物質基礎[2-5]。澤瀉中三萜類成分的常用測定方法有HPLC等[6-7]，同時檢測多種三萜類成分往往用時較長，影響分析效率。UPLC-MS具有分析時間短、分析效率和分析靈敏度高的特點，尤其在同時測定中藥復雜組分方面具有明顯優(yōu)勢。本文采用UPLC-MS聯(lián)用方法同時測定建澤瀉中澤瀉醇A等8種三萜類成分含量，旨在為建澤瀉品質評價提供更準確、靈敏、簡便、可靠的分析手段。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 建澤瀉植物樣本(采自福建建甌吉陽鎮(zhèn))，液氮凍存，洗凈，60 ℃烘干后磨粉待用。采集樣本經福建省建甌市吉陽鎮(zhèn)農技站呂竹清鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(sam)juzep.的植株。

1.2 儀器 ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Xevo TQS三重四級桿質譜(美國Waters公司)；電子分析天平(AL204，METTLER TOLEDO(上海))；超聲波清洗器(KQ3200B，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG- 9070A，上海精宏實驗設備有限公司)；高速多功能粉碎機(TYSP-100，永康市紅太陽機電有限公司)；艾科浦超純水系統(tǒng)(ABZ1-0501-P，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 試劑 23-乙酰澤瀉醇B(111846-201504)、甘草次酸(110723-201514)購自中國食品藥品鑒定研究院；澤瀉醇A(19885-10-0)、澤瀉醇B(18649-93-9)、澤瀉醇F(155521-45-2)、澤瀉醇G(155521-46-3)、23-乙酰澤瀉醇C(26575-93-9)、24-乙酰澤瀉醇A(18674-16-3)、24-乙酰澤瀉醇F(443683-76-9)購自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色譜純)購自德國 Merck 公司；水為超純水；甲酸為國產分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 采用WatersCORTECSC18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流動相0.1%甲酸水-乙腈，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。梯度洗脫方法為(以乙腈為標準)：1～1.5 min，30%～55%；1.5～5.5 min，55%～75%；5.5～7.5 min，75%～90%；7.5～8.5 min，90%；8.5～8.6 min，90%～30%；8.5～10 min，30%。

2.2 質譜條件 采用電噴霧正離子模式；毛細管電壓3.50 kV；脫溶劑氣流：氮氣800 L/h；脫溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流：氮氣150 L/h；離子源溫度：150 ℃；二級錐孔萃取電壓：3.00 V；碰撞氣體：氬氣。

2.3 溶液制備

2.3.1 混合標準品儲備液制備 精密稱取各標準品適量，置于25 mL容量瓶中，加入色譜純乙腈溶液定容，配置成濃度分別為：澤瀉醇A 490 mg/L、澤瀉醇B 520 mg/L、澤瀉醇F 500 mg/L、澤瀉醇G 500 mg/L、23-乙酰澤瀉醇B 490 mg/L、23-乙酰澤瀉醇C 520 mg/L、24-乙酰澤瀉醇A 510 mg/L、24-乙酰澤瀉醇F 530 mg/L混合標準品儲備液。

2.3.2 內標溶液制備 精密稱取甘草次酸標準品，置于25 mL容量瓶中混勻定容成510 mg/L內標儲備液。

2.3.3 樣品溶液制備 稱取建澤瀉樣品粉末約0.5 g置于50 mL錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重。吸取上清并用0.22 μm的微孔濾膜過濾，將濾液稀釋20倍后與5.1 mg/L的甘草次酸內標溶液1∶1混合得樣品溶液。

2.4 質譜測定方法 本實驗采用正離子多反應監(jiān)測(MRM)定量模式測定各成分含量，8個分析物及內標的具體質譜分析條件見表1，在對應參數下標準品及樣品中的8個待測成分的出峰情況如圖1所示。

表1 8種待測成分及內標的具體質譜分析參數

注：圖中峰對應的化學成分與表1一致圖1 澤瀉醇A等8種成分的標準品(A)及樣品(B)MRM圖

2.5 標準曲線繪制 吸取混合標準品儲備液和內標儲備液各5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙腈定容。分別吸取上述溶液2 μL、100 μL、200 μL、1 mL、2 mL 于10 mL容量瓶中，加乙腈定容，配成5種含內標系列對照品混合溶液，澤瀉醇A濃度分別為0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L，澤瀉醇B濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,澤瀉醇F濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,澤瀉醇G濃度分別為0.01、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L,23-乙酰澤瀉醇B濃度分別為 0.0098、0.49、0.98、4.90、9.80 mg/L,23-乙酰澤瀉醇C濃度分別為0.0104、0.52、1.04、5.20、10.40 mg/L,24-乙酰澤瀉醇A濃度分別為0.0102、0.51、1.02、5.10、10.20 mg/L，24-乙酰澤瀉醇F濃度分別為0.0106、0.53、1.06、5.3、10.6 mg/L。按上述色譜條件、質譜條件及測定方法對含內標系列對照品混合溶液進行測定，并記錄峰面積。以待測成分峰面積與內標物質甘草次酸的峰面積比值(Y)對待測成分濃度(X)作線性回歸，結果如圖2所示，R2均大于0.99。

圖2 澤瀉醇A等8種化學成分線性關系圖

2.6 方法學考察

2.6.1 精密度試驗 精密吸取同一份對照品混合溶液2 μL，在上述色譜質譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值，RSD計算結果見表2，表明精密度良好。

2.6.2 重復性試驗 精密稱取同一批澤瀉樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結果見表2，表明重復性良好。

表2 精密度、重復性及穩(wěn)定性實驗結果 (n=6)

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.3.3”項下方法制備1份澤瀉供試品溶液，分別于0、2、6、10、12和24 h進樣分析，記錄澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F與內標物的峰面積比值并計算含量，RSD計算結果見表2，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.6.4 加樣回收率 精密稱取已知含量的澤瀉樣品6份，每份0.25 g，置于50 mL錐形瓶中，分別精密加入接近等量8種對照品，精密加入乙腈25 mL并稱重，超聲30 min后冷卻至室溫，稱重并用乙腈補足失重，制備供試溶液。按前述方法測定含量并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.7 樣品含量 測定按上述液相及質譜條件對3批澤瀉塊莖樣品進行測定，并根據回歸方程計算8種待測成分的含量，每批測定3次。結果見表4。

表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

續(xù)表4 表4 建澤瀉塊莖中8種三萜類成分的含量

3 討論

三萜類成分是澤瀉的主要成分，具有降脂降糖等多種活性，現行版中國藥典以23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C為含量測定指標。澤瀉多種三萜類成分均為澤瀉發(fā)揮藥效的重要物質基礎，但不同產地、不同采收期、不同部位及不同炮制方法，澤瀉中三萜類成分有較大差異[7-10]。廣澤瀉中澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A的含量顯著高于建澤瀉和川澤瀉，川澤瀉中澤瀉醇B、澤瀉醇C等成分的含量顯著高于建澤瀉[11]。以澤瀉醇A24-乙酸酯峰為參照，HPLC指紋圖譜顯示不同產地澤瀉藥材的質量有差異，所含成分的種類與量不完全一致[12]。不同育苗期、移栽期和采收期對川澤瀉三萜類成分均有顯著影響[13]。清炒、麩炒、鹽炙3種炮制方法對澤瀉中澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量均有不同程度影響[14]。以個別的三萜成分為指標評價澤瀉質量具有較大的局限性，同時采用多個三萜類成分作為指標控制澤瀉藥材質量十分必要。

與HPLC相比，UPLC具有更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內保持柱穩(wěn)定，有利于提高流動相速度，縮短分析時間，提高分析通量。UPLC-MS聯(lián)用在同時測定中藥復雜多組分方面具有獨特優(yōu)勢，并已得到日益廣泛的應用。本實驗建立了同時測定澤瀉中澤瀉醇A、澤瀉醇B、澤瀉醇F、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、24-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇F等8種三萜成分的UPLC-MS方法，簡便快捷，靈敏度高，具有良好的重現性和穩(wěn)定性，結果準確可靠，為澤瀉品質評價及藥材質量控制提供新的分析手段。