張俊強(qiáng)，萬久愷，姚浩宇，范 銳，辛士永

1.鄭州市中心醫(yī)院泌尿外科，鄭州 450007；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，洛陽 471000

近年來，越來越多的研究證明，微小RNA(miRNAs)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。miR-320b已被證明是與多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的miRNA，miR-320b在胰腺癌、肺癌和鼻咽癌等惡性腫瘤組織中均呈低表達(dá)狀態(tài)，能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和惡性轉(zhuǎn)化等過程[4-6]。雄激素受體(androgen receptor，AR)的表達(dá)水平變化在前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程中具有重要意義。張鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AR在前列腺癌的增殖、凋亡及血管新生等過程中具有促進(jìn)作用。雷公藤甲素(triptolide，TPL)是中藥雷公藤的化學(xué)成分，具有多靶點(diǎn)、多途徑抗腫瘤作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)，TPL對前列腺癌具有抑制作用，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究[8]。因此，本研究以miR-320b/AR軸為切入點(diǎn)探究TPL對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用及其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；PCR儀(美國Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)印、垂直電泳儀、電泳儀電源及凝膠成像儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試藥

雷公藤甲素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號XY-F5262B，上海信裕生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Matrixgel基質(zhì)膠(北京索萊寶科技有限公司)；miR-320b NC/mimics、pcDNA 3.1-AR過表達(dá)重組質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒委托廣州銳博生物工程有限公司合成；AR 3′UTR野生型重組質(zhì)粒(pmirGLO-AR-WT)及突變型重組質(zhì)粒(pmirGLO-AR-MUT)委托上海吉生科技有限公司構(gòu)建；轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermo Fisher公司)；熒光素酶檢測試劑盒(美國BioVision公司)；AR、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(美國CST公司)。

1.3 細(xì)胞

Ln Cap、PC-3、DU145人前列腺癌細(xì)胞和RWPE-1人正常前列腺上皮細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 RT-PCR檢測miR-320b和AR mRNA的表達(dá)水平

常規(guī)收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。2-△△CT法計算miR-320b和AR mRNA的相對表達(dá)水平。引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR的引物序列

2.2 細(xì)胞增殖活力檢測

將處于對數(shù)期生長期的PC-3細(xì)胞接種于96孔板(4×103個/孔)，貼壁生長過夜后棄上清，于細(xì)胞中加入含有0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 nmol·L-1TPL的培養(yǎng)基，作為TPL組，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時以加入同體積不含藥培養(yǎng)基的細(xì)胞作為Control組，各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h后加入20 μL MTT置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，丟棄上清后向孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，放入搖床中使結(jié)晶充分溶解，然后于490 nm波長處測定其吸光度(A)并計算細(xì)胞增殖活力。

2.3 RT-PCR檢測TPL對miR-320b和AR表達(dá)水平的影響

將PC-3細(xì)胞分為Control組和TPL組，TPL組細(xì)胞使用48 h增殖活力約為50%的6.25 nmol·L-1TPL處理PC-3細(xì)胞，Control組細(xì)胞不進(jìn)行藥物干預(yù)，培養(yǎng)48 h后按照2.1項(xiàng)下方法檢測miR-320b和AR mRNA的表達(dá)水平。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將PC-3細(xì)胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)孔70%～80%時，對細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b NC/mimics，6 h后棄去原有培養(yǎng)基，加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測

收集處于對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，經(jīng)消化、離心和重懸后計數(shù)，將細(xì)胞分為Control組、TPL組、TPL+miR-320b NC組和TPL+miR-320b mimics組，除Control組采用不含藥的無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞外，其余各組均用6.25 nmol·L-1TPL處理細(xì)胞，加在Transwell上室(密度為2×104個/孔，體積為200 μL)，下室加500 μL完全培養(yǎng)基。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，課題組選擇繼續(xù)培養(yǎng)48 h之后檢測細(xì)胞侵襲能力，與其他時間點(diǎn)比較，藥物處理細(xì)胞48 h時，其侵襲能力發(fā)生顯著變化。取出上室，用甲醇固定20 min，用棉簽擦掉上室殘余細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為10 g·L-1的結(jié)晶紫染液染色15 min后沖洗至無殘留染液，在高倍顯微鏡下選取4個視野計數(shù)細(xì)胞，取平均值。

2.6 細(xì)胞克隆能力檢測

按2.5項(xiàng)下方法對細(xì)胞進(jìn)行分組、處理。細(xì)胞經(jīng)處理后接種入6孔板中(1 000個/孔)，加入完全培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔，根據(jù)細(xì)胞生長情況每3～4 d更換培養(yǎng)基。持續(xù)培養(yǎng)14 d后，用吉姆薩染液對孔中細(xì)胞進(jìn)行染色，用PBS清洗至無染色液殘留后置于鏡下觀察，計數(shù)形成克隆的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)大于10個)。

2.7 蛋白表達(dá)水平檢測

按照2.5項(xiàng)下方法對細(xì)胞進(jìn)行分組和處理。收集處理后的各組細(xì)胞，常規(guī)提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，確定上樣量后電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后將膜放入一抗稀釋液中4 ℃孵育12 h，次日用TBST清洗后將膜轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中，于37 ℃恒溫箱中繼續(xù)反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢后再次洗膜，均勻滴加發(fā)光試劑后置于凝膠成像儀中曝光并采集圖片，用Image J分析目的蛋白灰度值及相對表達(dá)量。

2.8 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-320b與AR的靶向關(guān)系

設(shè)計與miR-320b相結(jié)合的AR 3′-UTR序列及其突變序列，構(gòu)建至雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上。將細(xì)胞接種于24孔板中(5×104個/孔)，當(dāng)細(xì)胞生長融合約80%時，共轉(zhuǎn)染AR-WT/MUT 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-320b和對照miR-NC質(zhì)粒，根據(jù)試劑盒說明書分別對細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性進(jìn)行檢測。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 miR-320b和AR在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

與人RWPE-1正常前列腺上皮細(xì)胞比較，LNCaP、PC-3和DU145前列腺癌細(xì)胞中miR-320b的表達(dá)量顯著降低，AR的表達(dá)量顯著上升(P<0.01)，結(jié)果見表2。選擇miR-320b表達(dá)水平最低而AR表達(dá)水平最高的PC-3細(xì)胞為研究對象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 miR-320b和AR在前列腺癌細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平比較

3.2 TPL對PC-3細(xì)胞增殖活力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的TPL對PC-3細(xì)胞的增殖活力具有抑制作用，其作用呈時間和劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。48 h時，經(jīng)6.25 nmol·L-1TPL作用的PC-3細(xì)胞增殖活力接近50%，結(jié)果見圖1。

圖1 TPL對PC-3細(xì)胞增殖活力的影響

3.3 TPL對PC-3細(xì)胞miR-320b和AR水平的影響

使用6.25 nmol·L-1TPL處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與Control組比較，TPL組細(xì)胞中miR-320b的表達(dá)量上升，AR的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表3。

表3 TPL對PC-3細(xì)胞miR-320b和AR mRNA表達(dá)水平的影響

3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力變化

經(jīng)TPL處理后，PC-3細(xì)胞的侵襲能力降低(P<0.01)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組細(xì)胞侵襲數(shù)量無顯著變化(P>0.05)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics細(xì)胞的增殖能力顯著低于TPL組及TPL+miR-320b NC組(P<0.01)，結(jié)果見表4、圖2。

表4 各組細(xì)胞侵襲數(shù)量的比較

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的結(jié)果

3.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆能力變化

經(jīng)TPL處理后，PC-3細(xì)胞克隆形成數(shù)量減少，克隆能力降低(P<0.01)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組細(xì)胞克隆數(shù)量無顯著變化(P>0.05)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics組細(xì)胞克隆數(shù)量顯著少于TPL組及TPL+miR-320b NC組(P<0.01)，結(jié)果見圖3、表5。

圖3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆能力的結(jié)果

3.6 Western blot檢測AR及EMT轉(zhuǎn)化過程蛋白表達(dá)水平

經(jīng)TPL處理后，PC-3細(xì)胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平降低，E-cadherin的表達(dá)水平升高(P<0.05)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b NC后，TPL+miR-320b NC組PC-3細(xì)胞中AR、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)；向細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b mimics后，TPL+miR-320b mimics組細(xì)胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平低于TPL組及TPL+miR-320b NC組，E-cadherin的表達(dá)水平高于TPL組及TPL+miR-320b NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖4、表6。

表5 各組細(xì)胞克隆數(shù)量的比較

圖4 Western blot檢測AR及EMT轉(zhuǎn)化過程蛋白表達(dá)水平的結(jié)果

3.7 miR-320b對AR的靶向調(diào)控作用

為了證實(shí)miR-320b對AR基因表達(dá)具有調(diào)控作用，本研究在PC-3細(xì)胞中進(jìn)行了熒光素酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-320b+AR-WT組細(xì)胞中熒光素酶的活性(0.39±0.04)顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC+AR-WT組細(xì)胞(1.02±0.08)(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-320b+AR-MUT組細(xì)胞中熒光素酶活性(1.04±0.09)與轉(zhuǎn)染miR-NC+AR-MUT組(1.12±0.09)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表6 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一[9-10]，約占全球新診斷出癌癥病例的25%[11-12]。盡管前列腺癌患者的早期檢查和治療方法已有很大改進(jìn)，但該病仍是癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因，且前列腺癌的轉(zhuǎn)移率較高，約80%的晚期患者被診斷出發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移[13]。因此，探究新的治療靶標(biāo)在前列腺癌的臨床治療中具有重要意義。miR-320b是近年來被證明與惡性腫瘤相關(guān)的miRNA，在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)[14]。本研究檢測了miR-320b在LNCaP、PC-3、DU145前列腺癌細(xì)胞和RWPE-1人正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-320b在LNCaP、PC-3和DU145等前列腺癌細(xì)胞中均呈低表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)水平顯著低于正常前列腺上皮細(xì)胞，其中PC-3細(xì)胞miR-320b的表達(dá)水平最低，提示miR-320b的低表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。AR是前列腺癌發(fā)生的一個驅(qū)動因素，也是前列腺癌的常見治療靶標(biāo)，多數(shù)前列腺癌患者AR的表達(dá)水平異常升高[15]。本研究的結(jié)果顯示，AR在LNCaP、PC-3和DU145等前列腺癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)狀態(tài)，PC-3細(xì)胞AR的表達(dá)水平最高。本研究選擇miR-320b表達(dá)水平最低而AR表達(dá)水平最高的PC-3細(xì)胞為研究對象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

TPL是中藥雷公藤的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎及調(diào)節(jié)免疫等作用，其抗腫瘤作用具有高效、廣譜的特點(diǎn)[16-17]。研究表明，TPL不僅對前列腺癌細(xì)胞有抑制作用，其對前列腺癌裸鼠移植瘤也具有較好的治療作用，且其制劑安全性良好，效果顯著[18-19]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的TPL對PC-3細(xì)胞的增殖活力具有抑制作用，其作用呈時間和劑量依賴性，連續(xù)處理48 h后，6.25 nmol·L-1TPL對PC-3細(xì)胞的抑制率接近50%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TPL可上調(diào)細(xì)胞中miR-320b的表達(dá)量，降低AR的表達(dá)量，并可抑制PC-3細(xì)胞的侵襲和克隆能力。EMT已被證明是大多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去上皮表型，獲得較強(qiáng)的侵襲和遷移能力，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞表面蛋白E-cadherin的表達(dá)下調(diào)和間充質(zhì)表達(dá)蛋白N-cadherin和波形蛋白vimentin等的表達(dá)上調(diào)[20-21]。在本研究中，TPL可下調(diào)PC-3細(xì)胞中N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，表明TPL可抑制PC-3細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化過程。

為了探究TPL對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用是否與miR-320b和AR的表達(dá)變化有關(guān)，在TPL處理的基礎(chǔ)上向PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-320b NC/mimics，結(jié)果顯示，miR-320b mimics可顯著增強(qiáng)TPL對PC-3細(xì)胞侵襲和克隆能力的抑制作用，并進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞中AR、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平。同時，雙熒光素酶靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-320b與AR的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-320b只能抑制野生型AR-WT PC-3細(xì)胞中熒光素酶的活性，而對突變型AR-MUT PC-3細(xì)胞中熒光素酶的活性無影響，表明AR是miR-320b的潛在靶基因，miR-320b對AR基因的表達(dá)存在顯著的調(diào)控作用，提示TPL對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)活動的調(diào)控作用可能是通過miR-320b/AR軸實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-320b和AR在前列腺癌細(xì)胞中分別呈低表達(dá)和高表達(dá)狀態(tài)，TPL可上調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC-3 miR-320b的表達(dá)水平，下調(diào)AR的表達(dá)水平，并抑制細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT轉(zhuǎn)化等惡性生物學(xué)行為，miR-320b可增強(qiáng)TPL的抗腫瘤作用，TPL的作用可能是通過miR-320b/AR軸實(shí)現(xiàn)的。